本申请要求于2015年9月22日提交的名称为“来自全血的细胞的无离心机分离和检测的方法(methodforcentrifuge-freeisolationanddetectionofcellsfromwholeblood)”的美国临时专利申请第62/222,193号的权益，将其通过引用整体并入本文。
本申请涉及分离生物流体样品中的目标颗粒(如细胞)的方法。
背景技术：
存在于流体样品(如体液，例如全血)中的目标实体(如细胞)的分离、检测和/或捕获是非常重要的，因为捕获的细胞可能是病理状况或疾病的指征。可以列举细胞与疾病状态的相关性，对细胞进行遗传分析或培养并用于测试药物组合或发现新药物。特别地，体液如血液中稀有细胞的分离和检测是尤其重要的，但由于流体样品中此类稀有细胞的数量非常低，所以它们的分离和检测很难。
患者血液中的循环肿瘤细胞(或ctc)以及母体血液中的胎儿细胞(包括胎儿有核红细胞、胎儿白细胞和胎儿滋养层细胞)是此类稀有细胞的实例。大多数癌症相关的死亡是由于肿瘤细胞转移到可能远离原发性肿瘤的各种其它组织和器官结构。ctc可以从原发性和转移性肿瘤脱离并进入血管系统。ctc的早期检测可以在提高存活率中发挥重要作用。
ctc的检测可以进一步用于确定治疗例如化疗、放射、手术等的功效。在此类治疗之后存在ctc可指示癌症的复发。ctc和其它稀有细胞可指示稀有事件，并且掌握大量未解的生物学和医学问题的关键。在检测和记数之后，也可以对稀有细胞进行进一步的下游测试和分析。例如，可以将它们引入(例如，通过移植)到动物中以研究转移模型以及对它们进行测序以查询可以揭示突变的基因组和转录组并定量基因表达。此外，有可能培养ctc、使ctc生长，以及用于理解转移生物学以及药物测试，为个性化医疗铺平道路。
用于ctc和其它稀有细胞以及甚至其它通常不被认为是稀有的细胞的传统提取技术通常包括，基于与全血中的每种成分相关的质量，使用离心或其它消减技术，将红细胞(rbc)与其它类似大小的细胞如白细胞(wbc)和ctc分开，以及将血浆分成不同的层。此类技术通常假定血浆大部分没有细胞，因此去除血浆以防止非特异性结合。通常使用抽吸器施加负压以从已离心的样品容器吸出血浆来去除血浆。
由于ctc和其它稀有细胞的浓度通常低至1个细胞/毫升全血，所以在小体积的全血中检测所述ctc和其它稀有细胞通常具有挑战性。因此，使用离心去除血浆的提取方案通常需要大量的全血以捕获和提取足够数量的待分析和/或收获的ctc。对ctc细胞的可靠分析通常需要从样品中提取几百个ctc，所述样品包括几乎数以千万的wbc和数亿个rbcs。因此，使用较小的样品量通常难以检测和量化ctc。
包括离心(和其它消减技术)的样品处理通常会在检测和收集全血中的ctc和其它稀有细胞中引起另外的并发症，因为ctc可能无意中保留在与离心样品体积的其它细胞组分接触的血浆的底部区域。例如，在抽吸血浆时，可能会丢失ctc，在离心完成后，降低ctc的整体捕获效率。然而，对于体液中浓度较高的其它类型的细胞，通常不是这种情况。因此，当利用消减技术分离细胞组分时，从较小样品体积的全血中高产量地连续提取ctc和其它稀有细胞通常难以实现。
发明概述
在本文所述的新的添加性的流体样品处理方法的一些实施方式中，用替代手段取代消减样品处理的技术可以掺入到目标实体(如细胞，例如稀有细胞)的磁性标记和分离中，以改善从小样品体积捕获目标实体(例如，ctc和其它细胞)的效率，而不显著影响靶向效率。在一个实例中，包含细胞和/或稀有细胞的新鲜样品体积可以与稀释剂组合，以在引入缀合的磁珠之前降低样品的粘度。在此实例中，样品体积的粘度降低可以用于减少缀合的磁珠的非特异性结合而无需离心步骤。在另一实例中，可以首先引入缀合的磁珠，随后与稀释剂组合。在该实例中，粘度的降低可以用于降低与用于捕获稀有细胞的检测表面的非特异性相互作用。与使用传统的消减技术相比，在这两个新的添加性的样品处理方法的实例中，来自样品体积的提取的目标实体(如细胞，例如稀有细胞)的总数可以显著增加，因为可能包括稀有细胞的样品部分在检测和提取之前的样品制备过程中不会被去除。
本文所述的添加性的样品处理技术的其它优势包括消除使用其它设备的需要，以及减少细胞分析所需的总体时间。例如，传统的基于离心的检测方案通常需要90至100分钟来进行7.5ml流体样品的样品制备(在离心和抽吸之后去除1.5ml至2ml流体样品)，随后在流体外壳(fluidicenclosure)上调用捕获。相比之下，添加性的技术能够使用较小的样品体积在60至70分钟内进行细胞检测。此外，由于添加性的样品处理技术不会去除任何体积的最初流体样品，所以与使用基于离心的检测方案获得的检测结果相比，可以以更高水平的纯度获得检测结果(即，较低水平的缀合磁珠的抗体与不需要的细胞之间的非特异性结合)。
在一个总体方面，本公开内容包括用于分离流体样品中的目标实体(例如，细胞，如稀有细胞)的添加性的直接稀释方法。该方法可以包括以下述顺序进行的下述步骤：向流体样品中加入所述流体样品的体积的至少0.5倍体积的稀释剂以产生第一混合物，其中所述稀释剂的体积足以获得低于所述流体样品的粘度的特定粘度的第一混合物；向所述第一混合物中加入大量缀合有结合部分的磁珠以产生第二混合物，其中所述缀合有结合部分的磁珠中的结合部分能够特异性结合所述目标实体(如稀有目标实体)上表达的一种或多种配体，并且其中加入到所述第一混合物中的缀合有结合部分的磁珠的数量足以使所述目标实体磁化；将所述第二混合物孵育一段时间，所述时间为至少5分钟至120分钟，并且足以使所述缀合有结合部分的磁珠结合所述第二混合物中的目标实体，其中所述第二混合物的粘度基本上与所述第一混合物的特定粘度相同，并且其中所述第二混合物的粘度足够低以抑制所述缀合有结合部分的磁珠与所述流体样品中的非目标实体的非特异性结合；使用大于1.0ml/分钟的流速使所述第二混合物的一部分流入流体室；以及施加磁力以将所述第二混合物中的磁化目标实体吸引到所述流体室内的分离表面，从而以添加性的方法分离目标实体而不用去除最初流体样品的任何部分。
在另一总体方面，本公开内容包括用于分离流体样品中的目标实体(如稀有目标实体)的添加性的直接孵育法。所述方法可以包括以下述顺序进行的下述步骤：向所述流体样品中加入大量缀合有结合部分的磁珠以产生第一混合物，其中所述缀合有结合部分的磁珠中的结合部分能够特异性结合所述目标实体上表达的一种或多种配体，并且其中加入到所述流体样品中的缀合有结合部分的磁珠的数量足以使所述目标实体磁化；将所述第一混合物孵育一段时间，所述时间为至少5分钟至120分钟，并且足以使所述缀合有结合部分的磁珠结合所述第一混合物中的目标实体；向孵育的第一混合物中加入所述流体样品的体积的至少0.5倍体积的稀释剂以产生第二混合物，其中所述稀释剂的体积足以获得低于所述第一混合物的粘度的特定粘度的所述第二混合物；使用大于1.0ml/分钟的流速使所述第二混合物的一部分流入流体室；以及施加磁力以将所述第二混合物中的磁化目标实体吸引到所述流体室内的分离表面，其中所述第二混合物的粘度足够低以抑制所述流体样品中的非目标实体与所述分离表面的非特异性相互作用，从而在添加性的方法中分离目标实体而不用去除最初流体样品的任何部分。
其它形式包括配置以执行方法的动作的相应系统和装置。本文所述的方法的一个或多个实施方式可以包括下述可选特征。例如，在一些实施方式中，结合部分为一种或多种不同的抗体，并且配体为抗体特异性结合的一种或多种抗原。目标实体可以是细胞，例如t细胞、b细胞、白细胞或白血细胞的子集，或者它们可以是稀有细胞，例如ctc或存在于母体血液中的胎儿血细胞。目标实体也可以是细菌、寄生虫、单细胞有机体或者可以被特异性结合部分所结合的特异性蛋白或其它化合物和组合物。
在一些实施方式中，直接稀释方法和/或直接孵育方法包括在将第二混合物注入流体室之后，使洗涤溶液流入流体室。
在一些实施方案中，直接稀释方法和/或直接孵育方法包括在使洗涤溶液流入流体室之后，使缓冲溶液流入流体室。
在一些实施方式中，直接稀释方法和/或直接孵育方法包括在将第二混合物注入流体室之前，钝化流体室的检测或分离表面。
在一些实施方式中，流体样品包括血液样品，例如全血样品，目标实体为除了红细胞以外的细胞，并且所述方法还包括使用至少1.0ml/分钟的流速使红血细胞裂解缓冲液流过流体室以从分离表面去除红细胞。
在一些实施方式中，红细胞裂解缓冲液以1至10分钟的时间流过流体室。
在本文所述方法的一些实施方案中，稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水溶液，并且稀释剂具有稀释剂体积比流体样品体积为1:1至1:4的稀释比例。
在一些实施方式中，缀合有结合部分的磁珠的直径为10纳米至50微米。
在一些实施方式中，缀合有结合部分的磁珠与epcam抗体缀合。
如本文所述，“稀有目标实体”是指这样的目标实体，例如每毫米流体样品具有最大浓度为1,000个或更少个细胞的细胞。目标实体可以是这样的细胞(例如，循环肿瘤细胞、母体细胞中的胎儿红细胞)，其浓度低于流体样品例如全血(例如红细胞、白细胞、血小板)中其它类型的细胞。可以使用不同的技术使稀有目标实体磁化，例如，使用缀合有特异性结合部分(如抗体)的磁珠，所述特异性结合部分对稀有目标实体表面上表达的抗原是特异性的。在一些实施方式中，目标实体不是本文所定义的“稀有的”，并且可以包括从液体样品中待分离、待检测和/或待捕获的t细胞、b细胞、白细胞、白细胞的子集、细菌以及其它化合物或组合物。
如本文所述，“添加性的”技术或方法是指在进行细胞提取和检测程序之前不去除最初样品的任何部分的液体或流体样品处理技术。添加性的技术不包括诸如离心、过滤或提取的技术，其中在分析之前减少最初样品的体积。添加性的技术的一个实例为向样品体积中加入稀释剂以产生稀释的混合物。添加性的技术的另一实例为将缀合有结合部分的磁珠加入到流体样品中。
如本文所用，术语“特异性结合”意指结合部分(如抗体)以比其将结合流体样品中任何其它非配体显著大的程度与相应配体(如抗原)结合。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的方法和材料类似或等同的那些方法和材料，但是下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。如发生矛盾，则本专利说明书，包括定义，将占据主导地位。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而并非旨在进行限制。
在附图和下文的描述中示出了一个或多个实施方式的细节。其它潜在的特征和优势将从说明书、附图和权利要求中而变得显而易见。
出于促进理解本公开内容的原理的目的，现将附图中示出的实施方案和实施方式作为参考并使用特定语言对其进行描述。然而，应理解，从而不意图限制本公开内容的范围。
附图简述
图1a为说明细胞提取系统的实例的框图。
图1b为细胞提取系统的另一实例的示意图。
图2a为说明直接稀释方案的实例的流程图。
图2b为说明直接孵育方案的实例的流程图。
在附图中，相同的参考编号始终代表相应的部件。
发明详述
本文所述的新的添加性的样品处理方法包括这样的技术，其用磁性标记和分离目标抗原如细胞或稀有细胞的替代手段来取代消减样品处理步骤，以改善从相对小的样品体积中分离、检测和/或捕获目标抗原的效率，而不显著影响靶向效率。在所谓的“直接稀释”方法的一个实例中，将包含稀有细胞的新鲜样品体积加入到稀释剂中以在引入缀合的磁珠之前降低样品的粘度。在该方法中，样品体积的粘度降低用于减少缀合的磁珠的非特异性结合，而不需要离心步骤。在所谓的“直接培养”方法的一个实例中，首先将缀合的磁珠加入到流体样品中并与流体样品一起孵育，随后加入稀释剂。在该实例中，粘度的降低用于减少与用于捕获目标实体(如稀有细胞)的分离表面的非特异性相互作用。与使用传统的消减技术相比，在这两种添加性的处理方法中，可以增加来自样品体积的提取的稀有细胞的总数，因为可能包括稀有细胞的样品部分在检测和提取之前的样品制备过程中不会被去除。
如本文所述，“直接稀释方法”是指使用添加性的技术来分离和捕获流体样品中的稀有目标实体而不去除最初流体样品部分。例如，在直接稀释方法期间，首先将一定体积的稀释剂加入到流体样品中以产生具有设定为特定粘度水平的降低粘度的混合物。然后将缀合有结合部分的磁珠加入到混合物中以磁性标记感兴趣的稀有细胞。然后将含有流体样品和缀合的磁珠的混合物孵育特定时段，以允许磁珠的抗体与感兴趣的稀有细胞的表面上表达的特异性抗原结合。然后混合物可以流入流体室，例如微流体室中。然后，例如使用放置在微流体室下方的磁体施加磁力以捕获微流体室内的磁性标记的稀有目标实体。
如本文所述，“直接孵育方法”是指直接稀释方案的替代技术，其中在向最初流体样品加入稀释剂之前，将缀合有结合部分的磁珠加入到流体样品中。首先将含有流体样品和缀合的磁珠的混合物孵育特定时段，以允许磁珠上的抗体与感兴趣的稀有细胞的表面上表达的特异性抗原结合。然后将一定体积的稀释剂加入到混合物中以产生具有设定为特定粘度水平的降低粘度的稀释混合物。然后将混合物注入流体室，例如微流体室中。然后使用放置在微流体室下方的磁体施加磁力以捕获微流体室内的磁性标记的稀有细胞。
图1a为基本的细胞提取系统100a的框图。系统100a包括样品容器110，其储存使用下文更详细描述的直接稀释方法或直接孵育方法产生的混合物。该混合物包括流体样品、稀释剂和与配体结合部分(如抗体)缀合的磁珠。流体样品包括基于缀合磁珠上的抗体与在稀有目标实体的表面上表达的抗原的特异性结合而被磁化的稀有目标实体。混合物流过流体外壳120以捕获使用由磁体140提供的磁力磁化的稀有目标实体，以将磁化的目标实体吸引到流体外壳120的分离表面上。使用蠕动泵130使混合物内的流体流过流体外壳120。离开流体外壳120的混合物可以在废物容器150中被处理，或被再循环回样品容器110。在一些实施方式中，再循环回样品容器110的混合物部分可以再次流过流体外壳120，以便将混合物在最初流过时先前未在流体外壳120内被捕获的残余目标实体捕获。
图1b为示出细胞提取系统100b的另一实例的示意图。系统100b包括容纳流体样品101的样品容器110、包括流体室120a的流体外壳120、蠕动泵130、放置在流体外壳120下方的磁体部件140和废物容器150。流体外壳120可以连接到蠕动泵130或用于通过流体回路输送流体的另一装置或装置。也可以使用阀系统或多个阀，使得泵130可以将流体引导到废物容器150或返回样品管110以通过流体系统再循环。本发明的方法也可以用于诸如美国专利申请第12/601,986号、第14/001,963号和第14/037,478号中描述的那些系统中，将其内容全部通过引用整体并入本文。
流体外壳120包括主体122和128，其限定流体通道，在该流体通道中，样品从连接到管110的入口流动至连接到泵130的出口。下主体128包括与流体样品101中的磁化稀有目标实体102相互作用的分离表面124。如下文更详细描述，磁化稀有目标实体102与分离表面124之间的相互作用允许分离和捕获稀有目标实体。
流体外壳120的下主体128可以是固体表面(例如载玻片或包括硅、二氧化硅、氮化硅、玻璃、pdms、su-8或塑料的其它材料)。流体外壳120可以任选地由以下组成：与主体122和124接触的pdms间隔件，表面124下方的另一pdms/透明薄膜片以及容纳入口和出口管的玻璃盖玻片，以及使组件结合在一起的外壳体，其可以在底部包括另一个载玻片。分离表面124可以具有范围为100μm2到50cm2(例如，500μm2、1cm2、5.0cm2、10cm2或20cm2)的表面积，最小有效尺寸(宽度、长度、直径或厚度)为10μm。
磁体组件140可以用于在流体外壳120(其体积范围可以从1mm3到10,000mm3)内产生从流体外壳120的内部或外部的磁场(磁通密度范围为0.01特斯拉到100特斯拉，例如1.0、10、25、50、75或100特斯拉)，以使得通过将磁珠和结合到磁珠的实体(例如，磁化的稀有目标实体102)向流体外壳120内部的分离表面124吸引来捕获所述磁珠和结合到磁珠的实体。这可以通过以下来实现：将一个或多个永久或电磁体插入/连接到外壳120的下主体128，或通过并入由磁性、顺磁性或超顺磁性材料制成的磁体模式以及电子电路来产生磁场。
稀有目标实体102(或“稀有细胞”)可以包括流体样品101内的ctc，并且可以使用抗体-抗原结合，基于使用缀合有结合部分的磁珠以磁性标记稀有目标实体102来进行分离和检测。例如，稀有目标实体102可以与用识别特异性表面抗原的抗体功能化的磁珠结合。一旦稀有目标实体102已经被磁性标记，则可以将流体样品101注入到流体外壳120中，并且流过容纳分离表面124的流体室120a。然后可以通过如上所述的由磁体140提供的磁力，将连接到磁性粒子的稀有目标实体102带到分离表面128。美国申请s/n12/601,986(savran等人的美国公开申请2010/0330702)中公开了一种示例性系统。在一些实施方式中，目标实体102不是本文所定义的“稀有的”，并且可以包括例如t细胞、b细胞、白细胞或白细胞的子集。
在引入流体样品101之前，首先用缓冲液(例如在磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液(10mg/ml)中的1％牛血清白蛋白(bsa))填充室120a，并且在室温(rt)或4℃孵育至少约5分钟，例如15、30、45或60分钟，至多90或120分钟或更长时间以使室120a和伴随的分离表面124钝化，用于减少来自不是稀有目标实体102的细胞、珠粒和其它实体的非特异性结合。在一些情况下，还可以使用除了pbs溶液之外的其它缓冲溶液，例如tris缓冲盐水(tbs)。bsa的浓度可以为0至10％(100mg/ml)或更严格地为0.1％(1mg/ml)至5％(50mg/ml)。在引入流体样品101以去除过量的bsa之前，用缓冲溶液洗涤钝化的室120a。在一个实施方式中，可以用bsa以外的试剂如聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚丙烯酸马来酸、十六烷酸或各种形式的两性离子材料来实现表面封闭。可选地，也可以使用洗涤剂如吐温(尤其是吐温-20)和triton(尤其是tritonx-100)来阻断表面并帮助减少非特异性结合。
图2a为说明用于分离流体样品中的稀有目标实体的直接稀释方法200a的实例的流程图。简言之，方法200a包括加入流体样品的体积的至少0.5倍体积的稀释剂以产生第一混合物(210)，向第一混合物中加入大量缀合有结合部分的磁珠以产生第二混合物(220)，将第二混合物孵育一段时间，该时间为至少5分钟至120分钟，并且足以使缀合有结合部分的磁珠结合第二混合物中的稀有目标实体(230)，使用大于1.0ml/分钟的流速使第二混合物的一部分流入微流体室(240)，并且施加磁力以吸引第二混合物中的磁化稀有目标实体(250)。
如上文所述，直接稀释方法200a是指添加性的样品处理技术，其中在将流体样品101与缀合有抗体的磁珠一起孵育之前，首先稀释流体样品101。流体样品101包括稀有目标实体102，其包括ctc作为实例。可以进行直接稀释方法200a以去除需要进行离心来处理全血以实现缀合至磁珠的抗体与稀有目标实体102的表面上表达的目标抗原之间的特异性结合。
更详细地，方法200a包括加入流体样品的体积的至少0.5倍体积的稀释剂以产生第一混合物(210)。首先用pbs溶液以1:1的稀释比例稀释流体样品101(例如，获自受试者(例如含有ctc的癌症患者)的全血；或来自健康供体，然后掺入培养的细胞系)以产生第一流体混合物。在一些情况下，稀释比例可以为1:0.1至1:10(流体：pbs)或更严格地为1:0.5至1:4(流体：pbs)。在一些实施方式中，pbs可以替换为其它缓冲液或溶液或者与其它缓冲液或溶液组合，以及rbc溶解缓冲溶液可替代地用于稀释流体样品101。
稀释降低流体混合物相对于全血的粘度和总体密度，使得如果流体混合物暴露于固体表面(即流体外壳120内的分离表面124)，则减少大量紧邻分离表面124的实体。因此，稀释混合物内诸如细胞和分子的微粒物质彼此相遇的可能性降低。因此，实体的非特异性结合以及流体混合物流过流体室120a时的流体阻力也降低。
在一些实施方式中，流体样品101可以是不同于全血的流体。例如，可以分析其它类型的含有细胞的体液，如腹水、胸膜液、粘液、唾液或尿来代替血液。在此类实施方式中，即使稀释也增加了需要处理的总体积，但流体外壳120可以使用技术来提供高体积通过量以适应如此大的样品体积(1ml至1l)。
方法200a包括向第一混合物中加入大量缀合有结合部分的磁珠以产生第二混合物(220)。结合部分可以是针对在稀有目标实体102上过表达的目标抗原(例如，上皮细胞粘附分子(epcam)和表皮生长因子受体(egfr))的抗体，并且它们首先与磁珠缀合。所使用的磁珠的直径可以从10nm变化到50μm或更严格地从100nm变化到5μm。抗体可以通过生物素和链霉亲和素相互作用而与磁珠缀合，但它们也可以通过其它共价相互作用如基于胺的缀合或非共价相互作用来结合。也可以使用其它标准缀合技术。然后将缀合有抗体的磁珠加入到步骤210中产生的稀释的流体样品中。
在一个实施方式中，用pbs溶液中过量的生物素化抗体(10μl,0.2mg/ml)使20μl链霉亲和素缀合的超顺磁珠(10mg/ml)饱和，并在室温(rt:20℃至25℃)孵育1小时，随后用pbs溶液在磁力架上冲洗3次并重新悬浮于pbs中。根据使用的磁珠的数量和磁珠的结合能力以及分析的流体样品101，链霉亲和素磁珠(10mg/ml)与生物素化抗体(0.2mg/ml)的体积比例可以为10：1至1:10，并且孵育期可以为5分钟至2小时。在孵育期间，可以将含有缀合有抗体的磁珠和稀释的流体样品的流体放置在通过摇动、旋转、振动或搅拌混合物或者这些技术中的一些或全部的组合来增强混合的装置上。
方法200a包括孵育第二混合物一段时间，该时间为至少5分钟至120分钟，并且足以使缀合有结合部分的磁珠结合第二混合物中的稀有目标实体(230)。在稀释之后，将含有缀合有抗体的磁珠和稀释的流体样品的流体混合物在室温孵育5分钟至5小时，或者更通常地15分钟至1小时。与抗epcam缀合的磁珠(抗epcam珠粒)为最常用的抗体珠粒(ab-珠粒)，尽管也可以使用不同的抗体，这包括针对表皮生长因子(egfr)、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性膜抗原(psma)、叶酸受体(fr)、前列腺特异性抗原(psa)和波形蛋白的抗体。还可以将缀合有抗体的磁珠与稀释的流体样品混合物，连同与其它种类的缀合有抗体的磁珠(例如，ab-珠粒混合物)一起孵育或与其组合孵育。所使用的ab-珠粒的总量取决于样品混合物的总体积，其范围可以为每ml稀释血液中0.1μl(1μg)至10μl(100μg)，或更严格地每ml稀释血液中1μl(10μg)至4μl(40μg)。在孵育期间，可以将流体混合物放置在通过摇动、旋转、振动或搅拌样品101或者这些技术中的一些或全部的组合来增强混合的装置上。在一个实施方式中，可以用其它分子如适配子、肽、蛋白、小分子、dna或rna替代抗体。
方法200a包括使用大于1.0ml/分钟的流速使第二混合物的一部分流入微流体室(240)。在孵育之后，将含有ab-珠粒和稀释的流体混合物的混合物引入流体外壳120中以能够检测稀有目标实体102(例如ctc)。将混合物注入流体室120a，并且以一定的流速从流体室120a的入口流到流体室120a的出口。
方法200a包括施加磁力以吸引第二混合物中的磁化稀有目标实体(250)。磁体组件140通常位于流体外壳120的下方或流体外壳120的外部罩内的室120a的下方。校准磁体组件140以施加这样的磁力：其足以将磁化稀有目标实体102向分离表面124拉动，并且当流体从入口到出口流过微流体室120时(例如，在清洗步骤期间)将磁化稀有目标实体102保留在表面124上的位置处。作为实例，磁体130为具有分别为0.4t和100t/m的测量表面磁通密度和梯度的ndfeb立方体磁体(约5x5x5mm)。在其它实例中，也可以使用其它磁体，包括但不限于由各种材料制成的更大或更小的永磁体以及市售或使用标准或微制造程序制备并且能够产生随时间变化的磁场的电磁体。
在细胞捕获过程结束时，在操作流速下用1ml至10ml的pbs溶液(或更严格地，用2ml至5ml的pbs溶液)洗涤室120a，随后通过引入rbc裂解缓冲液并孵育达5分钟以去除留在室120a中的rbc。在一个实施方式中，使用0.01ml/min至20ml/min的流速，使rbc裂解缓冲液循环通过流体外壳120。然后用1ml至10ml(或更严格地，用2ml)的pbs溶液洗涤室120a并进行免疫荧光分析。
在一些实施方式中，离开流体室120的流体混合物的一部分绕过废物容器150，并例如使用蠕动泵130、重力或一些其它泵再循环回样品容器110中。在某些实施方式中，最佳流速可以是2ml/min。然而，操作流速可以为0.01ml/分钟至20ml/分钟，例如0.05、0.1、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5或20.0ml/分钟。循环时间取决于样品混合物的总体积，并且范围可以为5秒至长达15分钟，例如10秒、20秒或60秒，或者2分钟、5分钟、7分钟、10分钟、12分钟或15分钟。因此，流过流体室120a的混合物可以多次再循环以捕获通过循环前最初没有被捕获的任何残余目标实体102。可选地，混合物也可以通过流体外壳一次，而无任何再循环。
在一个实施方式中，可以分析在分离表面上捕获的磁化稀有目标实体102。首先使用pbs中的4％多聚甲醛(pfa)溶液，将磁化稀有目标实体102固定10分钟至15分钟，然后使用pbs中的0.1至0.2％的tritonx-100溶液透化10分钟，同时微芯片处于流体室120a中。随后引入与荧光染料缀合的抗体以标记已经捕获在分离表面124上的磁化目标实体102。在一个实施方式中，将与fitc缀合的抗细胞角蛋白单克隆抗体(抗-ck-fitc)、与藻红蛋白缀合的抗cd45单克隆抗体(排除wbc)(抗-cd45-pe)以及验证有核细胞的4,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)同时引入室120a中，并在室温孵育15min以标记细胞。为了保持捕获的磁化目标实体102的活力，可以在荧光染色之前任选地进行固定和透化步骤。然而，如果不使用固定，则荧光染色时间通常需要延长至长达30分钟。
然后，可以对在分离表面124上捕获的磁化目标实体102在仍然处于室120a时进行荧光显微镜检查以用于鉴定和记数。如果磁化目标实体102为肿瘤细胞，则基于包括细胞的大小(10-30μm)和形状(接近圆形)在内的因素的组合以及荧光发射(ck+、dapi+和cd45-)对其进行鉴别。不符合此描述的实体可能非特异性地结合珠和/或芯片表面，因此不评分为肿瘤细胞。可以使用其它技术来对细胞内或表面上的其它标志物进行染色或识别，该技术可以不涉及使用荧光。
图2b为说明用于分离流体样品中的稀有目标实体的直接孵育方法200b的实例的流程图。简言之，方法200b包括向流体样品中加入大量缀合有结合部分的磁珠以产生第一混合物(212)，将第一混合物孵育一段时间，该时间为至少5分钟至120分钟，并且足以使缀合有结合部分的磁珠与第一混合物中的稀有目标实体结合(222)，将流体样品的体积的至少约0.5倍体积的稀释剂加入到孵育的第一混合物中以产生第二混合物(232)，使第二混合物的一部分流入微流体室(242)，以及施加磁力以吸引第二混合物中的磁化稀有目标实体(252)。
如上文所述，直接孵育方法200b是指添加性的样品处理技术，其中在将流体样品101与缀合有抗体的磁珠一起孵育之后，将流体样品101稀释。与直接稀释方法200a类似，可以进行直接孵育方法200b以去除需要进行离心来处理全血以实现缀合至磁珠的抗体与稀有目标实体102的表面上表达的目标抗原之间的特异性结合。
更详细地，方法200b包括向流体样品中加入大量缀合有结合部分的磁珠以产生第一混合物(212)。首先将ab-珠粒引入流体样品101中以产生混合物，在该混合物中，与磁珠缀合的抗体特异性结合在稀有目标实体102的表面上表达的抗原。例如，以与上文关于步骤220所述的技术类似的方式，将ab-珠粒直接加入到流体样品101中。所使用的ab-珠粒的总量可以为每ml血液中0.1μl(1μg)至10μl(100μg)或更严格地，每ml血液中0.5μl(5μg)至4μl(40μg)。
方法200b包括将第一混合物孵育一段时间，该时间为至少5分钟至120分钟，并且足以使缀合有结合部分的磁珠与第一混合物中的稀有目标实体结合(222)。含有ab-珠粒和流体样品101的混合物可以以与上文关于步骤230所述的技术类似的方式孵育5分钟至2小时，这取决于分析的样品体积和使用的ab-珠粒的量。
方法200b包括将流体样品的体积的至少约0.5倍体积的稀释剂加入到孵育的第一混合物中以产生第二混合物(232)。以与上文关于步骤210所述的技术类似的方式，将含有ab-珠粒和流体样品101的孵育混合物用缓冲溶液(如pbs溶液)以1:1的比例稀释。稀释比例可以为1:0.1至1:10(混合物：pbs)或更严格地，1:0.5至1:4(混合物：pbs)。
方法200b包括使用大于1.0ml/分钟的流速使第二混合物的一部分流入微流体室(242)。以与上文关于步骤240所述的技术类似的方式，将含有ab-珠粒、流体样品101和稀释剂的稀释混合物注入微流体室120a中。
方法200b包括施加磁力以吸引第二混合物中的磁化稀有目标实体(252)。以与上文关于步骤250所述的技术类似的方式，磁体140可以用于施加足以将稀释的混合物中的磁化稀有目标实体102吸引到分离表面124的磁力。
实施例
下述实施例不限制本文所述的新的添加性的处理方法。
进行实验以评价使用上文所述的直接稀释方法200a和直接孵育方法200b捕获稀有目标实体的效率。如上文所述，将先前鉴定的癌细胞系首先掺入健康人的血液中。在一个示例性过程中，将已知数量(例如，25至85个细胞)的mcf-7细胞(乳腺癌细胞系)首先掺入1ml健康血液中，并用pbs溶液稀释至2ml，然后将4μl(40μg)抗epcam珠粒加入到稀释的样品中并在rt孵育至少75分钟。随后将样品混合物以2ml/min的流速在流体外壳120中循环2分钟，同时将磁体放置在流体外壳120下方，以将磁性颗粒以及磁性颗粒结合的细胞吸引到放置在流体外壳120内部的固体表面，随后用3ml的pbs溶液洗涤。然后，将rbc(红细胞)裂解缓冲液引入流体外壳120中，持续5分钟孵育，并再次用2ml的pbs溶液洗涤室120a。然后根据先前部分中所述的方案将捕获在微芯片上的细胞固定、透化和荧光染色。然后在荧光显微镜下鉴定并对检测到的细胞进行计数。
实验结果说明，与涉及离心的传统样品处理技术相比，直接稀释方法200a和直接孵育方法200b均可以在一致的基础上实现较高的稀有目标实体的检测收率。这是因为离心和随后的抽吸步骤(其在样品与进行抽吸的使用者之间经常变化)对于制备用于细胞检测和分析的流体样品是不必要的。
全文描述的添加性的样品处理技术的其它优势包括消除使用另外设备的需要以及减少细胞分析所需的总体时间。例如，传统的基于离心的检测方案通常需要90至100分钟来进行7.5ml流体样品的制备(在离心和抽吸之后，去除1.5至2ml的流体样品)，随后在流体外壳上调用捕获。相比之下，添加性的技术能够使用较小的样品体积在60至70分钟内进行细胞检测。此外，由于添加性的样品处理技术不会去除任何体积的最初的流体样品，所以与使用基于离心的检测方案所获得的检测结果相比，可以以更高水平的纯度获得检测结果(即缀合磁珠的抗体与不需要的细胞之间的较低水平的非特异性结合)。
例如，进行实验以比较添加性的样品处理技术与基于离心的检测技术之间的捕获效率。结果显示，使用基于离心的技术导致7.5ml全血中总数为800至19,900个非靶细胞(估计平均4,000个细胞)被捕获在流体外壳上。相比之下，使用添加性的技术导致纯度增加10倍，相同体积的全血中仅有10至1,500个非靶细胞(估计平均400个细胞)被捕获在流体外壳上。
其它实施方案
已经描述了多个实施方案和实施方式。然而，应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种修改。此外，可以从所述方法提供其它步骤，或者可以从所述方法中去除步骤，以及可以将其它组件加入到所述系统中或从所述系统中移除其它组件。因此，其它实施方式是在本申请的权利要求范围内的。