制备活的微生物样品和微生物用于随后的质谱测量和评估的制作方法
本发明涉及一种制备活的微生物样品和微生物用于随后的质谱测量和评估的方法。可以从这种测量得出的结果可以特别地用于根据物种/亚种更快地识别微生物样品中的微生物和/或快速确定微生物对抗微生物物质的抗性/敏感性和/或微生物的进一步表征；例如，在致病性，毒力和代谢方面的特征。根据本发明的优选实施形式，制备特别直接在质谱样品载体上进行。
背景技术：
传染病仍然是医学中的主要问题之一。感染可以独立发生，但特别是作为其他疾病的并发症或免疫抑制治疗和/或对患者使用异物的结果。近年来，现代医学的进步以及复杂的外科手术和免疫抑制疗法与此相关的增加以及异物的使用已经成为导致感染率增加的因素之一。在此例如提到实体器官和骨髓移植物的移植物。
尤其是多重耐药病原体的增加引起担忧；例如，细菌(包括mrsa-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；vre-耐万古霉素肠球菌；耐环丙沙星，美罗培南或妥布霉素的铜绿假单胞菌)或真菌(包括耐氟康唑或伏立康唑的白色念珠菌)。由这些病原体引起的感染特别难以用抗微生物物质治疗。由于在所谓的“经验性”或“计算”疗法的框架内最初所施用的抗微生物药物通常在其活性谱中不包括多重耐药性病原体，因此对于治疗的成功而言，在早期检测出该耐药性是至关重要的。快速鉴定耐药性微生物可以实现及时转换到对这些病原体有效的抗菌物质。为简单起见，它们在下文中被称为抗生素；该术语不仅指对细菌有效的物质，还指对抗真菌和其他微生物的药物。这种在早期阶段切换到正确的抗微生物治疗对于治疗的成功至关重要。
目前尤其缺乏可在仅几个小时内提供灵敏度测试结果的表型(即基于培养的)测试系统或单个测试。表型抗性意味着尽管存在抗生素，微生物也会生长。对于表型抗生素敏感性，如果以足够的浓度施用，则在测试的抗生素存在下抑制这种生长。表型灵敏度测试代表了黄金标准；一个原因是测试结果无关于所基于的抗性机制而产生。虽然可以利用分子生物学在短时间内检测某些抗性基因；例如通过聚合酶链反应(pcr)。但这种检测只能用于某些抗性机制；其他抗性机制无法得到检测。此外，这种分子测试仅检测已知的遗传编码的抗性机制。因此，除非检测到特异性抗性基因，否则不可能对病原体对抗生素的敏感性做出可靠的说明。另外，如果检测到抗性基因，利用这些方法不总是允许对表型抗性进行可靠的预测。这是因为基因表达的表现可以变化；尽管存在该基因，微生物仍可以在表型方面对抗生素反应敏感。
此外，基因检测对于许多抗性机制来说是不可能的。能够通过其表型快速检测特异性抗性机制的方法例如包括，检测由一些细菌产生的β-内酰胺酶。β-内酰胺酶是可以裂解β-内酰胺抗生素并因此使它们无效的细菌酶。检测可以通过检测β-内酰胺裂解来完成，例如通过ph指示剂的颜色变化或借助于maldi-tofms(基质辅助激光解吸/电离-maldi；tof-飞行时间；质谱-ms)。在maldi-tofms中，以质谱测定未裂解的β-内酰胺和/或其裂解产物。尽管这些方法在某些情况下可能是有利的，但它们的普遍缺点是仅检测到一种特异性抗性机制，并且不可能对病原体的敏感性或抗性作出普遍的，明确的说明。
因此迫切需要这样的方法，其一方面如通常的测试方法实现了基于生长的表型敏感性测试，以及由此产生的普遍性说明，但另一方面比通常的方法明显更快。这种快速测试的一般目的是在几小时内，即在1-4小时内提供结果。该时间目标的可实现性首先取决于试验方法，其次取决于待测微生物的特性；例如，他们的生长速度。
最近开发的基于maldi-tofms的、用于使用内部标准，通过量化微生物生长来进行敏感性测试方法“mbtastra”表明通过maldi-tofms进行的基于生长的一般敏感性测试是可行的(lange等，journalofclinicalmicrobiology，2014年12月，第52卷，第12期，第4155-4162页；和k.sparbier等/methods104(2016)48-54)。然而，到目前为止所描述的形式的方法需要多个处理步骤，这意味着在实验室中明显的工作成本。这种成本会降低该方法的可接受性并因此阻碍甚至阻止将该对于患者本质上有利的方法引入常规诊断中。
鉴于上述阐释，需要提供一种方法，利用该方法可以简化和加速用于随后的质谱测量的活的微生物样品的制备。通过阅读以下公开内容，本领域技术人员立即清楚本发明要实现的其他目的。
技术实现要素：
本文描述的方法代表用于非常快速且简单的基于ms的微生物测量的替代方法；例如用于物种/亚种的鉴定和/或抗性/敏感性测试和/或进一步的病原体表征。本公开尤其涉及样品处理/制备的方法以及数据分析算法。
根据第一个优选的方面，本发明涉及一种制备用于随后的质谱测量的活的微生物样品的方法，其包括以下步骤：(a)提供含有多个样品点(所谓“spots”)的扁平样品载体；(b)在至少一个样品点上施加存在于营养介质液滴中的至少一个活的微生物样本；(c)将样品载体置于具有所定义气氛的孵育室中预定的一段时间，以刺激微生物的生长；(d)在预定的一段时间后从营养介质液滴中除去残留液体，以在样品点上暴露微生物沉积物；(e)准备用于解吸电离的样品点；(f)将样品载体转移到质谱仪的解吸离子源中，从制备的样品点产生离子并获得至少一个相应的质谱；以及(g)将获得的质谱与参考数据组进行比较，以确定微生物样品的至少一种特征。
本发明的第一个优选方面尤其基于以下新的且令人惊讶的发现，即，作为用于在合适的离子源中电离经处理的样品的基板的平坦质谱样品载体已经在前置步骤中用作用于促进微生物生长的孵育生长的基底。这种双重功能使得实验室中的工作流程更加容易，并且缩短了诊断程序所需的时间，因为可以避免复杂且容易出错的手动样品转移步骤，并且不需要具有单独的制备容器，例如微量滴定板。这种程序简化有助于在临床诊断中建立快速，可靠和全面有效的微生物的质谱测量。
在不同实施形式中，参考数据集可包括参考谱，所述参考谱取自先前获得的质谱库，其中，在鉴定过程中，步骤(g)的至少一个特征可以包括微生物样品中微生物的物种或亚种。在这个简单的变体方案中，营养培养基液滴充当质谱样品载体上的纯生长反应器。专家们将认识到，微生物在液体中的繁殖速度由于与营养介质的全面冲刷等因素要快于在平坦的营养培养基上繁殖，例如培养皿中的琼脂层，由此，所提出的方法提供了时间优势，这在临床领域中对于患者的存活至关重要。
在特定情况下，参考数据集可以从步骤(f)中获得的质谱中包含的不是源自微生物的质量信号导出。例如在微生物样品的制备过程中添加的一种(或者多种)参考物质(内部标准)的质量信号，其例如用于定量。
在优选的实施形式中，在步骤(b)中将相同的微生物样品平行施加到几个样品点，其中营养介质的液滴有的含有抗微生物物质，有的则不含。质谱样品载体特别适用于广泛的抗性/灵敏度测试，因为它提供了足够的空间来在不同抗微生物物质(或相对于不同浓度的相同抗微生物物质)存在的同时监测微生物的生长。例如，可以非常快速和可靠地阐明微生物是否表现出对特定抗微生物物质的敏感反应(或它开始这样反应的浓度)的问题，这表明其作为药物的有效性。
在该方法的特别实施形式中，具有抗微生物物质的几个营养介质液滴有的可含有酶抑制剂，有的不含酶抑制剂。当β-内酰胺酶抑制剂用作酶抑制剂时，具有很大的临床和治疗意义。如果β-内酰胺类抗生素的存在不抑制所研究的微生物的生长，但是在β-内酰胺类抗生素和β-内酰胺酶抑制剂组合的存在下被抑制时，那么抗性/敏感性测试的这种扩展就可以表明β-内酰胺酶所引起的抗性。
在不同实施形式中，参考数据集可以是最近获得的样品点质谱，该样品点上在步骤(b)中已经施加了没有任何抗微生物物质或酶抑制剂的营养介质液滴；并且，在表征的过程中，步骤(g)中的至少一个特性可以包括微生物样品中的微生物对抗微生物物质或抗微生物物质和酶抑制剂的组合的抗性/敏感性。通过这种方式可以通过在步骤中(b)中施加几滴分别具有不同浓度的抗微生物物质(和/或抑制剂，如果适用的话)的营养介质来确定抗生素相对于微生物的最小抑制浓度，并且评估随着浓度增加或减少的有效程度。
在另一个实施形式中，参考数据集可以是第二样品载体上的样品点的质谱，其中为了用作参考数据集的质谱，微生物孵育较短的时间，或者可能情况下完全不进行孵育。这里，微生物样品优选在没有任何抗微生物物质或没有抗微生物物质和酶抑制剂的组合的营养介质液滴中施加到样品点上。为了微生物样品和参考数据组的质谱而在开始施加到样品点上的微生物细胞的量优选是相同的。
优选从微生物生长的差异中导出步骤(g)中的至少一个的特征，微生物生长反映在获得的质谱中的微生物特异性质量信号特征的特性或强度中；取决于是否发现了由抗微生物物质单独或与酶抑制剂组合引起的生长抑制。在简单的变体方案中，如果在孵育之前测量的微生物样品中微生物的量不足以进行可靠的鉴定，则可以基于物种的成功鉴定来评估微生物生长。
在不同实施形式中，步骤(b)中的微生物样品可以在营养介质的液滴中这样定量，使得量略低于质谱测量的检测极限。通过这种方式，样品载体必须保留在孵育室中以刺激微生物生长的时间长度尤其可以减少到最小。因为达到检测限或略微超过检测限的生长本身可以与不包含背景信号之外的信息数据的测量相比作为微生物的存在或特征的指示。
在不同实施形式中，步骤(c)中孵育室中的温度和湿度可以分别设定为约36℃(这对于孵育或敏感性测试来说可能是必需的或甚至是规定)和接近饱和，以为待研究的微生物创造最佳或所需的生长条件。目标一般是在孵化室中创造可以最清楚地揭示生长差异的条件。36℃的温度大致对应于人体的温度，并且适合于那些专门以人为宿主的微生物。例如，在兽医，食品或环境诊断中，很可能将其他温度鉴定为最合适的温度，这取决于微生物优选的宿主或周围环境。接近100％的高空气湿度特别用于防止营养介质的液滴过早蒸发，使得可用于微生物生长的液体体积在预定的时间段内保持大致相同，这通常是到几个小时，在此期间样品载体在孵育室中(通常1-18小时)。
在不同实施形式中，残留液体的去除(在孵育步骤之后)可以包括用吸收材料轻轻擦掉液滴上清液或将其移液。这些变体方案具有以下优点，即，存在于营养介质液滴中的物质的残余物与液体一起从样品点中很大程度上除去，这可以减少随后的质谱测量中的化学背景。然而，也可以使液体在短时间内蒸发，例如借助于热空气鼓风机。在这种情况下，液体营养介质中的物质沉淀在微生物沉积物上，随后与其一起至少部分地进行制备，以用于随后的质谱测量。
在不同的实施形式中，步骤(e)中的制备可包括从微生物沉积物中预备提取微生物蛋白质/肽和/或洗涤微生物沉积物和/或将微生物沉积物嵌入激光吸收基质物质中以通过基质辅助激光解吸(maldi)进行后续电离。在提取的情况下，可以增加所获得的质谱中的微生物特异性质量信号的数量，并由此提高了测量的有效性；特别是当目的是鉴定所研究的微生物的物种/亚种时。一个或多个洗涤步骤特别适合于从微生物沉积物中除去几乎无所不在的盐，否则这些盐会降低电离效率。因此可以进一步优化制备方法。基质物质的实例是2,5-二羟基苯甲酸，芥子酸或α-氰基-4-羟基肉桂酸。事实证明，maldi方法是基于离子的微生物研究中非常重要和可靠的工具。同时，其允许脉冲离子生成，这特别适用于以飞行时间分散的形式来获得质谱。
然而，还可以想到，不需要施加基质物质的其他类型的解吸电离也可以与所述方法一起使用；例如，解吸电喷雾电离(desi)或通过二次离子质谱电离(sims)。在非常特殊的情况下，步骤(e)中的制备可以仅包括例如几分钟的短的等待时间，而不进行微生物沉积物的任何进一步处理。
有利地，步骤(f)中的质谱是飞行时间分散获得的。飞行时间质谱仪因其高分辨率，快速测量时间和广泛的质量接受度目前可以被视为临床和非临床微生物分析的“黄金标准”。根据飞行时间原理操作的质谱仪的实例是来自brukerdaltonikgmbh的市售
在不同实施形式中，微生物样品可以在步骤(b)中(i)作为至少一个样品点上的营养介质液滴中的悬浮物分配，或者(ii)首先以细胞形式沉积在至少一个样品点上，然后浸入分配的营养介质液滴中。在其它的变体方案中，抗微生物物质(以及可能情况下的酶抑制剂)可以与微生物样品和/或营养介质一起或与其分开地施加到样品点上。原则上，还可以想到颠倒沉积和分配的顺序，由此首先分配液滴，然后将微生物样品引入其中。
根据进一步优选的方面，本公开涉及用于随后的质谱测量的微生物的制备方法，其包括以下步骤：(a)提供含有若干样品点的扁平样品载体，例如来自brukerdaltonikgmbh的msp48/96targetpolishedsteelbc；(b)将完整的、在离开平坦样品载体处培养和/或分离的微生物在营养介质液滴中施加到平坦样品载体的至少一个样品点上，优选用纳米吸管或微量移液管；转移的液滴量可以在1到10微升之间；(c)将扁平样品支持物保持预定的静置时间，以允许在样品点上形成微生物沉积物，优选约10至60分钟；(d)在预定的静置时间后，除去营养介质液滴的残留液体，以暴露微生物的沉积物；(e)准备样品点以进行解吸电离；优选用maldi基质物质；(f)将样品载体转移到质谱仪的解吸离子源中，从经制备的样品点产生离子并获得至少一个相应的质谱；以及(g)将获得的质谱与参考数据组进行比较，以确定微生物的至少一个特征。
发明人已经确定，平坦表面上的微生物沉积物可以在最长一小时的相对短的静止期后就已经形成，使得在此以一种“生物膜”的形式沉淀的微生物可以轻柔地从残余液体中除去，并利用随后的质谱测量可靠地检测。利用这一令人惊讶的发现，根据第二方面，根据本发明的第一方面在相同质谱样品载体上进行的用于促进生长和用于质谱测量的制备的微生物的培养(或孵育)在不同的基板上进行。这种空间分离开辟了尤其是在工作流程的自动化中的应用可能性，因为在临床环境中，与在平坦表面上，例如利用maldi-tofms载体相比，自动化培养方案可以更容易地在容器中进行，例如标准化微量滴定板的孔。原则上，根据第一方面的方法实施方案也适用于根据第二方面的方法，只要它们能够相互协调即可。
在不同实施形式中，参考数据集可以具有参考谱，所述参考谱取自先前获得的质谱库，并且在鉴定过程中，步骤(g)中的至少一种特征包括微生物的物种或亚种。
在不同实施形式中，在步骤(b)中施加之前，微生物可以在液体营养介质中在远离扁平样品载体的至少一个容器中培养，并由此处转移到样品点上；在环境调节/调温控制的培养箱中的培养优选需要约4至24小时。如前所述，培养尤其对于微生物的敏感性测试特别有用-优选在抗生素存在和不存在的情况下。对于鉴定或确定质谱中可以指出特定的毒力因子或其他微生物特征的特定蛋白质来说，培养不是绝对必要的，因此不需要是受保护的方法的一部分。可以使用已经存在的微生物悬浮液；例如由于实验室中的其他过程而产生的微生物悬浮液。举例来说：例如，通过将存在于琼脂平板上的细菌菌落溶解在液体中来产生细菌悬浮液；在此之前，可以在固体介质(如琼脂)上培养细菌，其可以使菌落生长(其可以以这种形式已经存在数天)。另一个例子：maldi
在不同的进一步的实施形式中，可以在几个(外部)容器中培养相同的微生物，并且有时可以将抗微生物物质添加到液体营养介质中但有时不添加。另外，酶抑制剂有时可以添加到添加有抗菌物质的不同容器中的液体营养介质中，有时不添加。一个例子是β-内酰胺酶抑制剂。
在不同实施形式中，参考数据集可以是最近获得的样品点的质谱，其上存在微生物沉积物，该微生物沉积物源自不含抗微生物物质或酶抑制剂的液体营养介质，并且在进行特征化时，步骤(g)中的至少一个特征可包括微生物对抗微生物物质或抗微生物物质和酶抑制剂的组合的敏感性。在一个特别的变体方案中，相同的微生物可以在分别具有不同浓度的液体营养介质的不同(外部)容器中培养，并且在进行特征化时，步骤(g)中的至少一个特征可以包括抗微生物物质对于微生物的最小抑制浓度。
优选地，步骤(g)中的至少一个的特征由微生物生长的差异导出，其可以表现为例如用maldi
在培养开始时，可以对微生物进行定量，使得其量略低于质谱测量的检测极限；例如每毫升营养介质约105cfu，尤其导致每个样品点至少约100个微生物的浓度。
在不同实施形式中，在步骤(d)中从扁平样品载体中除去残余液体可包括用吸收性材料擦掉液滴上清液或将其移液。
步骤(e)中的制备可包括从平坦样品载体上的微生物沉积物中准备性提取微生物蛋白质/肽和/或洗涤微生物沉积物和/或将微生物沉积物嵌入激光吸收基质物质中，以便随后在步骤(f)中通过基质辅助激光解吸(maldi)电离。
步骤(f)中的质谱优选地通过飞行时间分散(在飞行时间质谱仪中)获得。
在不同实施形式中，微生物可以(i)作为液体营养介质中的悬浮液分配到(外部)容器中，或者(ii)首先以细胞形式引入(外部)容器中，之后灌入液体营养介质；例如，营养介质的量可以在10到100微升之间。
在不同实施形式中，微量滴定板中的孔(或几个孔)可用作用于培养的(外部)容器。作为替代方案，来自步骤(a)的样品载体板可以分成具有平坦样品点的第一平坦区段和在表面上具有凹陷的第二区段，其中这些凹陷用作(外部)容器(远离第一平坦区段)，并且在步骤(b)中将在其中生长的完整微生物从此处转移到第一平坦区段中的平坦样品点上。
附图说明
通过参考以下说明可以更好地理解本发明。图示中的元件不一定按比例绘制，而主要用于说明本发明的原理(主要是示意性的)。在图示中，相同的附图标记表示不同视图中的对应元件。
图1示出了具有线性轴向飞行路径2的质谱仪10的实施例的示意图，该线性轴向飞行路径终止于检测器4，并且具有上游离子源6用于基质辅助激光解吸(maldi)，如其通常用于微生物细胞的质谱分析那样。
图2a至图2g示意性以及示例性地示出了为了识别而制备微生物样品中的微生物的方法。
图3a至图3h示出了用于微生物样品的抗性/敏感性测试的可能方法的示意图。
图4a和图4b示出了根据本方法的原理的抗性/敏感性测试的结果。
图5a至图5i示意性以及示例性地示出了根据本发明的第二优选方面的微生物制备方法的示意图。
图6示出了具有多个区段的组合试样载体的实施例，这些区段一方面是平坦的，并因此可以用作质谱样品载体(并且可能情况下用于其上的制备)，并且另一方面具有用于在液体营养介质中培养/孵育微生物的内嵌的容器。
具体实施方式
尽管已经参考多个实施例说明和解释了本发明，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离在所附权利要求中限定的技术教导的范围的情况下，可以在形式和细节上进行不同改变。
根据本公开的第一个优选方面，令人惊讶地发现，直接在质谱样品载体上制备活的微生物样品可以单独用于培养微生物以在样品点上产生对于质谱检测来说足够数量的微生物。在该简单但却令人惊讶地有效的实施形式中，其中悬浮或浸没有活微生物细胞的营养介质液滴同样用作增殖反应器。
图2a至图2g示出了直接在样品载体上的液滴中的这种培养方法的示意图，随后进行质谱测量。
扁平样品载体12在不同位置(“点”)涂覆有微生物悬浮液的液滴14，其中该液体含有营养介质，例如阳离子调节的mueller-hinton培养液或iso-sensitest培养液。根据需要，液滴14可具有1-10微升的体积，例如2,4,6或8微升。样品点可以在载体表面上标记，或者在足够距离的位置处施加在载体12的其他无特征表面上。例如，具有96个标记点的anchorchip板可以用作载体12(brukerdaltonikgmbh，德国不来梅)。替代性地，样品斑点也可以由施加的营养介质14的液滴限定，当样品支持物12的表面具有足够的疏水性时，其不会扩散。图2a。
在该实施例中，将涂覆有五个分别含有不同的微生物的液滴14的载体12置于孵育室16中，在此可以在36℃和几乎100％相对湿度的经定义的受控气氛下，将其保持例如长达18小时左右。这里应该提到的是，微生物样品的施加当然也可以在孵育室16中就已经进行；因此，将样品沉积到样品支撑件12上的相关方法步骤和将样品支撑件12放置在孵育室16中，在本公开中描述的过程的所有可想到的实施例中可以颠倒顺序。
例如，可以用氯化钠溶液调整孵育室16中的湿度。在处于孵育室16中的时间期间，微生物可以通过异化分解液滴14中的营养介质而增殖。由于液滴14中的一开始澄清的营养介质在几小时后变得混浊(未示出)，增殖变得可见。然而，这种浊化对于可以通过质谱法检测的微生物生长来说不是必要的。但是孵育时间足够长的情况下，这可以用作视觉过程控制标记。图2b。发明人惊奇地发现，同时，增殖的微生物在液滴14和支撑表面之间的边界处以足够的量沉降，这极大地易化了随后的液体消耗(除湿)或干燥。图2c。
在一个变体方案中，可以通过微量移液管或纳米移液管18小心地抽出液滴上清液中的残余液体，直到载体表面上沉积的微生物细胞团20几乎完全暴露。图2d-2e。令人惊讶的是，由于上述沉降行为，在以这种方式去除营养介质的残余液体之后，足够的微生物保留在样品点上，由此得到了在质谱仪的检测器中产生可检测的质量信号的基础。
之后，样品点上暴露的微生物沉积物20可以用基质物质涂覆，以通过基质辅助激光解吸直接在样品载体12上进行电离(具有瓷砖式图案块阴影的移液管尖端22)。图2f。此外，可以在此之前插入其他的准备步骤，例如添加用于蛋白质/肽提取的物质和/或洗涤步骤(未示出)；其为专业人员所熟知。在质谱仪的离子源中，用激光器24轰击由此制备的样品点，从而从样品点上的所沉淀和制备的微生物膜20中产生离子，然后将其供给所连接的质谱分析仪以进行测量。图2g。
通过已知的评估算法，例如maldi
除了上述在微生物培养后直接在质谱样品载体上进行的纯鉴定测量之外，本公开还提供了用于加工用于抗性/敏感性测试的微生物样品的方法和测试试剂盒，如下文所述。
用于敏感性测试的常规装置通常同时测试大量抗生素(例如12至18种)，其包含在标准化的所谓“面板”中。结果通常在同一工作日无法获得，因为其需要更长的孵育时间和反应时间；通常的孵育期：10-24小时(所谓的“过夜孵育”)。在实际的临床情况中，仅测试一种或几种抗生素就足够了，这些抗生素是在特定患者身上和其疾病中所关注的，或者已经用在了特定的病人身上。然而，如果例如在抗生素施用下没有观察到临床改善，则迫切需要检查有效性。为此，尤其是在脓毒症等危及生命的感染的情况下，这些测试结果可以不是隔天，而是在明显更短的例如几个小时的时间内提供给负责的医生作为治疗抉择辅助是非常重要的。
由于这个原因，本说明书特别关注用于进行个体快速测试的方法和装置(测试试剂盒，消耗材料和其他工具)，即针对某种特定微生物或针对微生物群的特定抗生素的测试。这并不排除可以使用相同或相似或衍生的原理，可能情况下针对多种抗生素的同时测试进行匹配，以同时或迅速测试大量抗生素。
根据第一优选方面说明的方法的特征之一是，抗性/敏感性测试或至少大多数所需的程序步骤直接在质谱样品载体(例如maldi-tofms载体)上进行，即适用于此目的的、例如由抛光钢或陶瓷制成的平坦导电板，其在测量期间在质谱仪的离子源中用作电离的基底。在所述方法中，敏感性测试是基于生长的(基于培养的)，即该方法是表型敏感性测试，并因此独立于所基于的抗性机制(如果存在)。
含有和不含抗生素的微生物(后者表征生长控制)的生长同样可以直接在maldi-tofms载体上进行，测量随后也在其上进行。这从根本上区分了根据第一个优选方面说明的方法与现有的基于maldi-tofms的方法，在现有方法中微生物在maldi-tofms载体外部培养。在这些方法中，使用和不使用抗生素(用于生长控制)的培养首先在培养容器或微量滴定板的孔中进行，之后在这些容器或孔中分离微生物或微生物蛋白，并随后将其转移到maldi-tofms载体上然后测量。然而，这需要一系列繁杂的手动步骤，这导致难以将这些已有方法集成到常规诊断工作中。与此相对，根据第一方面所提出的方法允许非常简单和快速地制备加工样品。
以与图2a至图2g类似的方式，图3a至图3h中示例性示出了这里所说明的工作步骤，并用于示意性地示出其的可能含义。然而，本领域技术人员可认识到某些处理步骤可以以不同的形式执行。专业人员会将这里提出的工作流程作为方向性辅助，并且在可能的情况下，根据他们的常规技能和知识作出改变，如果这看起来对他们有利或有用。
抗生素(例如液体营养介质中的抗生素溶液)可以在培养容器中或直接在maldi-tofms支持物12(阴影液滴14*)的样品点上与微生物悬浮液混合。另外，这通常伴随着对maldi-tofms载体的其他区域上的生长控制，即，在不添加抗生素(无阴影的液滴14)的营养介质中培养微生物悬浮液。优选将极少量的悬浮液施加到样品点上；例如1-10微升。因此，敏感性测试在微液滴14,14*中进行，优选具有约4-8微升的体积。原则上也可以使用甚至更小的体积，例如以纳米液滴的形式。液滴14,14*中的初始微生物浓度可略低于具有线性飞行路径的常规maldi飞行时间质谱仪的检测极限，并由此例如为约5×105cfu/毫升(cfu-colonyformingunit；菌落形成单位)。图3a。
在所示的实施例中，随后将具有测试溶液的maldi-tofms载体12在所谓的“湿度室”16中在高湿度下在培养箱中培养。湿度室16的目的是防止液滴14,14*在孵育期间过早地蒸发，并且可以采用例如由塑料制成的具有盖子的盒子的形式，maldi-tofms载体可轻松地放入其中。该湿度室16可以具有与用于商业maldi-tofms载体(brukerdaltonikgmbh，bremen，germany)的常规运输或储存容器类似的形式，并且优选设计成使得maldi-tofms载体12在这里可以是在其内部放置足够深，使得盖子不与maldi-tofms载体12的表面上的液滴14,14*接触。可以将少量液体放入湿度室16中，例如0.1至5毫升水或nacl溶液，以加湿腔室16中的气氛，从而设定高环境湿度(接近100％)，从而防止营养介质液滴14,14*自身蒸发。图3b。
在液滴14,14*中，在孵育期间迅速实现小体积液体中微生物的高浓度(只要生长不受抗微生物物质抑制)。在足够的一段时间之后，可以将具有maldi-tofms载体12的湿度室16从培养箱(未示出)中取出。然后将maldi-tofms载体12从湿度室16中取出，并干燥载体上的液滴14,14*。干燥可以是被动的，例如在空气中进行，或者例如通过主动产生的气流，热效应，两者的组合或其他方法加速。由于液滴14，14*中的液体体积非常小(纳升至微升)，干燥非常迅速。然而，这种简单的液滴干燥(例如用热空气)可能具有以下缺点，即，不仅是微生物细胞，而且还有蛋白质和液体营养培养基的其他组分在maldi-tofms支持物12的样品点上富集并干扰maldi-tofms测量。通过直接在maldi-tofms载体12上从营养介质中分离微生物细胞可以解决这个潜在的问题。
在干燥和分离的两种情况下，目的是极大程度上除去营养介质液滴14,14*的残余液体，以便为随后的制备预备样品点。如前所述，发明人在他们的研究中已经确定微生物细胞在可持续几个小时的孵育过程中具有沉淀的趋势，以主要直接积聚在maldi-tofms支载体12的表面上。在一定程度上，细胞甚至粘附(“粘贴”)到支持物12的表面并形成一种“微生物生物膜”，而液体组分形成位于其上方的“上清液”。在不对微生物在平板上的液滴中生长过程中的这种行为提供成熟的科学解释的情况下，猜测是板表面和微生物细胞之间的物理相互作用，以及由细胞表面的生物化学和生物物理性质引起的粘附过程与该优选的沉积有关。图3c。
利用这一新发现，上清的营养介质(残留液体)可以从maldi-tofms载体12上的液滴14,14*中移出，如参考图2d在其他方面已经说明的那样。替代性地，可以简单地擦去液体以从液体中暴露微生物沉积物。吸收性的低绒毛擦拭布26可用于此目的，如生物/化学实验室中常用的那样；例如kimwipestm。这里，分离立即发生，并且可以尤其通过毛细效应来解释。可以通过例如用折叠的布手动擦拭(例如吸收纸，吸墨纸，用于清洁敏感表面的软布)或借助特殊装置进行分离。例如，这种装置可以具有吸收材料制成的片或“垫”，其为了均匀，快速和标准化的擦拭，而特别是简单地定位在maldi-tofms载体12上方一定距离处，该距离允许建立与液滴14,14*的流体接触，并在几秒钟的相对短的吸收时间之后再次移除。图3d-3f。
在擦拭的替代实施形式中，液滴和吸收性织物之间的接触不是在垂直方向上(垂直于样品载体表面，如图3d-3f所示)建立的，而是在液滴的侧边缘处靠近样品载体的表面。通过这种方式可以确保(i)营养介质的残余液体被更快和更完全地吸收，并且(ii)优先积聚在表面处的样品点中心中的细胞无论如何都不会接触到吸收性织物，以减少意外去除细胞的危险。这种液体吸收的不同方案可以进一步降低质谱中的背景，从而进一步提高测量的质量。
上述除去残留液体的这些形式还在相应的样品点上导致具有很少潜在干扰营养介质残留的基本上完全除湿的(或残留的液体减少，暴露的)微生物沉积物20，该沉积物用作随后的质谱测量的基础。
这里借助于擦拭或移液进行的细胞与液体营养介质的分离提供了ms谱的高质量有效测量。与液滴的(被动)干燥相比，这种分离的另一个优点是分离非常快速(立即或即时)发生，这实现了显著的时间节省并且允许立即进行样品的进一步处理。然而，在某些实施例中，擦拭可伴随加热的干燥气流，以便更彻底地消耗残留液体。
该方法对于从液体介质中分离细胞，例如离心并随后除去上清液同样有效，但可以直接在maldi-tofms载体上进行而无需时间成本。分离效果可以进一步加强-例如通过使用特殊的maldi-tofms载体，例如锚载体(anchorchip，brukerdaltonikgmbh，bremen)，或具有单独扁平锥形形式的样品点的maldi-tofms载体。浅但稍微锥形的孔可以增强细胞沉降效果。也可以使用直接在载体上洗涤液体样品的其他方法。
为了在生长期期间增强样品载体表面上微生物沉积物(粘附)的形成，可以用不同的粘附促进物质涂覆样品点表面；例如蛋白质或糖。优选选择这样的物质，其不干扰微生物质谱与参考数据集的测量和/或比较。例如，这可以通过使这些物质的质量信号位于待评估的质量范围之外实现，该质量范围通常在m/z2000和m/z20000之间，例如在m/z3000和m/z15000之间。替代性地，也可以选择这样的物质(例如蛋白质)作为具有粘附促进性质的物质，其可以同时用作标准物质；即作为测量的良好质量的标记和/或作为强度标记。在这种情况下，这些标准物质的质量信号可以在待评估的质量范围内。此外，可以从一开始就使用具有增强的粘附特性和/或增强的表面性质的材料作为制造maldi-tofms载体的材料。
如上所述，在干燥或分离相应样品点上的液体营养介质的液滴之后，例如在将载体引入maldi-tofms仪器并测量微生物生物分子，例如蛋白质或肽之前，为了maldi-tofms分析而以基质涂覆样品点(具有瓷砖形阴影的移液管尖端22)。图3g-3h。
在施加基质物质之前或同时，可以加入有助于测量(未显示)的不同物质，例如甲酸或乙腈，以改善微生物蛋白质的提取。还可以将去离子水滴作为洗涤液滴施加到微生物沉积物上并再次除去以除去盐。在测量之后，可以根据算法评估结果，这些算法在下面更详细地解释。这里，对在抗生素存在下微生物的生长进行评估和评定。基本原理是在抗生素存在下抑制敏感微生物的生长，而抗性微生物尽管有抗生素仍然能够生长。同时进行生长控制，即在相同ms样品载体上测试不含抗生素的微生物悬浮液，可有助于评估和相应的评估算法。图3b和图3c示意性地示出了敏感性(实线)和抗性(虚线)的生长和沉降行为的对比。
在该方法的一个变体方案中，可以在复合微量滴定板上使用和不使用抗生素来培养微生物，其中平坦、平整的质谱样品载体(例如maldi-tofms载体)形成底部，并且与包含通孔的可移除顶部部分一起形成了如专利申请ca2467131a1所述的孔网格(其中的图10)。所提供的反应容器或孔(例如作为测试试剂盒)在加入微生物悬浮液之前已经含有例如溶液，粉末或冻干形式的抗生素。在伴随或不存在微生物生长的足够温育期后，例如通过干燥除去液滴的残余液体，并从maldi-tofms板上除去顶部。然后可以进行如上所述的maldi基质制备和maldi-tofms测量。
在另一个实施形式中，maldi-tofms载体不在单独的培养箱中孵育，而是孵育功能可以直接整合到maldi-tof质谱仪中或整合到整个系统中，例如以孵育单元或孵化模块的形式。这允许自动化并进一步减少必要的手动准备步骤。另一个实施例设定，将加热装置直接集成到湿度室中，由此该湿度室可以承担培养箱的功能，从而不需要提供单独的培养箱。
已经使用例如干粉形式或其他形式的抗生素在样品点上预处理的质谱样品载体的使用可另外使得用户更容易进行敏感性测试。
图4a显示了兼性厌氧，革兰氏阴性杆菌肺炎克雷伯菌对来自碳青霉烯类的β-内酰胺抗生素美罗培南的实例的抗性/敏感性试验的结果。样品制备直接在样品载体上进行，如图3a-3h中所示。分配的液滴体积为6微升；抗生素的浓度为每毫升2微克；在相应调节的孵育室中的停留时间为4小时。用商业产品maldi
可以清楚地看出，在抗性菌株的情况下，两个上方谱中的特定质量信号的特征几乎没有区别。因此可以得出结论它是耐药性的，因为在美罗培南存在下细菌生长明显不被抑制，并且可以可靠地鉴定物种。另一方面，在敏感菌株的情况下，只能在生长控制的谱中看到特定的质量信号特征(右下)。然而，在存在美罗培南(左下谱)的情况下，克雷伯氏菌细胞显然不能繁殖(或几乎不繁殖)。在左下方谱中分隔突出的质量信号属于参考物质，其被添加到营养介质的液滴中以用于微生物定量，但是在这里具体说明的研究中未进行考虑。在这些缺乏生长的条件下，评估软件由于缺乏数据而无法确定微生物的种类；特别是当微生物生物质的初始量低于质谱检测极限时。由此得出的结论是，该克雷伯氏菌菌株对该特定抗微生物物质敏感地反应。
图4b使用条形图来说明在来自图4a中的实验的美罗培南存在下肺炎克雷伯氏菌在五种不同的液滴尺寸2,4,6,8和10微升下的生长行为的统计。可以看出，敏感菌株的相对生长可靠地低于0.4的显著生长阈值，而对于抗性菌株，其远远高于阈值；4微升液滴是个例外，其中尽管中位数显着大于0.4，偶尔也会出现低于其的测量。
可以对从培养物或直接从生物材料获得的微生物样品进行抗性/敏感性测试。在现有技术中，成熟培养物通常用于灵敏度测试，其已经在诸如琼脂的固体介质上孵育16-24小时，并且在这样的孵育时间之后以形成的菌落的形式存在。由在液体营养介质中培养的成熟培养物进行的测试也是可能的。
然而，在许多情况下，直接从待分析的材料执行敏感性测试是有利的，以便显著减少直至得到结果的时间。阳性血液培养物作为这样的对于快速病原体诊断具有至关重要的意义材料的实例。如今，血液培养诊断中的程序通常是这样，即，首先将从患者采集的血液样放入具有液体营养介质的特殊血液培养瓶中。随后将这些瓶子放入自动培养箱中，例如通过测量二氧化碳来连续监测瓶子中可能发生的微生物生长。当血液培养瓶的报告阳性时，将来自其的液体涂抹在固体介质上，然后将后者温育16-24小时。由此产生的菌落用于鉴定和抗生素敏感性测试。菌落也适用于此处说明的敏感性测试方法等。
然而，直接由报告阳性的血液培养物进行的鉴定和敏感性测试节省了在固体介质上培养所需的时间，因此允许大约提前一天获得结果。为实现这一点，样品必须经过预处理以富集微生物。这可以通过例如裂解/离心方法或裂解/过滤方法实现。在裂解/离心方法中，首先通过添加裂解剂，例如表面活性剂来裂解血细胞，然后通过离心浓缩微生物。在选择性的洗涤步骤中，加入洗涤缓冲液并再次通过离心浓缩微生物。然后立即或在蛋白质提取后进行鉴定。这种鉴定方法已经作为
该方法或类似方法同样可以用作样品的预备处理(富集微生物)来通过maldi-tofms进行本文所述的抗性/敏感性测试。这显著缩短了获得结果的时间。
作为替代方案，可以将在固体介质上非常短暂孵育的、来自阳性血液培养物或其他材料的亚培养物用于本文所述的基于maldi-tofms的敏感性测试。最近显示了使用在固体介质上非常短暂孵育的、来自阳性血液培养物的亚培养物进行鉴定(idelevich等，clinmicrobiolinfect，2014；20：1001-1006)和灵敏度测试(idelevich等，jclinmicrobiol。2014；52：4058-4062)。这里，固体介质在亚培养(涂抹)后仅短暂培养，通常1.5至6小时，并且将由此产生的“年轻”微生物生物质用于鉴定和敏感性测试。尽管该方法不允许在血液培养物报告为阳性后立即进行直接测试，但与从培养16-24小时的成熟菌落的常规测试相比，它仍然非常快。该方法的优点在于不需要额外的消耗品或额外的工作；仅需在较早阶段观察固体介质，并从“年轻”生物质进行测试。
特别有利的是直接从血液进行灵敏度测试，而不事先在血液培养机中孵育血液样品。样品用于富集微生物的制备处理可以如上所述进行，用于从报告阳性的血液培养物进行测试。
由于在微生物已经浓缩之后由于血液中的微生物细胞浓度低而没有预先培养，直接来自血液的直接基于maldi-tofms的鉴定目前难以进行，但借助于此处所说明的方法可以直接从血液中进行基于maldi-tofms的直接的敏感性测试。在从血液中分离微生物后，在液体营养介质中制备微生物悬浮液，并且如通常在敏感性测试中那样，与抗生素混合。然后将该悬浮液以及在可能情况下将生长对照以液滴的形式施加到maldi-tofms支载体上，并且直接在其中孵育。即使血液中的初始微生物细胞计数非常低，微生物也会在一定的孵育期后至少在生长对照中繁殖，或者如果存在表型抗性，也会在样品和抗生素的混合物中繁殖，这可以通过maldi-tof质谱仪检测。因此，灵敏度测试实际上根据与涉及本公开的第一优选方面所描述的相同的原理来实施。
可以借助于maldi-tof直接由在固体介质上培养的来自成熟菌落进行微生物的鉴定。然而，样品必须经历预备处理以从研究材料(例如来自阳性血液培养物)直接鉴定。例如，这可以通过上述裂解/离心方法实现。然而，该方法需要额外的处理步骤，这是耗时的并且使其更难以集成到常规实验室诊断中。
本申请中说明的用于根据第一优选方面直接在maldi-tofms载体上从液滴中检测和识别液滴或用于液滴敏感性测试的方法不仅可以单独实施，而且可以组合实施，其中，当从研究材料，例如从阳性血液培养物直接测试时，这种组合特别有意义。当以这种方式将敏感性测试与识别相结合时，在maldi-tofms测量中，不仅将对照测量的增长与添加的抗生素的样品的生长对应于针对敏感性测试所说明的算法进行比较，在控制测量中不受抑制的微生物生长还可以用于通常的maldi-tofms鉴定。但当孵育期足够长时，与16-24小时的通常孵育期相比仍然非常短，微生物生物质足以进行鉴定。该组合方法的优点在于，(i)可以放弃例如用于裂解/离心方法的额外处理步骤，(ii)敏感性测试和鉴定的结果可以及时和同时获得，以及(iii)与来自成熟菌落的常规测试相比，直到完成敏感性测试和鉴定的时间更短。
该组合方法可以应用于从成熟或年轻菌落测试以及直接从材料测试，例如从阳性血液培养物或血液。
本文说明的方法的另一个实施形式能够快速且简单地检测微生物的抗性机制。例如，这可以通过组合测试来实现。也就是说，除了由微生物和抗生素组成的悬浮液和仅包含微生物的悬浮液(不含抗生素的生长对照)之外，还测试由微生物，抗生素和特异性抵消微生物对抗生素的可能抗性的物质(即基于特定抗性机制)组成的悬浮液。
对此的一个实例是通过细菌检测β-内酰胺酶的形成。β-内酰胺酶是可以分裂β-内酰胺抗生素并因此使它们无效的细菌酶。β-内酰胺酶的实例是ampc-β-内酰胺酶，超广谱β-内酰胺酶(esbl)，碳青霉烯酶等。每种类型的β-内酰胺酶都能分裂特定的抗生素谱，而且此外具有不同的特性(例如基因在质粒或染色体上的定位)，这不同程度地限制了可用于治疗的抗生素的供应并允许相应细菌菌株的不同的传播速度。因此，快速确定潜在的抗性机制非常重要，特别是在可能需要引入的医院卫生和卫生措施调查的方面。
通过添加特定的β-内酰胺酶抑制剂(例如用于esbl的克拉维酸，或用于美罗培南的伐舒巴胺)，可以特殊地抑制β-内酰胺酶的作用。该原理不仅用在治疗上，而且在诊断上用于检测作为抗性基础的β内酰胺酶。例如，浸渍有抗生素的测试盘和浸渍有抗生素加β-内酰胺酶抑制剂的测试盘是可商购的。将细菌培养物涂抹在如琼脂板等固体介质上后，放置这些试验板；并且16-24小时后，测量抑制区(琼脂扩散试验)。如果达到具有抗生素的测试盘和具有抗生素加β-内酰胺酶抑制剂的测试盘之间的抑制区直径的特定差异，则这表明产生了特定的β-内酰胺酶。
除了更简单的实施之外，这里说明的用于组合测试的方法的优点特别是，与琼脂扩散方法的结果相比，结果仅在几小时后就可得到，琼脂扩散方法例如需要超过12个小时，因此晚非常多仅能在第二天提供。这里说明的方法的速度优势源于这样的事实，即，首先，液体营养培养基中微生物的生长明显快于固体介质，其次，由于液体量少，微滴中很快达到微生物的高浓度。第三，质谱测量，例如通过maldi-tofms，保证了比通过目测观察固体介质上的生长，如琼脂扩散方法的情况，可实现更灵敏和更快速的生长检测。
与开头所提到的通过maldi-tofms(未分裂的β-内酰胺或裂解产物的质量信号)检测β-内酰胺裂解来鉴定β-内酰胺酶相比，这里说明的使用组合试验的基于maldi-tofms的方法有一个重要的优点：β-内酰胺裂解的检测是一种间接方法，即在阳性情况下，其表明β-内酰胺抗生素被裂解，并由此得出结论，抗生素对这种细菌菌株无效。然而，有效性还可以取决于其他因素，例如抗生素的剂量。在本文所述的组合试验中，另外直接测定β-内酰胺酶抑制剂对微生物生长的影响，即抗性是否被抑制。这些结果具有相当大的临床相关性。
根据先前的实施方案，这里说明的组合测试可以用于来自成熟或年轻菌落的测试，并且还可以用于直接从材料测试，例如从阳性血液培养物或血液。
除了以单个的快速测试形式应用所说明的方法，即针对特定微生物测试特定抗生素之外，还可以同时测试几种抗生素(多重测试)。这具有以下优点，即可以同时产生针对微生物样品中的微生物的完全抗菌谱。此外，可以同时测试每种抗生素的多个浓度，这允许确定最小抑制浓度(mhk)。mhk是抑制微生物生长的抗生素的最低浓度。mhk是微生物对抗生素敏感性的量度。首先，mhk允许将微生物分类为“敏感”，“中间”或“抗性”类别；其次，mhk提供关于微生物对特定抗生素的“敏感程度”的信息。对于多重测试，可以平行涂覆maldi-tofms载体的许多样品垫。例如，可以使用具有96、384或1536个样品点的载体。
可以通过不同的评估算法确定微生物的生长。这里，可以将具有抗生素的微生物的生长与不含抗生素的微生物的生长(生长对照)进行比较。
提出微生物生物质的检测作为可能的算法。特定的下限检测限是maldi-tofms方法的特征，即微生物生物质的最小量(每个点约104或105个微生物细胞)，该量在质谱中产生可识别的质量信号的意义上实现了检测。检测下限取决于许多因素，包括仪器特性和设置。根据这里说明的算法，液体营养介质中的微生物可以以低于maldi-tofms测量方法的检测下限的浓度(量)施加到样品点上。也就是说，如果要在不进一步处理该微生物样品的情况下进行maldi-tofms测量，则不可能在无所不在的背景之上检测质谱中的任何微生物特征。由此可以直接得出，如果微生物对待测抗生素敏感，则生长受到抑制，并且在培养期后微生物生物质几乎检测不到，因为不超过检测限。如果微生物对所测试的抗生素具有抗性，则微生物可以在孵育期间生长，就像其在生长对照中一样(不含抗生素)，并且可以检测微生物质量，即测量谱中相应的特定微生物的质量信号。
为了提高方法的准确性并避免即使在少量的微生物生物质的情况(通常低于检测限度)错误解释质谱中“偶然”出现的、类似于特定的微生物质量信号特征的特征的可能性，可以(可能情况下以组合形式)使用微生物生物质的定量或相对定量。这可以通过例如使用内部标准(“mbt-astra”，brukerdaltonikgmbh，bremen，德国)或其他统计方法比较所谓的“曲线下面积”(auc)和/或峰值强度来实现，这些方法为专业人员熟知，不必在此详细解释。特别地，用于与获得的质谱中的微生物质量特征进行比较的参考数据集可以从内部标准或相同质谱中的参考物质的质量信号导出或测定。
提出空间分辨率的算法作为另一种可能的变体方案。这里，通过maldi-tofms方法在精确定义的空间网格中发射激光照射-例如，分布在maldi-tofms载体的经过准备的样品点的限定区域上的1000次照射。例如，在具有抗生素的微生物样品和不含抗生素的微生物样品(生长对照)之间比较“成功”照射的数量，即产生具有可检测微生物特征的质谱的照射。
该算法例如还可以用作上述用于检测微生物生物质的算法的补充，以便提高检测方法的准确性并降低即使在少量微生物生物质的情况下(通常低于检测限)“偶然”出现的特征被误解为显着的生长的概率。也就是说，例如，少数成功的照射不能被解释为增长，而是被认为是偶然的并且不重要。
图5a至图5i解释了根据本公开的第二优选方面的方法的实施例。由于许多步骤与前述方法的步骤类似，因此与此相关的实施方案也可以用在本实施例上，以下说明仅限于与根据本公开第一优选方面的方法的本质区别。
本质区别在于微生物的培养/孵育和针对质谱测量的准备不在相同的平面基底，例如质谱样品载体上进行，而是在分开的基底(或基底区段)上进行。将液体营养介质中的微生物悬浮液加入容器28中；例如，微量滴定板30中的孔。接种物可以是约106cfu/ml；营养介质的体积约为50至250微升；优选100微升。对于抗性/灵敏度测试，孔28可以(例如作为测试试剂盒)在添加微生物悬浮液之前已经含有例如以溶液，粉末或冻干形式存在的抗微生物物质。替代性地，也可以在稍后阶段将这些抗生素添加到营养介质中。图5a。
将孔板30置于培养箱16中并在此保持例如4至18小时的特定培养时间，以促进微生物生长。如已经说明的那样，微生物具有在孔28的底部和侧壁的下部形成沉积物(“微生物生物膜”)的趋势。图5b-5c。
将孔板30从培养箱16中取出。为了从孔28中取出一定体积的具有足够量完整生长的、大致均匀分布微生物的营养介质，可以搅拌沉积物，例如通过移液尖端18的几次上下移动或在移除前不久轻轻搅动孔板30，使得微生物可以以更高的浓度并与营养培养基的液体均匀分布取样。除去的液体量可以在1至10微升之间。图5d-5e。
作为该处理方式的替代方案，在可能情况下，可以通过在培养箱16期间小心地搅动孔板30(未示出)，在一开始就阻碍或防止在培养期间在孔28中形成微生物沉积物。这可以消除在移液管尖端18的帮助下分散和/或随后的搅动的需要。
将所取出的、其中包含完整微生物的液体作为液滴14置于平坦质谱样品载体12的样品点上。图5f。
然后将其静置或静止保存约10至60分钟的时间，其在该时间内为微生物提供在液滴液体和载体表面之间的界面处积聚或沉积的机会。原则上，随着样品载体12上的液滴14中微生物浓度的增加，可以缩短静止期；换句话说：在高浓度下，静止期可以在优选范围的下限；在低浓度下，等待更长时间可能是有利的。图5g。
如先前在不同的方面中所解释的，营养介质的残余液体可以在静止期后从样品点去除，例如通过吸收性织物(布26)，其在载体表面的侧方与样品点上的液滴14流体接触并简单地吸收大部分液体。当然，如上所述，也可以使用其他类型的液体去除，例如移液。图5h。
现在可以如上所述进一步制备以这种方式暴露的微生物沉积物20并在质谱仪中测量。例如，可以提取微生物的肽/蛋白质和/或可以洗涤沉积物20和/或可以将沉积物20嵌入maldi基质物质中。图5i。
图6示意性以及示例性地示出了组合的孔/样品载体32，其具有凹陷34(其可以代表多个凹陷)，其中可以培养微生物，并且具有与其间隔的、具有样品点的平坦区段36，其可以用作质谱样品制备的基底。在质谱仪的离子源中，例如可以通过预先齐平地覆盖凹陷34来减少凹陷34对电场的干扰(未示出)。
这里所说明的原理不一定限于maldi-tofms测量方法，而是原则上也可以用其他检测或区分方法实施，例如其他质谱检测方法或确定内在荧光的方法。
除了示例说明的实施例之外，本发明的其他实施例也是可行的。通过本公开的知识，本领域技术人员可以容易地设计用于活的微生物样品和微生物的进一步有利的预备方法和质谱测量方法，其也被权利要求的保护范围所涵盖。
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