一种芘类荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种芘类荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

荧光光谱检测技术由于无损检测，灵敏度高，特异性强，响应时间快等优点越来越受人们的关注。荧光成像具有高的时空分辨率，操作简便，成为实时监测细胞内的重要手段。

CN^-，HSO₃^-，pH在工业过程，日常生活及生理过程中起着十分重要的作用。亚硫酸盐广泛应用于我们的日常生活中，如在许多食品，饮料和医药产品作为防腐剂和添加剂。然而，当亚硫酸盐含量在人体内异常时，很可能导致严重的疾病，包括呼吸困难、喘息、荨麻疹、胃肠道不适等。氰化物被广泛应用于许多工业中过程中，包括金矿的开采、电镀、冶金、树脂工业。但是氰化物具有强毒性，可以引起人呕吐、抽搐、意识丧失甚至死亡，而且还造成环境的污染。细胞内pH对于细胞凋亡、细胞增殖、细胞内吞作用、酶活性、离子运输等过程起着至关重要的作用。细胞内pH值的变化可能会导致细胞机能障碍和严重的疾病。如异常的pH值会导致心肺功能和神经系统的损伤问题(如癌症和阿尔茨海默症)。因此，设计合成灵敏，选择性高的荧光探针用于检测CN^-，HSO₃^-，pH是十分必要的，这对于了解生理和病理进程以及环境保护有着十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种芘类荧光探针及其制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种快速、定量检测CN^-，HSO₃^-，pH的荧光检测方法，而且这种探针具有良好的灵敏度、选择性。

本发明提供的一种芘类荧光探针，是1-(芘-1-基)-3-(2,6-二氯吡啶-3-基)丙烯酮,其结构式为：

本发明提供的一种芘类荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

在容器中按摩尔比5:7加入乙酰芘的乙醇溶液和2,6-二氯吡啶-3-甲醛的乙醇溶液，再加入质量浓度10％的氢氧化钠水溶液，在常温下利用磁力搅拌器搅拌反应20h。反应完全后过滤，点板确定产物纯净后，自然晾干3h后放入真空干燥箱干燥2h，得到橙黄色产物。

其合成路线如下：

本发明提供了一种定量荧光检测H⁺的方法，其特征在于，步骤为：

(1)用DMSO配制1mM的芘类荧光探针储备液；

(2)将2ml蒸馏水和30μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，460nm处的荧光强度逐渐减弱，420nm处的荧光增强；

(3)用蒸馏水配制0.01M，0.1M，1M的H⁺溶液，将2ml蒸馏水和30μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行pH滴定实验；以pH为横坐标，相对荧光强度I_420nm/I_460nm为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝3.76；通过线性拟合得到最佳线性响应范围为pH 3.10-4.66，回归方程为：I_420nm/I_460nm＝3.39-0.64*pH，线性系数为R²＝0.9819。

稳定性实验证明荧光探针对H⁺测定具有良好的光稳定性。

经实验验证，其它金属阳离子不干扰体系对H⁺的测定。

本发明提供了一种定量荧光检测OH^-的方法，其特征在于，步骤为：

(1)用DMSO配制1mM的芘类荧光探针储备液；

(2)将2ml蒸馏水和30μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，463nm处的荧光强度逐渐减弱；

(3)用蒸馏水配制0.01M，0.1M，1M的OH^-溶液，将2ml蒸馏水和30μL荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行pH滴定实验；以pH为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝9.65；通过线性拟合得到最佳线性响应范围为pH9.41-12.18，回归方程为：F₀-F＝116.02*pH–529.13，线性系数为R²＝0.9955。

稳定性实验证明荧光探针对OH^-的测定具有良好的光稳定性。

经实验验证，其它金属阳离子不干扰体系对OH^-的测定。

本发明提供了一种定量荧光检测CN^-的方法，其特征在于，步骤为：

(1)用DMSO配制1mM的芘类荧光探针储备液；

(2)将2ml PBS缓冲液(pH＝10.0)和20μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，463nm处的荧光强度逐渐减弱；

(3)用蒸馏水配制的0.01M CN^-溶液，将2ml PBS缓冲液(pH＝10.0)和20μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行滴定实验；以CN^-浓度为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标绘制图，得到CN^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F₀-F＝12.40+132.60*c,c的单位为10^-6mol/L；通过线性拟合得到探针的最佳响应范围为：0–2.0μM，线性系数为R²＝0.9802。

经实验验证，其它阴离子不干扰体系对CN^-的测定。

本发明提供了一种定量荧光检测HSO₃^-的方法，其特征在于，步骤为：

(1)用DMSO配制1mM的芘类荧光探针储备液；

(2)将2ml PBS缓冲液(pH＝6.0)和20μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着待测样的加入，463nm处的荧光强度逐渐减弱；

(3)用蒸馏水配制的0.001M HSO₃^-溶液，将2ml PBS缓冲液(pH＝6.0)和20μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行滴定实验；以HSO₃^-浓度为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标绘制图，得到HSO₃^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F₀-F＝15.90+927.71c,c的单位为10^-6mol/L；通过线性拟合得到探针的最佳响应范围为：0-0.5μM，线性系数为R²＝0.9903。

经实验验证，其它阴离子不干扰体系对HSO₃^-的测定。

本发明的探针具有很好的细胞膜渗透性，可用于细胞内pH，HSO₃^-的检测。

与现有技术相比，本发明作为选择性检测pH，CN^-，HSO₃^-的荧光探针有如下优点：1、本探针制备方法简单、快速；2、本发明的四种荧光检测方法，分别对H⁺，OH^-，CN^-，HSO₃^-显示了高的灵敏度，选择性；3、检测手段简单，只需借助荧光光谱仪；4、本发明荧光探针可用于细胞及大肠杆菌荧光成像。

附图说明：

图1实施例2芘类荧光探针的H⁺滴定荧光图

图2实施例3芘类荧光探针对H⁺响应的的工作曲线

图3实施例4芘类荧光探针对H⁺识别时其他金属阳离子的荧光柱状图

图4实施例5H⁺的细胞成像图

图5实施例6芘类荧光探针的OH^-滴定荧光图

图6实施例7芘类荧光探针对OH^-响应的的工作曲线

图7实施例8芘类荧光探针对OH^-识别时其他金属阳离子的荧光柱状图

图8实施例9OH^-的细菌成像图

图9实施例10芘类荧光探针的CN^-滴定荧光图

图10实施例11芘类荧光探针对CN^-响应的的工作曲线

图11实施例12芘类荧光探针对CN^-识别时其他阴离子的荧光柱状图

图12实施例13芘类荧光探针的HSO₃^-滴定荧光图

图13实施例14芘类荧光探针对HSO₃^-响应的的工作曲线

图14实施例15芘类荧光探针对HSO₃^-识别时其他阴离子干扰的荧光柱状图

图15实施例16HSO₃^-的细胞成像图

具体实施方式

以下实施例中的芘类荧光探针储备液即为用DMSO溶液体系配制的1mM的芘类荧光探针储备液。

实施例1芘类荧光探针的制备，步骤如下：

取0.61g(2.5mmol)乙酰芘用60mL无水乙醇溶解在一个250mL的双口烧瓶中(可适当加热加速溶解)，再加入用20mL无水乙醇溶解的0.63g(3.5mmol)的2,6-二氯吡啶-3-甲醛溶液，随后加入3mL10％的氢氧化钠水溶液，在常温下用磁力搅拌器搅拌20h。反应结束后过滤，点板确定产物纯净后，自然晾干3h后放入真空干燥箱干燥2h，得到橙黄色产物0.89g,产率88.6％。

荧光探针用NMR表征，结果如下：

¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ/ppm：8.803～8.788(d,1H,J＝9.0Hz),8.728～8.714(d,1H,J＝8.4Hz),8.636～8.623(d,1H,J＝7.8Hz),8.467～8.429(m,3H),8.396～8.380(d,2H,J＝9.6Hz),8.325～8.310(d,1H,J＝9.0Hz),8.201～8.176(t,1H,J＝7.5Hz),8.075～8.048(d,1H,J＝16.2Hz),7.874～8.848(d,1H,J＝16.2Hz),7.762～7.748(d,1H,J＝8.4Hz).¹³C NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ/ppm：193.44,150.47,149.82,140.88,136.96,133.97,132.50,132.07,131.14,130.51,130.20,130.07,129.53,129.15,127.95,127.74,127.40,127.19,126.81,124.88,124.83,124.49,123.92.

实施例2芘类荧光探针的H⁺滴定荧光图

在2ml蒸馏水中加入30μL芘类荧光探针储备液进行H⁺荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测。随着待测样的加入，460nm处的荧光强度减弱，420nm处的荧光逐渐增强。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λ_ex为365nm和最大荧光发射波长为:λ_em为460nm。

实施例3芘类荧光探针对H⁺响应的的工作曲线

用蒸馏水配制0.01M，0.1M，1M的H⁺溶液，将2ml蒸馏水和30μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行滴定实验(pH变化范围7.30-1.95)；以pH为横坐标，相对荧光强度I_420nm/I_460nm为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝3.76；通过线性拟合得到最佳线性响应范围为pH 3.10-4.66，回归方程为：I_420nm/I_460nm＝3.39-0.64*pH，线性系数为R²＝0.9819。

实施例4芘类荧光探针对H⁺识别时其他金属阳离子的荧光柱状图

在pH 7.30和pH 3.00的蒸馏水中加入30μL芘类荧光探针储备液，再加入其它的金属阳离子分别测其荧光光谱，绘制不同金属阳离子对应的相对荧光强度I_420nm/I_460nm的柱状图，见图3。图3中物质的顺序和浓度分别为：1.空白；2.K⁺(25mM)；3.Na⁺(25mM)；4.Ca²⁺(2mM)；5.Zn²⁺(2mM)；6.Mg²⁺(2mM)；7.Al³⁺(0.2mM)；8.Co²⁺(0.2mM)；9.Cr³⁺(0.2mM)；10.Pb²⁺(0.1mM)；11.Ni²⁺(0.1mM)；12.Cu²⁺(0.1mM)；13.Hg²⁺(0.1mM)；14.Mn²⁺(0.1mM)；15.Bi³⁺(0.1mM)；16.Fe²⁺(0.1mM)；17.Fe³⁺(0.1mM)。

经实验证明，其它金属阳离子不干扰体系对H⁺的检测。

实施例5H⁺细胞成像图

分别在pH＝7.40,5.00,3.00条件下取30μL芘类荧光探针储备液加入含有贴壁细胞的培养基，置于37℃的5％CO₂培养箱中孵育15min后，用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)轻轻清洗三次，以除去培养基中过量的未进入细胞的探针储备液。将细胞固定后在ZEISS LSM-880激光共聚焦显微镜下，通过线性扫描进行荧光成像。用波长为405nm的激光激发，收集发射波段为400-440nm的蓝色荧光和450-550nm的绿色荧光。如图4，探针在共聚焦荧光成像仪下显示强的绿色荧光，随着pH的减弱，绿色荧光逐渐减弱，蓝色荧光逐渐增强。

实施例6芘类荧光探针的OH^-滴定荧光图

在2ml蒸馏水中加入30μL芘类荧光探针储备液进行OH^-荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测。随着待测样的加入，463nm处的荧光强度逐渐减弱。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λ_ex为365nm和最大荧光发射波长为:λ_em为463nm。

实施例7芘类荧光探针对OH^-响应的的工作曲线

用蒸馏水配制0.01M，0.1M，1M的H⁺溶液，将2ml蒸馏水和30μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，进行滴定实验(pH变化范围7.30–12.79)；以pH为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标绘制图并进行Sigmoidal拟合，求得pK_a＝9.65；通过线性拟合得到最佳线性响应范围为pH 9.41-12.18，回归方程为：F₀-F＝116.02*pH–529.13，线性系数为R²＝0.9955。

实施例8芘类荧光探针对OH^-识别时其他金属阳离子的荧光柱状图

在pH 7.30和pH 8.00的蒸馏水中加入30μL芘类荧光探针储备液，再加入其它的金属阳离子分别测其荧光光谱，绘制不同金属阳离子对应463nm的荧光强度的柱状图，见图7。图7中物质的顺序和浓度分别为：1.空白；2.K⁺(25mM)；3.Na⁺(25mM)；4.Ca²⁺(2mM)；5.Zn²⁺(2mM)；6.Mg²⁺(2mM)；7.Al³⁺(0.2mM)；8.Co²⁺(0.2mM)；9.Cr³⁺(0.2mM)；10.Pb²⁺(0.1mM)；11.Ni²⁺(0.1mM)；12.Cu²⁺(0.1mM)；13.Hg²⁺(0.1mM)；14.Mn²⁺(0.1mM)；15.Bi³⁺(0.1mM)；16.Fe²⁺(0.1mM)；17.Fe³⁺(0.1mM)。

经实验证明，其它金属阳离子不干扰体系对OH^-的检测。

实施例9OH^-细菌成像图

将接种好的大肠杆菌(E.coli)与30μL芘类荧光探针储备液分别在pH 7.30,pH 9.00,pH11.0，pH 12.00的条件下于摇床中共同孵育2h，在激光共聚焦显微镜下观察。固定激发波长为405nm,收集发射波段为450-550nm的绿色荧光。随着pH的增强，绿色荧光逐渐减弱。

实施例10芘类荧光探针的CN^-滴定荧光图

在2ml PBS缓冲液(pH＝10.0)中加入20μL芘类荧光探针储备液进行CN^-荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测。随着待测样的加入，463nm处的荧光强度逐渐减弱。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λ_ex为365nm和最大荧光发射波长为:λ_em为463nm。

实施例11芘类荧光探针对CN^-响应的的工作曲线

用蒸馏水配制0.01M的CN^-溶液，将2ml PBS缓冲液(pH＝10.0)和20μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，逐次加入CN^-进行荧光滴定实验，共加入199μM；以CN^-浓度为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标绘制图，得到CN^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F₀-F＝12.40+132.60*c，c的单位为10^-6mol/L；通过线性拟合得到探针的最佳响应范围为：0–2.0μM，线性系数为R²＝0.9802。

实施例12芘类荧光探针对CN^-识别时其他阴离子的荧光柱状图

在比色皿中加入2ml PBS缓冲液(pH＝10.0)和20μL芘类荧光探针储备液，再加入其它的阴离子(F^-，Br^-，Cl^-，I^-，NO₃^-，SO₄^2-，SCN^-，CO₃^2-，HCO₃^-，HS^-，SO₃^2-，ACO^-，HSO₃^-，S^2-)使其最终浓度为0.1mM，再加入CN^-，使其最终浓度为25μM，分别测其荧光光谱，绘制不同阴离子对应463nm的荧光强度柱状图。

经实验证明，其它阴离子不干扰体系对CN^-的检测。

实施例13芘类荧光探针的HSO₃^-滴定荧光图

在2ml PBS缓冲液(pH＝6.0)中加入20μL芘类荧光探针储备液进行HSO₃^-荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测。随着待测样的加入，463nm处的荧光强度逐渐减弱。仪器参数:激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5.0nm、5.0nm，荧光探针溶液的最大激发波长为:λ_ex为365nm和最大荧光发射波长为:λ_em为463nm。

实施例14芘类荧光探针对HSO₃^-响应的的工作曲线

用蒸馏水配制0.001M的HSO₃^-溶液，将2ml PBS缓冲液(pH＝6.0)和20μL芘类荧光探针储备液加入荧光比色皿中，逐次加入HSO₃^-进行荧光滴定实验，共加入40μM。以HSO₃^-浓度为横坐标，相对荧光强度F₀-F为纵坐标绘制图，得到HSO₃^-浓度的工作曲线，线性回归方程为：F₀-F＝15.90+927.71*c,c的单位为10^-6mol/L；通过线性拟合得到探针的最佳响应范围为：0-0.5μM，线性系数为R²＝0.9903。

实施例15芘类荧光探针对HSO₃^-识别时其他阴离子的荧光柱状图

在比色皿中加入2ml PBS缓冲液(pH＝6.00)和20μL芘类荧光探针储备液，再加入HSO₃^-，使其最终浓度为2μM，然后加入其它的阴离子(F^-，Br^-，Cl^-，I^-，NO₃^-，SO₄^2-，SCN^-，CO₃^2-，HCO₃^-，HS^-，SO₃^2-，ACO^-，CN^-，S^2-)使其最终浓度为0.1mM，分别测其荧光光谱，绘制不同阴离子对应463nm的荧光强度柱状图。

经实验证明，其它阴离子不干扰体系对HSO₃^-的检测。

实施例16HSO₃^-细胞成像图

在pH＝6.00条件下取30μL芘类荧光探针储备液加入含有贴壁细胞的培养基，置于37℃的5％CO₂培养箱中孵育15min后，用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.40)轻轻清洗三次，以除去培养基中过量的未进入细胞的探针储备液。将细胞固定后在ZEISS LSM-880激光共聚焦显微镜下，通过线性扫描进行荧光成像。用波长为405nm的激光激发，收集发射波段为450-550nm的绿色荧光。如图15，探针在共聚焦荧光成像仪下显示强的绿色荧光，随即加入10μM的HSO₃^-，绿色荧光减弱。