一种富勒烯油中C60或C70的含量测定方法与流程

本发明涉及一种化学领域，特别涉及一种富勒烯油中C60或C70的含量测定方法。
背景技术：
：1985年科学家Kroto、Smalley、Curl等人在研究太空深处的碳元素时发现了C60富勒烯，1996年三人因此而获得诺贝尔化学奖。富勒烯与金刚石、石墨同为碳的同素异形体。C60是由60个碳原子组成的球形分子，由12个五边形和20个六边形组成，每个碳原子和相邻的三个碳原子通过SP2杂化成键，因形似足球而被称为―足球烯”。具有笼状碳原子团簇结构的系列分子被统称为—富勒烯，主要有空心富勒烯、内嵌富勒烯、富勒烯衍生物及杂环富勒烯等。常见的C60、C70、C76、C84等种类。富勒烯的多个P轨道构成的大π键共轭体系，使得其具有较强的接受电子的能力，因其独特的结构和理化性质，使其具有优异的清除自由基性能，被称为―自由基海绵”，同时还表现出了优异的抗氧化性能。使其在化妆品材料、生物医药等方面得到广泛关注。萃取，又称溶剂萃取或液夜萃取，利用物质在两种互不相容或微溶的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使物质从一种溶剂内转移到另一种溶剂中。高校液相色谱能够快速高效的对所做样品进行检测分离，使用紫外检测器，进样量为μL量级。紫外检测适用于有机分子具紫外或可见吸收基团，有紫外或可见吸收能力的物质检测，富勒烯C60/70具有明显的紫外吸收，可采用紫外检测器能够快速准确得到物质中富勒烯含量。Biomaterials,Volume33,Issue19,June2012,Pages4936-4946，文章中提出采用HPLC检测小鼠内脏中富勒烯含量，所用流动相溶剂为甲苯和甲醇，组织中提取富勒烯溶剂为乙腈和甲苯，因此文章中萃取和检测方法仅适用于生物组织内提取富勒烯的含量测试。CN201410026246公开一种金属富勒烯定量分析方法，采用紫外可见分光光度法分别测定其吸光度，绘制吸光度-浓度标准曲线，测定未知浓度的待测金属富勒烯有机试剂溶液的吸光度，根据所述标准曲线得出待测金属富勒烯溶液浓度。此技术注重金属富勒烯的检测，只适用于检测溶于有机试剂中金属富勒烯的含量，属于金属富勒烯制备分离纯化过程中的一个步骤。而且金属富勒烯在低浓度情况下紫外吸收峰很弱，高浓度范围时的紫外吸收容易背离朗格缪尔定律，通过紫外检测容易产生较大误差。因此利用紫外检测金属富勒烯的方法只能作为碳灰中金属富勒烯含量的一个粗略估算，不能适用于真正产品的严格检测。EnvironmentalToxicologyandChemistry,Vol.27,No.9,pp.1852–1859,2008文章中提出的是化妆品中富勒烯的检测方法，是针对水溶性富勒烯产品中富勒烯含量的检测方法，所用溶剂为甲苯和乙腈，文章中指出所检测出的产品中富勒烯的含量与产品标注的含量有非常大的差值，因为准确性较差。富勒烯优异的抗氧化特性使得它在生物医药领域应用潜力巨大，将富勒烯分散到高品质食用油中是一种简单有效的剂型给药方式，已经被广泛应用，目前还没检索到油溶性富勒烯产品的含量精确测定方法，尤其适用于空心富勒烯C60，C70的含量测定，因此建立一套简便科学合理的富勒烯油中富勒烯的精确检测方法就显得尤为重要。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种富勒烯油中C60或C70的含量测定方法，该方法能够真实、准确、可靠检测出产品含量且方法具有重复性好，操作简便的优点。本发明是通过下述技术方案实现的：一种富勒烯油中C60或C70含量测定方法，包括如下步骤：(1)对照品标准溶液制备：取富勒烯C60或C70溶解于甲苯溶液中即可；(2)供试品溶液制备：取富勒烯油、水、乙醚加入到分液漏斗中萃取，静止分层，吸出上层液I离心得沉淀物；用乙醚洗涤分液漏斗，再加入甲苯萃取，静止分层，取上层液II；将沉淀物、上层液II置于圆底烧瓶中回收溶剂，残留物定容至甲苯溶液中即可；(3)用紫外分光光度法或高效液相色谱法测定。所述步骤(1)对照品标准溶液为3-15组浓度呈阶梯分布的溶液，对照品标准溶液浓度为0.001-1.0mg/ml。进一步优选，步骤(1)对照品标准溶液为7-10组浓度呈阶梯分布的溶液，对照品标准溶液浓度为0.005-1.0mg/ml。本发明步骤(1)采用先配制母液，然后将母液稀释成不同浓度的标准溶液。进一步优选，步骤(1)对照品标准溶液：取富勒烯C60或C70对照品分别配制成0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml的甲苯标准溶液；或0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml、0.035mg/ml、0.04mg/ml、0.045mg/ml、0.05mg/ml的甲苯标准溶液。上述步骤(1)对照标准溶液的制备呈7-10组阶梯浓度的目的取多个点测试后，标准曲线精度更高，测试范围更广。本发明所述步骤(2)中富勒烯油、水、乙醚的体积比为(2-6):(0.5-2):(1-3)。优选富勒烯油、水、乙醚的体积比为4:1:2。该比例在保证富勒烯全部萃取的情况下尽量少用乙醚溶剂，从而减少溶剂的浪费及降低乙醚使用过多对人体的伤害。本发明步骤(2)所述乙醚可用氯仿或乙酸乙酯代替。进一步优选，步骤(2)供试品溶液的制备：取富勒烯油、水、乙醚体积比4:2:1至于分液漏斗中，充分振摇，放气，静止分层，待上层溶液澄清后，吸出上层液I后离心得沉淀物；再用乙醚洗涤分液漏斗2-4次后加入甲苯充分振摇，静止分层，取上层液II；将沉淀物、上层液II置于圆底烧瓶中旋蒸回收溶剂，残留物定容至甲苯溶液中即可。本发明步骤(3)测定法中所述的紫外分光光度法，包括测定步骤(1)的标准溶液吸光度，并绘制标准曲线；测定步骤(2)供试品溶液的吸光度；根据标准曲线得出供试品溶液中C60或C70的含量，其中波长300nm-500nm。进一步优选波长为335nm和470nm。本发明步骤(3)测定法中所述的高效液相色谱法，包括HPLC测定步骤(1)对照品各个浓度的积分峰面积，绘制富勒烯标准曲线；测定步骤(2)高效液相测定供试品溶液得其峰面积，利用已制定标准曲线来标定富勒烯浓度；其中色谱柱PYE柱，流动相为甲苯溶液，流速0.3-1.5ml/min，紫外检测器波长300nm-400nm，温度15-35℃。进一步优选，所述流速0.5ml/min，紫外检测器波长310nm、温度25℃，进样量20μL。本发明的高效液相色谱法中对照品标准溶液和供试品溶液，进样前需要滤膜滤过，所述滤膜为0.22μm。本发明所述的富勒烯油为现有技术，例如专利CN103826472A、CN101283080A、CN104997646A中公开的富勒烯油的制备或者所用富勒烯油根据BiomaterialsVolume33,Issue19,June2012,Pages4936-4946的制备方法制备。本发明所述的富勒烯为空心富勒烯。富勒烯C60或C70由于结构上的高度对称性，没有重叠的分子轨道，因而是一种稳定的分子，在低浓度富勒烯甲苯溶液的情况下，通过紫外分光光度法或HPLC能够快速准确的得到溶液内富勒烯含量。通过本发明将富勒烯油中的富勒烯充分萃取，得到杂质少、纯度高、溶解性好的富勒烯固体。采用紫外分光光度法或高效液相色谱法对得到的富勒烯进行检测，得到的数据准确可靠、重复性好，操作简便。本方法优点在于使用化学试剂量小、污染小、快速准确的检测出富勒烯的含量。本发明的富勒烯油中富勒烯C60或C70含量测定方法是通过大量试验获得的，通过下述试验例进行阐述：试验例一、供试品溶液提取溶剂筛选试验1.方法：本发明供试品溶液制备中将表1中有机试剂加入分液漏斗后均加入水溶液，富勒烯油，有机相与水相分层，进行萃取处理。表1萃取试剂及结果试剂富勒烯油状态富勒烯状态测试周期甲苯互溶未析出无甲醇互溶析出2Day乙醇分相析出7Day乙腈分相析出7Day乙醚互溶析出30min甲苯和乙腈互溶未析出无2.结果：甲苯：选择甲苯是因为富勒烯易溶于甲苯溶液中(常温下最大溶解度3mg/ml)，经过萃取未能够直接将富勒烯萃取出。甲醇：甲醇相对于测试溶液是不良溶液，稀释后降低富勒烯在植物油中的溶解度，从而析出，但测试周期长。乙醇：乙醇相对于测试溶液是不良溶液，稀释后降低富勒烯在植物油中的溶解度，从而析出，但测试周期长。乙腈：乙腈相对于测试溶液是不良溶液，稀释后降低富勒烯在植物油中的溶解度，从而析出，但测试周期长。乙醚：乙醚经过萃取富勒烯植物油后，富勒烯能够快速析出，测试周期短。乙腈和甲苯：乙腈和甲苯按体积比5:5进行混合使用，经过萃取未能够直接将富勒烯萃取出。3.结论：通过上述分析，本发明采用乙醚做为富勒烯油的萃取溶剂最佳。试验例二:高效液相色谱法色谱柱的选择本发明在色谱柱筛选过程中选择三种色谱柱进行分析，结果如下：Buckyprep-M吩噻嗪基键合硅胶柱是专为分离金属富勒烯而设计的吩噻嗪基键合硅胶柱，金属富勒烯比其他富勒烯在此柱上的滞留尤为强烈，但对空心富勒烯检测精度较低。Buckyprep芘基丙基键合硅胶色谱柱，主要制备分离富勒烯及金属富勒烯，100％甲苯为流动相检测精度相对较低。Cosmosil芘基乙基色谱柱PYE是一种2-(1-芘)乙基键合硅胶填料的反相柱，此柱利用平面芘环结构相互作用来分离同分异构体，分离精确。试验例三:高效液相色谱法流动相的选择在试验过程中单独使用甲醇-水、乙腈-水后，检测结果没有色谱峰；二甲苯毒性较大，不适合产业化检验；甲苯出峰时间适中且峰型对称；甲苯-乙腈和甲醇-乙腈混合溶剂虽然也能够出峰，但是峰型不好，峰形偏宽，分离度低，有前沿峰或拖尾现象，而且混合液需要配置特殊比例才能够互溶，产业检验比较繁琐。综上，对于本发明富勒烯油中富勒烯C60、C70的的流动相选择单相甲苯溶剂。试验例四：富勒烯C60MALDI-TOF图分析1、取少量萃取所得固体(实施例1中所述残留物)，甲苯完全溶解得溶液I，待用。2、用毛细管蘸取少量蒽三酚基质，甲苯完全溶解，得溶液II待用。3、10ul移液枪分别移取4ul溶液I和4ul溶液II于0.5ml试管内，移液枪吹打均匀得溶液III。4、质谱板上选取一点后，用毛细管蘸取溶液III，点到所选点位。5、放于质谱检测器内检测，即得。结果：通过图1可见，本发明方法最终萃取的富勒烯纯度高，没有其他杂质残留。试验例五：本发明供试品制备的富勒烯固体元素分析方法：萃取所得固体(实施例4残留物)真空干燥过夜，称取30mg干燥后固体放于锡舟内，置于C、H、N元素分析仪检测，即得。有机化学样品在氦气作为载气的石英反应管中加氧的状态下，瞬间燃烧，燃烧后的气体产物经过氧化、还原随载气进入色谱柱进行分离，按照保留时间的不同，先后分离出N峰、CO2峰、H2O峰，再经热导检测器进行检测。结果：图2最终萃取的富勒烯纯度高，没有其他杂质残留(例如植物油中的物质)表2试验例六：本发明供试品溶液稳定性及重复性试验1、稳定性试验：本发明经过萃取后得到的富勒烯甲苯溶液，放于10ml样品瓶中密封，于25℃保存放置，24h、48h、72h、一周后，甲苯溶液中未有富勒烯析出，能够稳定存在。2、重复性试验取6份富勒烯油按照本发明方法操作，紫外法测定富勒烯油中富勒烯C60含量，结果见表3表3紫外法测定富勒烯C60含量取6份富勒烯油按本发明的方法操作，HPLC法测定富勒烯油中富勒烯C70含量，结果见表4表4高效液相检测富勒烯C70通过表3、4可见，本发明的重复性RSD％＜3％，该方法的重复性好。试验例七：紫外吸收回收率试验方法：制备含有C60和C70的富勒烯油，质量比；C60：C70＝5：1采用本发明的萃取过程，甲苯完全溶解最终所得固体残留物，进行紫外检测方法，即可。结果：见图11，本发明的萃取方法所得回收率100％。综上所述，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明适用于富勒烯油溶性产品中富勒烯含量的精确检测，尤其适用于空心富勒烯。C60，C70由于结构上的高度对称性，没有重叠的分子轨道，因而是一种稳定的分子。通过本发明将富勒烯油中的富勒烯充分萃取，得到杂质少、纯度高、溶解性好的富勒烯固体。采用紫外分光光度法或高效液相色谱法对得到的富勒烯进行检测，得到的数据准确可靠、重复性好，操作简便且时间短，适合日常产业化检验等优点。附图说明图1：富勒烯C60MALDI-TOF图图2：油溶液萃取得到富勒烯固体元素分析图图3：富勒烯C60紫外吸收曲线图4：富勒烯C60紫外吸收标准曲线图5：富勒烯C70紫外吸收曲线图6：富勒烯C70紫外吸收标准曲线图7：富勒烯C60HPLC标准曲线图8：富勒烯C60HPLC图图9：富勒烯C70HPLC标准曲线图10：富勒烯C70HPLC图图11：紫外吸收回收率曲线图12：本发明供试品制备的流程图具体实施方式下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语―包括”或其变换如―包含”或―包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。实施例1紫外分光光度法测定对照品标准溶液制备：分别精密称取5mg富勒烯C60溶于50ml甲苯溶液中，加入100ml容量瓶中，超声30min使得富勒烯全部溶解后，分别配制成浓度为0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml、0.035mg/ml、0.04mg/ml、0.045mg/ml、0.05mg/ml的甲苯溶液。供试品溶液制备：所用富勒烯油根据BiomaterialsVolume33,Issue19,June2012,Pages4936-4946的制备方法制备。准确量取富勒烯油5ml、乙醚10ml、蒸馏水20ml，分别加入100ml梨形分液漏斗中，充分震摇、放气(乙醚挥发性强)，静置待溶液分层(上层溶液澄清后)，利用吸管吸出上层溶液I于离心管内，进行离心分离(10000r/min、5min)得到沉淀物；用乙醚反复洗涤分液漏斗3次后，向分液漏斗内加入甲苯溶液，充分震摇后分层，取上层溶液II；将上层溶液II和沉淀物，加入到100ml圆底烧瓶中，旋蒸蒸干后将所得沉淀用甲苯溶液定容10ml容量瓶中。测定法：利用分光光度计在波长335nm处测定对照品标准溶液和供试品溶液吸收度。结果：见附图3、4，富勒烯C60：A＝0.0746C，R2＝0.9999，富勒烯油中富勒烯C60含量1.5mg/ml。实施例2对照品标准溶液制备：分别精密称取5mg富勒烯C60溶于50ml甲苯溶液中，加入100ml容量瓶中，超声30min使得富勒烯全部溶解后，分别配制成浓度为0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.02mg/ml、0.025mg/ml、0.03mg/ml、0.035mg/ml、0.04mg/ml、0.045mg/ml、0.05mg/ml的甲苯溶液。供试品溶液制备：所用富勒烯油根据BiomaterialsVolume33,Issue19,June2012,Pages4936-4946的制备方法制备。准确量取富勒烯油5ml、乙醚10ml、蒸馏水20ml，分别加入100ml梨形分液漏斗中，充分震摇、放气(乙醚挥发性强)，静止待溶液分层(上层溶液澄清后)，利用吸管吸出上层溶液I于离心管内，离心分离(10000r/min、5min)得到沉淀物；用乙醚反复洗涤分液漏斗3次后，向分液漏斗内加入甲苯溶液，充分震摇后分层，取上层溶液II；将上层溶液II和沉淀物，加入到100ml圆底烧瓶中，旋蒸蒸干后将所得沉淀用甲苯溶液定容于10ml容量瓶中。测定法：利用紫外分光光度计在波长470nm处测定对照品标准溶液和供试品溶液吸收度。结果：见附图5，6富勒烯C70：A＝0.021C，R2＝0.9999富勒烯油中富勒烯C70含量1.5mg/ml.实施例3高效液相色色谱法测定对照品标准溶液制备：分别精密称取5mg富勒烯C60溶于50ml甲苯溶液中，加入100ml容量瓶中，超声30min使得富勒烯全部溶解后，分别配制成浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的甲苯溶液即可。供试品溶液制备：所用富勒烯油根据BiomaterialsVolume33,Issue19,June2012,Pages4936-4946的制备方法制备。准确量取富勒烯油5ml、乙醚10ml、蒸馏水20ml，分别加入100ml梨形分液漏斗中，充分震摇、放气(乙醚挥发性强)，静止待溶液分层(上层溶液I澄清后)，利用吸管吸出上层溶液于离心管内，进行离心分离(10000r/min、5min)得到沉淀物；用乙醚反复洗涤分液漏斗3次后，向分液漏斗内加入甲苯溶液，充分震摇后分层，取上层溶液II；将上层溶液II和离心所得沉淀物，加入到100ml圆底烧瓶中，旋蒸蒸干后将所得沉淀用甲苯溶液定容10ML容量瓶中。测定法：分别取对照品标准溶液、供试品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱为PYE柱，流动相为甲苯溶液，流速0.5ml/min，紫外检测器波长310nm，温度25℃。结果：见附图7，8富勒烯油中富勒烯C60含量1.5mg/ml实施例4高效液相色谱法测定对照品标准溶液制备：分别精密称取5mg富勒烯C60溶于50ml甲苯溶液中，加入100ml容量瓶中，超声30min使得富勒烯全部溶解后，分别配制成浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的甲苯溶液即可。供试品溶液制备：所用富勒烯油根据BiomaterialsVolume33,Issue19,June2012,Pages4936-4946的制备方法制备。准确量取富勒烯油5ml、乙醚10ml、蒸馏水20ml，分别加入100ml梨形分液漏斗中，充分震摇、放气(乙醚挥发性强)，静置待溶液分层(上层溶液I澄清后)，利用吸管吸出上层溶液于离心管内，进行离心分离(10000r/min、5min)得到沉淀物；用乙醚反复洗涤分液漏斗3次后，向分液漏斗内加入甲苯溶液，充分震摇后分层，取上层溶液II；将上层溶液II和离心所得沉淀物，加入到100ml圆底烧瓶中，旋蒸蒸干后将所得沉淀用甲苯溶液定容于10ml容量瓶中。测定法：分别取对照品标准溶液、供试品溶液各20μL注入高效液相色谱仪，色谱柱为PYE柱，流动相为甲苯溶液，流速0.5ml/min，紫外检测器波长310nm，温度25℃。结果：见附图9,10富勒烯油中富勒烯C70含量1.5mg/ml。前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。当前第1页1 2 3