一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂及检测方法与流程

本发明涉及一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂及检测方法，属于肿瘤标志临床应用与研究领域。

背景技术：

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)分子量为170kD，属于受体酪氨酸激酶的Eb r B家族，由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其正常活化可介导细胞的生长、增殖、分化、黏附以及移动等活动。许多上皮源性肿瘤与EGFR活性增加或异常有关。EGFR通常在人类不同肿瘤中过表达，而且EGFR的过表达与某些肿瘤的恶性程度相关。近年研究发现，在肿瘤的发生和发展过程中，EGFR蛋白的表达不是很稳定，常常出现基因的扩增和重排，导致基因突变使得肿瘤细胞表面的抗原表型发生调变。现研究发现EGFR存在3种胞外型突变体,即EGFRvⅠ、EGFRvⅡ和EGFRvⅢ,与这些突变的受体结合后的EGFR信号通路通常异常激活,引起细胞异常增殖。其中EGFRvⅢ是人类肿瘤中最为常见的突变形式。

EGFRvⅢ与EGFR完整结构比较，EGFRvⅢ分子量为130kD，26个外显子中第2～7个外显子被删除，导致801个碱基对缺失，其删除端由一个新的甘氨酸密码子(GGT)连接，翻译成蛋白质后，胞外区6～273氨基酸被一个甘氨酸残基替代。丧失了胞外配体结合部位的EGFRvⅢ可在没有配体结合的情况下组成性激活酪氨酸激酶，产生自体磷酸化，诱发下游的信号转导途径，引起级联反应，影响肿瘤细胞的生物学行为。

迄今为止，EGFRvⅢ尚未在正常组织中检出，被视为恶性肿瘤特异性表达的EGFR突变体，在脑胶质瘤(阳性率30～50％)、肺癌(阳性率39％)、乳腺癌(阳性率20～36％)、卵巢癌(阳性率75％)、头颈部癌(阳性率42％)、结肠癌(阳性率34％)、前列腺(阳性率100％)、肝癌(阳性率36.8％)、胃癌(阳性率35.2％))等均有发现。EGFRvⅢ只在肿瘤细胞中出现，而在正常组织细胞不表达，所以它是一种很好的肿瘤特异抗原，这使EGFRvⅢ成为一个很好的肿瘤治疗的靶标。EGFRvⅢ与肿瘤患者预后也有一定关系，肿瘤组织EGFRvⅢ的表达水平是判断预后的独立指征，EGFRvⅢ表达高者预后差。

如何准确、快速的检测出各肿瘤组织EGFRvⅢ的表达情况是靶向免疫治疗的关键因素。目前，检测EGFRvⅢ的表达情况主要采用的方法有直接测序法、实时定量PCR法及组织免疫组化法等方法。这些方法各有优势，但存在操作复杂、耗时长、成本相对较大、特异性差等不足之处，尚有改进的必要。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，以及检测方法。利用免疫组化法检测EGFRvⅢ在肿瘤的表达，EGFRvⅢ蛋白的阳性染色定位主要在细胞膜和细胞浆上，表现为棕黄色颗粒；结果采用半定量积分法，每张切片由2位阅片者在盲态情况下判读，此结果可以作为临床医生的诊断依据之一，为临床肿瘤的诊断起预后判断的作用，帮助临床肿瘤的诊断、分类、预后判断以及疗效评估。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，包括抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体(抗体原液)和抗体稀释液；所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体，其制备方法记载在文献Oncotarget.2016 Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.中；所述抗体稀释液，主要成分为Tris缓冲液(pH 7.2)，并含有NaN3和蛋白质，由博士德生物技术有限公司生产，其商品货号为AR1016，商品名称抗体稀释液。

进一步地，所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体(抗体原液)与抗体稀释液的体积比为1:1～5000，优选1:1000～1:4000。

一种检测EGFRvⅢ的方法(免疫组化法)，为：利用上述检测EGFRvⅢ的免疫组化抗体试剂，通过免疫组化方法检测待检测标本组织(为手术或穿刺的肿瘤组织经处理后得到)中的EGFRvⅢ的表达情况，检测结果可以作为临床医生的诊断依据之一，为临床肿瘤的诊断起预后判断的作用，帮助临床肿瘤的诊断、分类、预后判断以及疗效评估(具体实施治疗方案还需再参考患者的临床表现情况)。

进一步地，所述检测结果为EGFRvⅢ的表达值，是通过以下免疫组化的评分方法得出的：EGFRvⅢ的表达值＝细胞膜染色强度分值×细胞膜染色分值+细胞质染色强度分值×细胞质染色分值。所述细胞膜染色强度分值为在细胞膜上染色强度的分值，所述细胞质染色强度分值为在细胞质上染色强度的分值；所述染色强度的分值打分依据为：未染色＝0，弱染色＝1，中等染色＝2，强染色＝3。所述细胞膜染色分值的打分依据为：细胞膜染色细胞数0％～5％对应的分值为0；细胞膜染色细胞数6％～25％对应的分值为1；细胞膜染色细胞数26％～50％对应的分值为2；细胞膜染色细胞数51％～100％对应的分值为3。所述细胞质分值的打分依据为：为细胞质染色细胞数0％～5％对应的分值为0；细胞质染色细胞数6％～25％对应的分值为1；细胞质染色细胞数26％～50％对应的分值为2；细胞质染色细胞数51％～100％对应的分值为3。当EGFRvⅢ的表达值在4分以上时，判断为“EGFRvⅢ表达为阳性”，当EGFRvⅢ的表达值小于4分时，判断为“EGFRvⅢ表达为阴性”(未染色、弱染色、中等染色、强染色的判断，细胞膜染色细胞数的判断，均是本领域技术人员所掌握的常规实验技能)。

所述抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体是由北京大学医学部研制开发(本申请的申请人与其合作，参与研制开发；该抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体，相关内容已经发表文章，其文献信息为：Oncotarget.2016Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.，分子量为150KD，为IgG2a亚型。该抗体是抗人EGFRvⅢ蛋白的小鼠单克隆抗体，可与组织细胞上的EGFRvⅢ抗原特异性结合，并与酶标羊抗小鼠免疫球蛋白聚合物识别并结合，通过免疫组织化学染色，使组织切片中抗原位点上出现黄色或棕黄色着色，使用光学显微镜可观察组织片中EGFRvⅢ的表达情况。

本发明在抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体的基础上，经过实验筛选得到了效果最佳的抗体稀释液(研制出抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体后并不意味着其可以直接作为抗体试剂工作液进行应用，合适的抗体稀释液也是优质的免疫组化产品的关键)，开发出了EGFRvⅢ免疫组化抗体试剂工作液，其与野生型EGFR无交叉反应，具有特异性强、敏感度高等优点，为EGFRvⅢ的靶向治疗提供了良好的前提和基础。

附图说明

图1：抗体与不同抗体稀释液组合成工作液后免疫组化检测结果示意图，其中，a：博士德(AR1016)；b：北京中衫金桥(ZLI-9028)；c：福州迈新(ABD-0030)；d：丹麦Dako(K8007)。图中央下部的字为：F98_EGFRvⅢ。

图2：脑胶质瘤的免疫组化切片，其中，1：星形细胞瘤Ⅱ级；2：少突胶质细胞瘤Ⅱ级；3：间变性星形细胞瘤Ⅲ级；4：间变性少突胶质细胞瘤Ⅲ级；5：胶质母细胞瘤。

图3：不同恶性级别的脑胶质瘤中EGFRvⅢ表达情况，其中，A：EGFRvⅢ表达与组织学类型；B：EGFRvⅢ表达与WHO分级。

图4：EGFRvⅢ与ATRX，MIB1，IDH1R132，突变P53在胶质瘤中的表达的相关性。

图5：抗EGFRvⅢ单克隆抗体的western-blot图，其中，从左至右的条带分别代表F98、F98_EGFR、F98_EGFRvIII、U251、U251_EGFRvIII。

图6：EGFR和EGFRvⅢRT-PCR跑胶及测序分析，其中，1:F98；2:F98_EGFR；3:F98_EGFRvIII；4:U251；5:U251_EGFRvIII。

图7：现有的靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体的免疫荧光实验结果图。

图8：抗EGFRvⅢ的单克隆抗体的免疫荧光实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实施例1抗体稀释液的筛选

免疫组化试验步骤：组织片在60℃烤箱烤40分钟后，在二甲苯中浸泡10分钟，从而去除石蜡，然后通过在100％乙醇内浸泡2分钟两次，然后在95％的乙醇溶液内浸泡2分钟两次，在85％的乙醇溶液内浸泡2分钟和在75％的乙醇溶液内浸泡2分钟，进行水化，最后用蒸馏水洗涤2分钟，共计5次。

在高压锅内加入膜抗原修复液(225ml双蒸水:4.5ml柠檬酸:20.5ml柠檬酸三钠)，高压锅开盖在电磁炉上将组织抗原修复液加热至沸腾，将切片全部浸没入修复液中，盖上锅盖，高压2分后将高压锅离火自然冷却至室温后取出切片，PBS溶液清洗5次，每次2分钟。通过新鲜配置过氧化物酶阻断液(30％H₂O₂:双蒸水＝1:9)37℃烘箱孵育30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS溶液清洗5次，每次2分钟。小心甩掉并拭去组织上及周围过多的液体，在免疫组化笔圈定的组织区域内加100ul5％山羊血清37℃孵育30分钟，以封闭非特异性抗原。

勿洗，滴加一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2分钟，共5次。滴加适量辣根过氧化物酶标记二抗工作液Dako K5007，37℃孵育30分钟。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2分钟，共5次。经显色剂显色1～2分钟，镜下观察适时终止显色，苏木素染核1分钟，自来水冲洗多余的苏木素后，再经脱水，透明，封片，显微镜下观察并拍片。

所述一抗工作液由一抗(实施例7制备，浓度5.3μg/μl)和抗体稀释液组成，二者体积比1:2000。

所用一抗是由北京大学医学部研制开发的(本申请的申请人与其合作，参与研制开发；该抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体，相关内容已经发表文章，其文献信息为：Oncotarget.2016Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.，分子量为150KD，为IgG2a亚型。

本实施例考察了四种抗体稀释液，分别为：北京中衫金桥(ZLI-9028)、福州迈新(ABD-0030)、博士德(AR1016)、丹麦Dako(K8007)。

显微镜拍片结果如图1所示，由图可见，由博士德(AR1016)组合的抗体工作液，背景干净，染色清晰，特异性强，敏感度高，而其他三种抗体稀释液组合的抗体工作液均显现出交叉反应。因此，博士德(AR1016)是最适合抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体的抗体稀释液。

F98_EGFRvⅢ和F98细胞分别是EGFRvⅢ蛋白表达阳性和阴性的褐鼠脑胶质瘤细胞系，均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

实施例2通过免疫组化的方法获得可供读取的病理片

首先将手术或者穿刺获得的肿瘤标本固定在10％福尔马林中，接着用梯度浓度的乙醇进行充分脱水，脱水后的组织再经二甲苯透明和石蜡透蜡，之后用石蜡包埋，待蜡块凝固后，切成3μm厚的片子。免疫组化试验步骤可按实施例1执行。

计算组织病理片中的EGFRvⅢ的表达值。

EGFRvⅢ的表达值＝细胞膜染色强度分值×细胞膜染色分值+细胞质染色强度分值×细胞质染色分值。所述细胞膜染色强度分值为在细胞膜上染色强度的分值，所述细胞质染色强度分值为在细胞质上染色强度的分值；所述染色强度的分值打分依据为：未染色＝0，弱染色＝1，中等染色＝2，强染色＝3。所述细胞膜染色分值的打分依据为：细胞膜染色细胞数0％～5％对应的分值为0；细胞膜染色细胞数6％～25％对应的分值为1；细胞膜染色细胞数26％～50％对应的分值为2；细胞膜染色细胞数51％～100％对应的分值为3。所述细胞质分值的打分依据为：为细胞质染色细胞数0％～5％对应的分值为0；细胞质染色细胞数6％～25％对应的分值为1；细胞质染色细胞数26％～50％对应的分值为2；细胞质染色细胞数51％～100％对应的分值为3。当EGFRvⅢ的表达值在4分以上时，判断为“EGFRvⅢ表达为阳性”，当EGFRvⅢ的表达值小于4分时，判断为“EGFRvⅢ表达为阴性”。

经计算，本实施例中，EGFRvⅢ的表达值为≥4，确定患者EGFRvⅢ表达为阳性。本发明EGFRvⅢ定位清晰，EGFRvⅢ只在细胞膜和细胞浆上检测出阳性表达，并且本发明中使用抗EGFRvⅢ单克隆抗体效价高，具有灵敏度高，特异性好的特点。

为了进一步确立本研究建立检测方法的诊断价值，在临床上进行验证。

实施例3诊断标准的确定

收集北京三博脑科医院自2011年～2016年手术切除的脑胶质瘤组织标本99例，其中男性53例，女性46例，年龄17～69岁，中位年龄43岁。患者术前均未行放化疗等任何治疗，术后经病理检查确诊的石蜡包埋病理组织标本，其中星形细胞瘤II级、间变性星形细胞瘤Ⅲ级、少突胶质细胞瘤II级和间变性少突胶质细胞瘤Ⅲ级均20例,胶质母细胞瘤19例(组织切片如图2所示)。通过免疫组化常规方法使用实施例1中的抗体工作液(抗体稀释液为博士德(AR1016))检测患者肿瘤标本的EGFRvⅢ，结果如表1、图3所示，根据公式计算出每个病理片中EGFRvⅢ的表达值(见实施例2)。

以EGFRvⅢ的表达值在4分及4分以上确定为患者EGFRvⅢ表达为阳性，当EGFRvⅢ的表达值小于4(不包含4)，表示患者的EGFRvⅢ表达为阴性。根据表1和图3所示：99例脑胶质瘤EGFR阳性率为(54)54％，其中星形II级和少突II级阳性率占40％(16/40)。星形Ⅲ级和少突Ⅲ级阳性率占55％(22/40)。胶母细胞瘤阳性率占80％(16/20)。相似的，患者表达EGFRvⅢ占总数的34(34％)，其中星形II级和少突II级阳性率占22.5％(9/40)。星形Ⅲ级和少突Ⅲ级阳性率占30％(12/40)。胶母细胞瘤阳性率占65％(13/20)。由此可见，EGFR高表达患者中，EGFRvⅢ阳性表达占62.96％。且EGFR和EGFRvⅢ阳性着色部位主要位于细胞膜和细胞浆。患者脑胶质瘤的恶性级别与EGFR及EGFRvⅢ的阳性率呈正相关(both P<0.01)。

为了阐明EGFRvⅢ在人神经胶质瘤中的临床意义，我们比较EGFRvⅢ表达与临床病理特征，包括年龄，性别，组织学类型，WHO级别，TP53突变，MIB1表达，IDH1R132突变状态和ATRX表达(表2)。EGFRvⅢ表达与组织学类型(P<0.001，图3A)和WHO分级(P＝0.001，图3B)呈正相关。此外，TP53突变状态，ATRX表达和MIB1表达被报告为胶质瘤患者的不利的预后指标。我们的结果还表明EGFRvⅢ表达与这些指标正相关(所有P<0.05，表32，图4)。IDH1R132突变在低级胶质瘤和继发性成胶质细胞中是常见的，并且具有该突变的试剂具有更长的存活时间。本发明证实所有脑胶质瘤均为原发性肿瘤且IDH1R132突变为阴性。EGFRvⅢ表达与IDH1R132突变状态负相关(P＝0.031)。这些结果表明EGFRvⅢ趋向是侵略性人类神经胶质瘤的不利因素。

表1 EGFR和EGFRvⅢ在胶质瘤中的表达

表2脑胶质瘤患者EGFRvⅢ表达与临床病理特征的相关性

实施例4抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体的western-blot鉴定

提取各细胞总蛋白，Bradford法定量。上样后10％SDS-PAGE电泳后电转转移至PVDF膜上。室温下用5％的脱脂奶粉封闭2h后滴加相应一抗4℃过夜，洗膜，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗室温2h,漂洗后进行化学发光检测，摄像。实验过程中使用能够同时识别EGFR和EGFRvⅢ蛋白的EGFR抗体和只识别EGFRvⅢ蛋白的EGFRvⅢ抗体。此实验目的用于鉴定细胞系F98、F98_EGFR、F98_EGFRvⅢ、U251和U251_EGFRvⅢ中的EGFRvⅢ蛋白的稳定表达。

结果如图5所示，本发明的单克隆抗体western-blot鉴定结果，通过western-blot鉴定，单克隆抗体特异性地与EGFRvⅢ蛋白结合，且与野生型EGFR无交叉反应。其中，M是蛋白分子量标准(kDa)。F98_EGFRvⅢ、F98_EGFR和F98三种细胞分别是EGFRvⅢ蛋白表达阳性、阴性和阴性的褐鼠脑胶质瘤细胞系，均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。U251是表达野生型EGFR阳性，U251_EGFRvⅢ是表达EGFRvⅢ蛋白阳性的人脑胶质瘤细胞系，均购自北京协和医学院细胞资源中心，稳转U251_EGFRvⅢ细胞。

实施例5反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及DNA测序分析

RT-PCR反应可以更好验证wild-typ EGFR和EGFRvⅢ的表达。Total-RNA从细胞提取后反转录为cDNA，PCR-system扩增目的片段。用于RT-PCR反应的EGFR和EGFRvⅢ引物序列为同一序列：(Forward)5'-CTT CGG GGA GCA GCG ATG CGA C-3'和(Reverse)5'-ACC AAT ACC TAT TCC GTT ACA C-3'。PCR扩增反应条件如下：95℃1min；95℃15s、60℃15s、72℃30s、72℃7min、4℃∞,共40个循环。同时Gapdh作为内参。待反应结束后2％琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物进一步测序验证。每个PCR产物进行双向测序，经测序图比较，判断对应样本是否发生基因突变，并且排除是基因多态性的情况。

结果如图6所示，本发明的RT-PCR跑胶结果显示：F98_EGFR和U251细胞均检测到EGFR基因表达(1044bp)，F98_npEGFRvⅢ细胞检测到EGFRvⅢ基因表达(243bp),而U251_EGFRvⅢ细胞同时表达EGFR(1044bp)和EGFRvⅢ(243bp)基因。正常F98细胞系未检测到任何基因表达。测序图谱也可以清楚的观察到突变型EGFRvⅢ的突变位点。

实施例6抗EGFRvⅢ的单克隆抗体与现有的EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体的免疫荧光实验

现有的靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体的免疫荧光实验结果如图7所示，本发明中抗EGFRvⅢ的单克隆抗体的免疫荧光实验结果如图8所示。市场上的靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体的免疫荧光实验，该靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体的特异性较差，该靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体除能够结合EGFRvⅢ外，亦能结合野生型F98EGFR。该靶向EGFRvⅢ的兔源多克隆抗体与野生型F98EGFR存在交叉反应。本发明的抗EGFRvⅢ的单克隆抗体具有良好的靶标特异性，其只与EGFRvⅢ结合，且不和野生型F98EGFR结合，该抗EGFRvⅢ的单克隆抗体与野生型F98EGFR无交叉反应。因此，本发明中使用的抗EGFRvⅢ的单克隆抗体的特异性好，可以很好的特异性的与EGFRvⅢ结合。

实施例7抗EGFR突变体Ⅲ单克隆抗体的制备(记载在文献Oncotarget.2016Dec 22.doi:10.18632/oncotarget.14088.中)

(一)杂交瘤细胞系的建立

步骤一、实验材料准备：

1、免疫原：以EGFRvⅢ为靶目标，采用化学合成的方式制备三条氨基酸多肽，其中三条氨基酸多肽的序列分别为LEEKKGNYVVTDHC；EKKGNYVVTDHC；KKGNYVVTDHC。每条氨基酸多肽的纯度要求大于90％，三条多肽与KLH偶联制备成免疫原。

2、培养基：DMEM培养基购于Hyclone公司；HAT、HT选择培养基、降植烷购于sigma公司。

3、实验动物：三只Balb/c小鼠分别编号为：1#、2#、3#，均为8-12周龄，雌性，SPF级动物培养。

4、其他材料：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂购于Sigma公司；PEG4000购于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗体购于Jackson Immune公司；其余试剂均为国产分析纯产品。

步骤二、动物免疫

1)基础免疫：将抗原与福氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，分点皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量为80-120μg，较佳的为100μg。

2)加强免疫：加强免疫采用抗原与福氏不完全佐剂的乳化液。在进行细胞融合前3天，经腹腔注射含100-200ug抗原的生理盐水溶液，较佳的为150ug抗原的生理盐水溶液。

3)尾血检测：取免疫小鼠的尾血进行间接ELISA法检测。间接ELISA法的操作步骤如下：各取三条多肽100ng的包板，以三只免疫后的小鼠的尾血作为一抗进行孵育，之后每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后测定450nm OD值。

结果：以2#免疫小鼠的尾血作为一抗对所有的三条多肽反应的450nm OD读值为最高。因此选用2#免疫小鼠的脾细胞进行杂交瘤细胞的制备。

步骤三、杂交瘤细胞的制备

按常规方法收集小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按20:1至5：1的比例以400-600g/L的PEG4000进行融合。小鼠的脾细胞与SP2/0细胞的比例，较佳的为10:1，PEG4000较佳的浓度为500g/L。用HAT培养液选择培养，融合后10～15天，取上清采用间接ELISA法筛选分泌抗抗原的杂交瘤细胞株。对所得阳性克隆杂交瘤细胞株采用有限稀释法进行亚克隆。间接ELISA法的操作步骤如下：各取三条多肽100ng的包板，用免疫小鼠尾血1:2000作为阳性对照，无克隆生长的培养基上清和正常小鼠血清作为阴性对照，每孔加1:2000HRP-山羊抗小鼠IgG 100μl，最后测定450nm OD值。凡OD₄₅₀值大于阴性对照2倍以上者，即可初步判定为阳性克隆。

步骤四、杂交瘤细胞系的建立

重复步骤2，进行2次细胞融合，经过4次亚克隆和间接ELISA筛选，得到4株稳定分泌抗EGFR突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，四株单克隆抗体杂交瘤细胞系的编号分别：4G1、4D12、7C7、1G8。

步骤五、应用上述杂交瘤细胞系所得单抗的效价检测

1)细胞培养液上清效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞培养上清效价为：1：50000～1：100000。其中以4G1的信号最强。

2)小鼠腹水效价测定：间接ELISA法检测上述杂交瘤细胞制备的腹水效价为：1：500000～1：1000000。其中以4G1的信号最强。

步骤六、杂交瘤细胞系的传代培养

将上述杂交瘤细胞系在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中继续进行培养、传代，培养到10代后，杂交瘤细胞系仍然能够生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10000以上。本发明所得杂交瘤细胞系能够稳定传代，可以持续、稳定分泌抗EGFRvⅢ的单克隆抗体。

获得产生所需的单克隆抗体的杂交瘤细胞后，将一部分杂交瘤细胞保存。保存方法如下：准备材料，细胞：取对数生长期的细胞；10％二甲基亚砜保护液(二甲基亚砜能损坏滤器，而又被高压所破坏，所以不能过滤或高压消毒。其本身就是毒品，无菌)：含10％二甲基亚砜、20％灭活胎牛血清，70％RPMI-1640液；20％FBS-1640培养液：含青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml；灭菌的2ml安瓶等。

2、操作方法，(1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10％FBS-1640液，使细胞悬浮。(2)1000rpm/min离心10min，去上清。细胞沉淀用10％二甲基亚砜保护液制成悬液，使成1.0×10⁷细胞/ml。(3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95％以上。(4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0.5ml～1.0ml，熔封安瓶。(5)放4℃×2h。(6)放液氮罐气态部分(-70℃)15h。(7)转入液氮部分。

(二)抗EGFRvⅢ的单克隆抗体的制备

选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接种编号为4G1的杂交瘤细胞，每只小鼠1×10⁶～2×10⁶个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。

将腹水离心(13000rpm/min 30分钟)，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用Protein G-Sepharose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为：pH＝2.7，20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗EGFRvⅢ的单克隆抗体原液(浓度5.3μg/μl)。

附：部分缩略语、英文和关键术语定义：

EGFR：epidermal growth factor receptor。

EGFRvⅢ：epidermal growth factor receptor variantⅢ。

PBS：磷酸盐缓冲液。

术语“免疫组化”指的是应用免疫学基本原理，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、半定量研究。

术语“转移”指的是肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或其它器官，形成于原发部位肿瘤相同类型的肿瘤，这个过程称为转移。

术语“穿刺”指的是就是借助空心针这一器械，对器官的可疑病灶(如：肿块、增厚区域、钙化灶等)穿刺取出部分组织进行检查。

术语：“肿瘤”指的是机体在各种因素作用下，局部组织的某一个细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。学界一般将肿瘤分为良性和恶性两大类。

术语“患者”指的是经过根除性肿瘤切除术或者部分根除性肿瘤切除术的病人。

术语“肿瘤标本”指的是通过手术或穿刺获得的乳腺肿瘤组织，该组织接着进行固定、脱水、透明与浸蜡、石蜡包埋和再经石蜡切片获得用于免疫组化检测的肿瘤标本组织。