一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法与流程

本发明涉及分析化学和生命科学领域，具体涉及一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法。

背景技术：

血清具有维持血液的正常粘度、酸碱度、渗透压等作用，血清中的蛋白质来源几乎与所有细胞、组织、器官有关，从而可以直接反映机体的病理和生理状态，是疾病诊断和生物标志物发现的重要标本。与组织蛋白和细胞蛋白相比，血清蛋白种类繁多，性质各异，还存在大量的蛋白质剪切体、翻译后修饰、降解片段。另外，血清蛋白质的丰度差异巨大(蛋白浓度范围跨越10个数量级)，高丰度蛋白占据蛋白总量的99％以上，严重干扰低丰度蛋白质的检测和鉴定。因此在进行蛋白组学研究中，有必要先去除血清中的高丰度蛋白，以降低高丰度蛋白对低丰度蛋白质的掩盖作用，提高灵敏度，有助于更好地鉴定其他蛋白，促进低丰度蛋白质的检出。

目前常用的技术有蛋白质沉淀法、亲和技术等。蛋白质沉淀法采用乙腈、乙醇、丙酮等以不同程度地沉降血清中的高丰度蛋白，但是该方法的特异性不高；亲和技术利用蛋白质和其配体或抗体间的相互作用来特异结合白蛋白、IgG等高丰度靶蛋白，特异性高，但是该方法的成本增加，且值得注意的是，现有的商业化产品多针对物种来源为人和鼠的血清而开发，使其应用受限。

而目前尚无肉鸡血清蛋白质组鉴定方法的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法，利用胶内酶解结合质谱技术以高通量鉴定肉鸡血清蛋白的方法，能够有效降低血清高丰度蛋白对质谱分析时的干扰，增加检出蛋白的数量和种类，解决肉鸡物种去除高丰度蛋白的方法受限问题，为进一步开展肉鸡血清蛋白与肉鸡营养、肉鸡免疫的研究提供方法依据。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种用于肉鸡血清蛋白质组的鉴定方法，采用胶内酶解的方法肉鸡血清蛋白进行分级分离，通过nano-HPLC-MS/MS进行分析，并获得蛋白表达谱，然后通过GO分析获得蛋白的功能和。

具体实现步骤如下：

(1)血清样品采集：收集n只正常肉鸡的血液，置于不含肝素的负压管中，负压管在冰上凝集15-20min，在温度为4-8℃、离心力为1600-1800g条件下离心时间15-20min后取上清液，即为所需的n个血清样品，获得的血清样品进行蛋白定量；

(2)SDS-PAGE电泳：①取10～30μg蛋白进行质量分数为10～15％的SDS-PAGE电泳，电泳条件：60～90V，20～30min，90～110V电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳；②用考马斯亮蓝染色方法对步骤①获得的凝胶进行染色：将凝胶置于质量分数为0.1％R-250染色液中，25-40℃摇床上振荡染色1～2h，脱色液脱色30min～1h，超纯水水洗，每30-40min换水一次，至凝胶背景脱净、条带清晰为止；所述染色液为乙醇、乙酸和水组成，其中乙醇和乙酸体积比在1:1～1:4，含质量分数为0.1～0.125％的R-250，脱色液为乙醇、乙酸和水组成，其中乙醇和乙酸体积比在1:1～1:4；

(3)蛋白凝胶胶内酶解：①高丰度蛋白40～70kDa，20～25kDa按照条带大小切成1～2mm³大小的胶块，其余蛋白条带按照分子量的分布分别切成1～2mm³大小的胶块；②步骤①中的凝胶用100-200μl脱色液脱色2-3次，15-20min，可重复脱色，直到考马斯亮蓝颜色脱尽为止，弃上清，于真空浓缩冻干机中冻干凝胶；所述脱色液为体积比为50:50的乙腈和25-100mM NH₄HCO₃溶液组成；③加入10-15mM，体积100-200μl DTT溶液，37-56℃恒温箱中孵育45min-1h，弃废液；④加入一定体积的50-100mM碘乙酰胺溶液，使得碘乙酰胺的物质的量5倍于步骤③中所加DTT的物质的量，室温暗反应30-45min，弃废液；⑤加入100-200μl脱色液清洗2-3次，每次10-15min，于真空浓缩冻干机中冻干凝胶；⑥加入10-15μl胰酶溶液，于4℃或冰水混合物上放置20-30min，待凝胶溶胀；⑦加入15-20μl,25-100mM NH₄HCO₃溶液浸没凝胶，37℃-40℃孵育过夜；⑧加入50-100μl提取液，所述提取液为1-5％甲酸溶液或三氟乙酸溶液，37℃-40℃孵育30min-1h，取上清转移至干净的离心管中；⑨胶块中再次加入50-100μl提取液，所述提取液为体积比为50:50的乙腈和1-5％甲酸溶液或三氟乙酸溶液；⑩步骤⑧和⑨的两次提取液合并，于真空浓缩冻干机中浓缩冻干，得到肽段样品；

(4)样品质谱分析：将步骤(3)所获得的肽段样品，加入10-15μl,0.1-0.5％甲酸溶液，进行质谱分析，获得肽段及其碎片离子的质荷比。

所述样品质谱分析如下：

液相色谱条件：采用液相色谱系统，该液相色谱系统含二元溶剂管理器、自动进样器；色谱柱为C18柱，规格为0.075×150mm，5μm，进样量：1-5μL；上样流动相：3-5％乙腈+0.1％甲酸水溶液；分离流动相：A为3-5％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸水溶液，B为90-95％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸溶液；以梯度洗脱条件对肽段混合物进行分离，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；

质谱条件：应用串联飞行时间质谱系统进行检测，条件为电喷雾nanoESI离子源，扫描方式：正离子扫描模式，设置干燥气流速和去簇电压，MS扫描范围m/z 350～1250，扫描速率为4-5spectrum/s，MS/MS扫描范围m/z 100～1500，扫描速率为20-30spectrum/s，其中母离子动态功能设置排除时间为20s 20-30s，在数据依赖模式下，选择丰度最高的40-50个母离子进行碰撞，其中丰度绝对阈值：150-200cps，价态满足2+～4+，碰撞能量随质量数在目标值±10V范围内自动调整。

所述数据检索如下：采用搜索引擎进行检索，数据库来源为蛋白数据库，种属选择Gallus gallus，样品类型为Identification，半胱氨酸修饰选择Iodoacetamide，胰酶酶切，仪器来源为Tripple TOF 6600，蛋白水平FDR(false discovery rate)设置为1％。

所述Gene Ontology分析如下：对鉴定的蛋白进行Gene Ontology分析，采用生物信息学工具AmiGO v1.8进行富集分析，得到血清蛋白组的细胞组分、分子功能及所参与的生物学过程。

所述n为5的整倍数。

所述液相色谱条件中的梯度洗脱条件：0～0.5min为95％变化至92％A相，0.5-40min线性变化至70％A相，40-48min线性变化至10％A相并保持6min，再切换95％A相并保持6min；流速为0.3μl/min。

所述质谱条件中，干燥气流速3psi，去簇电压80V。

本发明对n个血清样本进行蛋白质组分析过程中，将n个样本进行等质量混合，以消除个体差异，并进行两次胶内酶解及液质联用分析，以确保获得可靠的数据。

本发明获得的血清样品可来自于21日龄后至屠宰前所有生长时期内的肉鸡样本。

本发明具有的效果是：本发明所采用的胶内酶解方法过程简易，成本低，同时采用纳流高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用的蛋白质组学研究平台，可以实现对复杂样品的高通量的分离，及高灵敏度的检测，所鉴定的蛋白组经分析后发现在免疫应答、氧化应激和细胞表面受体信号途径中富集，这为进一步开展肉鸡血清蛋白质组的研究工作提供了依据。。

附图说明

图1为本发明方法的实现流程图；

图2为本发明中肉鸡血清SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明中胶内酶解后液质联用分析的总离子流色谱图；

图4为本发明中两次重复获得的蛋白鉴定结果韦恩图；

图5为本发明中肉鸡血清蛋白质组的GO分析结果。

具体实施方式

如图1所示，本发明方法的具体实现过程如下：

(1)血清样品采集：收集5只正常肉鸡的血液，置于不含肝素的负压管中，负压管在冰上凝集15-20min，在温度为4-8℃、离心力为1600-1800g条件下离心时间15-20min后取上清液，获得的血清样品进行蛋白定量，并等质量混合。

(2)SDS-PAGE电泳：①取20μg蛋白进行质量分数为12％的SDS-PAGE电泳，电泳条件：80V电泳30min后，110V电泳直到溴酚蓝到达凝胶前缘时即可结束电泳；②用考马斯亮蓝染色方法对步骤①获得的凝胶进行染色：将凝胶置于质量分数为0.1％R-250染色液中，25-40℃摇床上振荡染色2h，脱色液脱色1h，超纯水水洗约4h，每30min换水一次，至凝胶背景脱净、条带清晰为止；所述染色液为体积比为25:10:65的乙醇、乙酸和水组成，含质量分数为0.1％的R-250，脱色液为体积比为45:10:45的乙醇、乙酸和水组成；图2展示的是肉鸡血清SDS-PAGE电泳图，血清白蛋白(约70kDa)和载脂蛋白(约52kDa)占血清总蛋白含量高，从图中可以看出55～72kDa的条带显色最明显，说明该部分的蛋白浓度最高，丰度高，质谱分析结果亦鉴定为血清白蛋白和载脂蛋白。

(3)蛋白凝胶胶内酶解：①高丰度蛋白按照条带大小切成约1mm³大小的胶块，其余蛋白条带按照分子量的分布分别切成约1mm³大小的胶块；②步骤①中的凝胶用100μl脱色液脱色两次，每次15min，可重复脱色，直到考马斯亮蓝颜色脱尽为止，弃上清，于Labconco中冻干凝胶；所述脱色液为体积比为50:50的乙腈和50mM NH₄HCO₃溶液组成；③加入100μl 10mM DTT溶液，56℃恒温箱中孵育45min，弃废液；④加入100μl 50mM碘乙酰胺溶液，室温暗反应30min，弃废液；⑤加入100μl脱色液清洗两次，每次10min，于Labconco中冻干凝胶；⑥加入15μl胰酶溶液(10ng/μl)，于4℃放置30min，待凝胶溶胀；⑦加入15μl 50mM NH₄HCO₃溶液浸没凝胶，37℃孵育过夜；⑧加入50μl提取液，所述提取液为5％甲酸溶液，37℃孵育1h，取上清转移至干净的离心管中；⑨胶块中再次加入50μl提取液，所述提取液为体积比为50:50的乙腈和5％甲酸溶液；⑩步骤⑧和⑨的两次提取液合并，于Labconco中浓缩冻干。

(4)样品质谱分析：

将步骤(2)所获得的样品，加入10μl 0.1％甲酸溶液，待质谱分析。

液相色谱条件：采用AB Sciex公司ekspert nano LC液相色谱系统，该系统含二元溶剂管理器、自动进样器；色谱柱为C18柱，规格为0.075×150mm，5μm，进样量：1-5μL；上样流动相：5％乙腈+0.1％甲酸水溶液；分离流动相：A为5％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸水溶液，B为90％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸溶液；梯度洗脱条件：0～0.5min为95％变化至92％A相，0.5-40min线性变化至70％A相，40-48min线性变化至10％A相并保持6min，再切换95％A相并保持6min；流速为0.3μl/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；

质谱条件：应用AB Sciex Tripple TOF 6600串联飞行时间质谱系统进行检测，其条件为电喷雾nanoESI离子源，扫描方式：正离子扫描模式，干燥气流速3psi，去簇电压80V，MS扫描范围m/z 350～1250，扫描速率为4spectrum/s，MS/MS扫描范围m/z100～1500，扫描速率为20spectrum/s，其中母离子动态功能设置排除时间为20s，在数据依赖模式下，选择丰度最高的40个母离子进行碰撞(丰度绝对阈值：150cps，价态满足2+～4+)，碰撞能量随质量数在目标值±10V范围内自动调整。图3展示了血清样品经胶内酶解后的1个馏分进样分析后得到的总离子流色谱图，横向坐标表示出峰时间，纵向坐标表示峰的高度。

(5)数据检索：

采用Protein Pilot搜索引擎进行检索，数据库来源为Swissprot蛋白数据库(http://www.uniprot.org/downloads)，种属选择Gallus gallus，样品类型为Identification，半胱氨酸修饰选择Iodoacetamide，胰酶酶切，仪器来源TrippleTOF 6600，蛋白水平FDR(false discovery rate)设置为1％。图4展示两次重复下鉴定到的蛋白信息，从图中可以看出，在两次胶内酶解及液质联用分析中被鉴定到的蛋白有551个，各自有84和258个蛋白唯一出现于一次鉴定中，总计鉴定蛋白数目893个。

(6)Gene Ontology分析：对鉴定的蛋白进行Gene Ontology分析，采用生物信息学工具AmiGO v1.8进行富集分析，讨论血清蛋白组的细胞组分、分子功能及所参与的生物学过程。血清是反映机体状态的重要生物样本，血清蛋白组学的研究对象是血清中出现的全部蛋白质，包括：组织分泌蛋白、免疫球蛋白、远程配体与受体蛋白、局部配体与受体蛋白、一过性蛋白、组织漏出蛋白、异常分泌蛋白和外源性蛋白等。图5展示的是血清蛋白组在细胞组分、分子功能和生物学过程三方面的GO注释，横坐标为蛋白数目，纵坐标为各类注释。由图5可知，血清蛋白组主要组成了细胞的质膜、膜内结构、细胞质基质、线粒体和血液小分子，发挥了分子结合功能，包括与核苷酸、蛋白、激酶、碳水化合物、细胞外基质的结合功能，以及酶的调节功能，参与到蛋白、脂肪和碳水化合物的代谢过程中，在免疫应答、氧化应激和细胞表面受体信号途径，这些重要的生物学过程中亦有蛋白被鉴定到，这为进一步开展肉鸡血清蛋白质组的研究工作提供了依据。

本发明说明书未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。