一种肿瘤组织体外病理染色试剂盒的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地涉及一种肿瘤组织体外病理染色试剂盒。

背景技术：

目前，肿瘤已是威胁人类健康的一种全球性疾病，研发高效地用于肿瘤早期、微小转移灶及淋巴结转移的检测药物对于延长患者的生存周期及生存质量至关重要。

近年来，随着肿瘤基因组学和分子药理学的飞速发展，新型的肿瘤靶向药物的研发取得了不错的研究成果，但是许多靶向药物的适应症范围有限，且价格昂贵，副作用也不是十分明确。Cetuximab，中文称作“西妥昔单抗”，属于嵌合型IgG1单克隆抗体，分子靶点为表皮生长因子受体(EGFR)，其中文药品名通称为“爱必妥”，是一种主要用于治疗晚期结肠癌的药物。该药的抗肿瘤机制主要是其可以以高出内源性配体5-10倍的亲和力与表皮生长因子受体(EGFR)特异结合，可阻碍内源EGFR配体的结合，从而抑制受体功能，进一步诱导EGFR内吞从而导致受体数量的下调，抑制细胞的增殖、血管生成、细胞的入侵及转移等等。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的是提供一种肿瘤组织体外病理染色试剂盒，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供一种肿瘤组织体外病理染色试剂盒，其包括：

(1)活性成分Cetuximab；

(2)能够与Cetuximab偶联并保持Cetuximab活性的荧光标记物。

其中，所述的Cetuximab，中文称作“西妥昔单抗”，属于嵌合型IgG1单克隆抗体，分子靶点为表皮生长因子受体(EGFR)，其中文药品名通称为“爱必妥”，是一种主要用于治疗晚期结肠癌的药物，常规市售可得。

其中，所述的肿瘤包括各类良性肿瘤、恶性肿瘤，以及癌前病变组织。所述的肿瘤更优选包括肺癌、结直肠癌以及食管癌中的一种或几种。

其中，所述的荧光标记物为本领域常规，只要其能够与Cetuximab偶联并保持Cetuximab的活性即可，优选包括FITC(fluorescein isothiocyanate，异硫氰酸荧光素)、IRDye800、ICG(吲哚菁绿)、花菁染料和Cy类荧光染料中的一种或几种。

其中的Cy类荧光染料为本领域的常规试剂，包括Cy7、Cy5.5、Cy3及其衍生物等，市售可得。

如本领域常规，所述的肿瘤组织体外病理染色试剂盒还可以包括用于肿瘤组织体外病理染色的各类常规试剂和/或仪器，如苏木-伊红染色液、组织包埋剂和PBS缓冲液等。

为了增加产品使用的方便性，在本发明的一较佳实例中，将上述能够与Cetuximab偶联并保持Cetuximab活性的荧光标记物与Cetuximab配制成Cetuximab-FITC溶液，所述肿瘤组织体外病理染色试剂盒包括：

(1)2mg/mL的Cetuximab-FITC；

(2)20mg/mL的磷酸二氢钠、66mg/mL的磷酸氢二钠和424mg/mL的氯化钠。

本发明公开了Cetuximab的一种新用途，通过实验验证，发现对cetuximab进行一定荧光标记后用于肿瘤组织体外病理染色，可以将正常组织与肿瘤组织进行很好的区分，在一定程度上可区分高分化和低分化的肿瘤组织，可以用作肿瘤检测，实现旧药新用。

附图说明

图1显示实施例1中流式细胞仪分析不同食管癌细胞系对Cetuximab-FITC的摄取情况的结果；

图2显示实施例1中荧光显微镜观察不同食管癌细胞系对Cetuximab-FITC的摄取情况的结果；

图3显示实施例1中静脉注射Cetuximab-IRDye800后不同时间点小鼠活体荧光图像的结果；

图4显示实施例1中静脉注射Cetuximab-IRDye800后检测其对微小病灶的检测能力的结果；

图5显示实施例2中以Cetuximab-FITC染色液对正常组织和肿瘤组织进行体外染色的结果，其中图中从左至右依次为食管、肌肉、TE1肿瘤组织和KSYE30肿瘤组织。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应当以此限制本发明的保护范围。

Cetuximab，中文称作“西妥昔单抗”，属于嵌合型IgG1单克隆抗体，分子靶点为表皮生长因子受体(EGFR)，其中文药品名通称为“爱必妥”，是一种主要用于治疗晚期结肠癌的药物。该药的抗肿瘤机制主要是其可以以高出内源性配体5-10倍的亲和力与表皮生长因子受体(EGFR)特异结合，可阻碍内源EGFR配体的结合，从而抑制受体功能，进一步诱导EGFR内吞从而导致受体数量的下调，抑制细胞的增殖、血管生成、细胞的入侵及转移等等。但是，截止目前，本领域尚没有关于将Cetuximab作为肿瘤筛查或诊断药物应用的报道。

本发明的发明人通过整合癌症组学Cosmic version72数据库的癌症基因谱Cancer Gene Census以及蛋白质相互作用STRING version10数据库和Drug Bank version4.2中FDA批准的药物数据库，获得的候选重定位药物，对肿瘤细胞系进行了筛查实验，筛选出新的抗肿瘤药物。做肿瘤细胞系筛选的候选肿瘤抑制药物如下：

Cetuximab,Trasruzumab,Lidocaine,Gefitinib,Erlotinib,Lapatinib,Panitumumab,Vandetanib,Afatinib,Osimertinib,Nacitumumab,Bevacizumab,Minocyxline,Gliclazide,Carvedilol,Ranibizumab,Vandetanib,Dalteparin,Aflibercept.

在研究的过程中，本发明的发明人意外地发现，对cetuximab进行一定荧光标记后用于肿瘤组织体外病理染色，可以将正常组织与肿瘤组织进行很好的区分，在一定程度上可区分高分化和低分化的肿瘤组织，可以用作肿瘤检测，实现旧药新用，遂欲申请专利进行保护。

本发明的技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，可以是各种实施方式之间的任意组合。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的仪器、材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规商业途径获得。

下述实施例中待测药物的活性成分为Cetuximab(即西妥昔单抗，中文药品名通称为“爱必妥”)，其化学式为：C₆₄₈₄H₁₀₀₄₂N₁₇₃₂O₂₀₂₃S₃₆，其重链为QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(如序列表中SEQ IDNO.1所示)，其轻链为DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(如序列表中SEQ ID NO.2所示)；其为drug bank产品，产品目录号为DB00002。

下述实施例中的人食管癌细胞系TE-1、人食管鳞癌细胞系KYSE30的出处如下：

TE-1购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，资源编号为3131C0001000700089；

KYSE30购自上海科佰生物有限公司，货号为CBP60457。

下述实施例中的动物出处如下：

Balb/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

下述实施例中的主要仪器及耗材的来源如下：

12-well白色底透细胞培养板(Costar产品，产品编号为No.3513)；

Fetal Bovine Serum(Gibco产品，产品编号为10099141)；

100mm培养皿(Corning产品，产品编号为430167)；

RPMI-1640medium(Gibco产品，产品编号为A1049101)；

DMSO(Sigma产品，产品编号为No.D4540)；

流式细胞仪(BD产品，产品型号为Accuri C6，USA)；

荧光倒置显微镜(Leica，DMI3000B，German)；

高检测灵敏度的光学成像系统(PerkinElmer，IVIS Spectrum，USA)。

实施例1 Cetuximab的靶向性及特异性检测

一、待测孔板的制备

1、细胞铺板

a)配制各细胞所需的完全培养基。

具体地，基本培养基RPMI或DMEM占80％-90％，胎牛血清占10％-20％，按1％的体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素)，使用青霉素和链霉素的终浓度分别是100U/mL和100μg/mL。

b)实验开始前，确认标记在100mm培养皿上的细胞系的名字、培养基以及传代时间、代次等信息，确保实验无误。

c)利用无菌吸管吸取细胞培养基。

d)用3-5mL的无菌PBS溶液润洗细胞表层，再用无菌吸管吸出PBS废液。

e)向培养基中加入1mL 0.25％(w/v)含0.04％(w/v)EDTA的胰酶溶液用于消化细胞，轻轻混匀，使溶液覆盖住细胞表层，在显微镜下观察，等细胞完全脱离培养皿底部且细胞连接较松散时加入5-10mL完全培养基并进行吹打。

f)将细胞分离成单个后，将此细胞悬液转移到15mL无菌离心管中，800rpm离心5min。

g)利用无菌吸管吸出上清培养基，并加入5mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀，

h)用细胞计数板对细胞悬液进行计数，调整细胞悬液的浓度并接种到12孔培养板中进行铺板实验，细胞密度为2×10⁵个细胞/孔。

2、待测药物Cetuximab-FITC的配制和加药

1)Cetuximab-FITC的制备

将Cetuximab分散到pH为8.5的PBS中，并按照摩尔比1:1～1:3的比例加入FITC，在35℃的条件下反应2h。Cetuximab-FITC复合物用PD10脱盐柱进行分离纯化。其具体浓度及连接效率通过HPLC进行分析。

2)取上述配制好的1mg/mL的待测药物Cetuximab-FITC用培养基分别稀释到5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL，其中5，10，20，50，100μg/mL的药物用于流式细胞仪的检测，50，100，200μg/mL的药物用于荧光倒置显微镜的观察。不加任何药物的孔作为对照孔。每个浓度设置3-5个复孔。

3、流式细胞仪检测待测药物的靶向性和特异性

1)利用无菌吸管将培养板中的培养基吸除。

2)步骤1中配制好的待测药物加入到12孔培养板中，放入37℃培养箱中继续培养4h。

3)利用无菌吸管吸出培养基废液，并加入1-2mL无菌PBS/孔清洗细胞表层，再用无菌吸管吸出PBS废液。

4)向培养板中加入0.2mL 0.25％(w/v)含0.04％(w/v)EDTA的胰酶溶液用于消化细胞，轻轻混匀，使溶液覆盖住细胞表层，在显微镜下观察，等细胞完全脱离培养皿底部且细胞连接较松散时加入1-2mL完全培养基并进行吹打。

5)将上述细胞悬液分别置于1.5mL离心管中，800rpm离心5min，并用无菌PBS洗涤2-3次。

6)用0.5mL无菌PBS重悬细胞沉淀，吹打均匀，用流式细胞仪进行检测。

结果如图1所示，从图1中可以看出，肿瘤细胞TE-1(图1a)和KYSE30(图1b)对待测药物具有很好的摄取且随着药物浓度增加其细胞摄取量也逐渐增加，为了更直观地显示这种关系，我们以药物浓度为横坐标，细胞的平均荧光强度为纵坐标作图(图1c)，从图中可以看出待测药物的摄取不仅仅与浓度有关，且在不同细胞间存在很大差异，其摄取量与细胞表面EGFR的表达水平成正相关(EGFR水平TE-1<KYSE30)。

4、荧光倒置显微镜观察细胞对待测药物的摄取情况

1)利用无菌吸管将培养板中的培养基吸除。

2)步骤1中配制好的待测药物加入到12孔培养板中，放入37℃培养箱中继续培养4h。

3)利用无菌吸管吸出培养基废液，并加入1-2mL无菌PBS/孔清洗细胞表层2-3次，再用无菌吸管吸出PBS废液。

4)将细胞置于荧光倒置显微镜中进行观察。

结果如图2所示，从结果图中可以看出与流式细胞仪的结果保持了高度的一致性。

二、动物实验检测待测药物的在体靶向性和精确性

1、荷瘤小鼠模型的建立

取KYSE30肿瘤细胞，800转离心5min，再用无菌PBS洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，用血球计数板进行计数制成浓度为6×10⁷个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠背部偏左后肢皮下接种肿瘤细胞悬液0.1mL。

接种完成后，逐日观察接种部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，用游标卡尺，每3天测量肿瘤长径a和短径b，并计算肿瘤体积，即V＝(a×b²)/2，每3天称量小鼠体重和肿瘤并记录，绘制曲线。

2、靶向性验证

先制备Cetuximab-IRDye800溶液：将IRDye800分散到pH7.4的PBS中，并加入10倍摩尔量的EDC和NHS，活化反应10-20min，之后加入一定量的Cetuximab(其摩尔量是染料的1/3～1倍)，在35℃的条件下反应2h。Cetuximab-IRDye800复合物用PD10脱盐柱进行分离纯化。其具体浓度及连接效率通过HPLC进行分析。

待肿瘤体积达～100mm³时，静脉注射1mg/mL的Cetuximab-IRDye800溶液0.1mL，用高检测灵敏度的光学成像系统监测不同时间点小鼠体内的荧光分布情况。

结果如图3所示，随着时间的延长待测药物在肿瘤部位的富集在24h时达到峰值，时间继续增加虽肿瘤部位荧光强度减弱，但与周围组织的区分度越来越明显，说明待测药物具有很好的肿瘤靶向性。

3、精确性验证

在同一小鼠上接种两个肿瘤，一大一小，大肿瘤的直径约12mm，小肿瘤的直径<2mm,静脉注射1mg/mL的Cetuximab-IRDye800溶液0.1mL，用高检测灵敏度的光学成像系统监测不同时间点小鼠体内的荧光分布情况。

结果如图4所示，图4中，左侧显示注射前观察结果，右边显示注射后24小时观察结果(实际上在注射后6小时即能显示肿瘤位置，24小时时显示更为精确)，图4中不仅仅大肿瘤能够显现，<2mm的小肿瘤也能明确显现出来，说明了待测药物具有很好的精确性。

综合上述实验结果，说明cetuximab与染料的复合物无论在细胞水平还是动物水平都体现了很好的靶向性，而且可以检测到直径小于2mm的肿瘤，在肿瘤早期诊断中具有很大的临床应用潜力。

实施例2 Cetuximab用于肿瘤组织体外病理染色

1、待测药物Cetuximab-FITC的配制

Cetuximab-FITC的制备

将Cetuximab分散到pH为8.5的PBS中，并按照摩尔比1:1～1:3的比例加入FITC，在35℃的条件下反应2h。Cetuximab-FITC复合物用PD10脱盐柱进行分离纯化。其具体浓度及连接效率通过HPLC进行分析。

2、肿瘤组织体外病理染色的具体实施步骤如下：

1)将待检测组织从动物或人体上取下浸泡在10％的中性福尔马林溶液中，浸泡1-2天；

2)对组织进行石蜡包埋，并用病理切片机切成5μm厚度的薄片，切片脱蜡，蒸馏水洗；

3)0.001～0.005mg/mL的Cetuximab-FITC染色液室温染色10-15分钟；

4)pH7.4的PBS洗涤3-5次，每次5分钟；

5)切片脱水，树胶封片；

6)荧光显微镜观察。

为了验证本发明的试剂盒具有很好的特异性，我们选择了正常的食管、肌肉组织进行对比，以TE1和KYSE30两种肿瘤组织作为实验组，进行观察，实验结果通过Matlab软件进行了处理，更易于观察，结果如图5所示。结果表明通过上述试剂进行染色后，可以将正常组织与肿瘤组织进行很好的区分，在一定程度上可区分高分化(KYSE30)和低分化(TE1)的肿瘤组织，可以用作肿瘤检测。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院自动化研究所

<120> 一种肿瘤组织体外病理染色试剂盒

<130> IB177102

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cetuximab重链

<400> 1

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cetuximab轻链

<400> 2

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210