一种基于代谢组学表征烟气暴露生物效应的试验方法与流程

本发明属于烟气暴露生物效应的研究技术领域，尤其涉及一种基于代谢组学表征烟气暴露生物效应的试验方法。

背景技术：

烟草是茄科植物烟草Nicotianatabacum L.的全草。卷烟在燃烧过程中形成的多环芳烃(PAHs)和自由基，其中多环芳烃是烟气中数量最多同时也是最为主要的致癌物；而自由基一方面在高温条件下可转化为多环芳烃，另一方面自由基也是机体造成氧化损伤引起各种疾病的重要原因，甚至引发癌症。随着吸烟与健康问题的日益突出，烟草减害技术的研究已成为国际烟草界研究的热点。同时，积极改进卷烟产品及生产工艺，最大限度地降低吸烟对人体的伤害，也是烟草行业对消费者应用的负责态度。我国科技人员将天然本草与卷烟进行结合，研究表明，天然本草添加烟可降低卷烟燃烧时所产生的多环芳烃和自由基的含量。那么，如何表征烟气暴露对生物体的影响也成为近年来研究的热点。

代谢组学是继基因组学、转录组学及蛋白质组学之后，/系统生物学又一重要组成部分。基因组学和蛋白质组学关注生物体在基因和蛋白质水平的变化，而代谢组学使用质谱及核磁共振仪(NMR)等高通量化学分析技术对细胞、组织或生物体内的小分子量代谢产物(往往分子量在1000Da以下)进行检测，观察生物体系受到外界影响后期代谢产物的质和量的动态变化，从整体角度评价生物体代谢状态的波动， 从而更深刻地理解生命过程。这些小分子代谢产物能够反映细胞状态、是连接基因与表型的桥梁。代谢组学主要的研究平台有核磁共振和色谱及质谱联用技术。而色谱及质谱联用技术主要包括气相色谱－质谱联用及液相色谱－质谱联用。通过联合色谱和质谱的分离能力，使得该平台具有较高的分辨率；此外，气相色谱具有较成熟的标准谱图数据库，可实现对小分子代谢产物的快速鉴定。液相色谱－质谱联用技术是代谢组学研究领域中普遍采用的样品分析技术之一，具有灵敏度高、普适性好、分辨率高、选择性高、可提供样品结构信息等优点。

由于代谢组学主要表征生物体内源性代谢物的整体及其受内在或外在因素影响的科学，其广泛的应用已深入到生物代谢、疾病诊断、和药物整体药效毒性等研究领域。但目前关于代谢组学用于表征烟气暴露所产生的生物效应还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目在于提供基于代谢组学表征烟气暴露生物效应的试验方法，旨在研究基于整体效应角度表征烟气下对实验动物内源性代谢物的改变。

本发明采用的技术方案是：

一种基于代谢组学表征烟气暴露生物效应的试验方法，该试验方法采用代谢组学分析方法，通过对与烟气暴露产生生物效应相关的生物标志物组在不同给药组群间的变化来表征实验动物置于烟气暴露环境中生物应答反应。

该方法具体包括以下步骤：

1)、将试验动物置于烟气暴露装置，建立烟气暴露实验动物模型；

以正常动物作为空白组，以烟气暴露环境下实验动物作为烟气暴露组，烟气暴露组实验动物可给予不同类型卷烟烟气，以某品牌不添加天然本草的卷烟为对照组，该品牌天然本草添加卷烟为实验组；

2)、烟气暴露一定时间收集各组试验动物的血浆、血清、尿液、肺等组织生物样本制备生物样本；

3)、生物样本的代谢指纹谱的获取；

将制备的生物样本，对其内源性代谢物进行分析，获取其代谢指纹谱；4)、数据处理与模式识别分析，获取代谢生物标志物组；

采用模式识别技术比较空白组与不同烟气暴露组代谢指纹图谱的异同；对空白组与选定烟气暴露组的代谢轮廓分析数据进行多元统计分析，获取差异内源代谢物，构成代谢生物标志物组；

5)、计算各代谢生物标志物组在不同烟气暴露实验动物组中与空白组的相似度，或对差异性内源代谢物做多元统计分析，或采用SPSS软件进行统计分析，考察烟气暴露对实验动物内源性代谢的影响；

6)、根据相似度计算结果或多元统计分析结果或数据统计分析结果，以不同烟气暴露组接近或远离空白组的程度，评价确定不同烟气暴露对实验动物内源性代谢物的影响。

所述步骤3)中对其内源性代谢物进行分析的方法为液相色谱-质谱联用技术、气相色谱-质谱联用技术或核磁共振波谱技术。

所述多元统计分析可采用主成分分析法(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。

所述步骤4)获取代谢生物标志物组的具体获取方法，主要包括对检测到的变量进行t检验，选取所有p<0.05的化合物作为代谢标志物；或计算Fisher权重，优先选取权重大的变量作为代谢标志物组；或采用主成分分析法(PCA)或偏最小二乘法(PLS)的模式识别，在PCA(PLS)分析中选取对分类贡献最大的一组变量作为代谢物生物标志物组。

本发明提供的采用代谢组学表征烟气暴露的生物学效应，通过采用代谢组学技术能获得机体大量的内源性代谢物的信息，从整体上评价烟气的生物学效应，并从中筛选主流烟气生物效应引起的代谢物变化；本发明采用的代谢组学方法是评价复杂物质体系生物学效应及其机制的有力工具，通过代谢组学结合血清生化指标，病理组织学检查等方法能评价暴露于烟气中不同时间对实验动物产生生物学效应过程中各个阶段的干预作用，结果显示吸食卷烟均会影响大鼠代谢，主要干扰了磷脂代谢、能量代谢并对大鼠造成了氧化损伤；此外，本发明操作简便，很好的评价了主流烟气对大鼠内源性代谢物的影响，同时比较了天然本草添加烟与普通卷烟对内源性代谢物影响的异同，为评价卷烟降害作用及其相关机制提供了一种可靠的工具。

附图说明

图1是烟气暴露7天大鼠血浆样本PCA(a)与PLS-DA(b)模式识别效果图；

图2是烟气暴露大鼠各时期三组样品PLS-DA比较分析结果图；(其中：a为第7天血浆样本；b为第14天血浆样本；c为第30天 血浆样本；d为第7天尿样；e为第14天尿样；f为第30天尿样)；

图3是生物标志物在3组大鼠不同烟气暴露时期的相对含量比较效果图；(其中a为血浆花生四烯酸；b为血浆LPC(18：0)；c为血浆LPC(16：0)；d为尿样柠檬酸；e为尿样甲基马尿酸；“*”p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，与对照组相比；“△”p<0.05，与空白组大鼠相比)

图4是烟气暴露7天大鼠肺组织样品PCA与PLS-DA模式识别比较图(a.PCA；b PLS-DA)；

图5是烟气暴露大鼠不同时期肺组织样品PLS-DA分析结果图(a为暴露7天；b为暴露14天；c为暴露30天)；

图6是重要标志物在大鼠不同烟气暴露时期的含量变化趋势图(a LPC(16:0)；b花生四烯酸；c亚油酸；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与空白组比较；△p＜0.05，与对照组比较)。

具体实施方式

下面结合具体实施例以及附图对本发明作进一步描述。

实施例1

1)大鼠适应性饲养一周后，随即分为：空白组，对照组和实验组；将卷烟由金属套筒固定在饲养箱中，每只大鼠每天吸食1支卷烟。大鼠手术前和手术后均禁食12小时，自由饮水。

2)动物处理及样本收集：在烟气暴露7天后，给大鼠称重，经麻醉后在肝门静脉处取血约6-8mL，放入经肝素钠处理过的10mL离心试管中，迅速在3000rpm下离心10min，取上层血浆，各生物样品 在-80℃下保存。

3)LC-MS分析之前，取冻融后的血浆样本100μL，加入400μL甲醇，涡旋1min，充分混匀以沉淀蛋白，之后在4℃下13000rpm离心15min，取上清液并加入300μL超纯水稀释，用0.22μm滤膜过滤。

4)色谱分离采用Waters公司Acquity TM-BEH C18反相分析柱(100×2.1mm,i.d.1.7μm,Waters,MA,USA)，柱温为40℃，流速设为0.4mL/min。自动进样器温度设定4℃，每次进样4μL。流动相组成为：A纯乙腈；B 0.1％甲酸水溶液，采用梯度洗脱方式洗脱样品。质谱为电喷雾离子源(ESI)，分析采用V模式，在负离子模式下采集数据。检测参数设置如下：脱溶剂气流量600L/h，脱溶剂气温度350℃，锥孔气流量40L/h，离子源温度120℃，毛细管电压2500V，锥孔电压30V。质谱扫描范围为100-1500m/z，扫描时间0.2s，扫描间隔0.02s。准确质量测定采用2ng/ml亮氨酸-脑啡肽

(Leucine-enkephalin,LE)溶液为锁定质量校准液，进行实时质量校正，质量校准选择“DRE”模式，流速2μL/min。质量轴校准采用甲酸钠溶液(0.05mol/L)进行。

5)质谱数据处理采用Waters公司Markerlynx软件(Waters,MA,USA)进行色谱峰自动识别和峰匹配，然后将所得数据导入SIMCA-P软件(Umetrics AB,Ume.,Sweden)。数据在SIMCA-P软件中先对数据进行Mean-centering以及Pareto-scaling处理以减少大面积色谱峰带来的分析偏差，随后进行模式识别。两组间差异用t检验分析，p<0.05认为 有显著性差异。

6)多元统计分析，首先采用无监督的PCA方法观察样本的聚集及离散状态以及离群点。为了进一步区分烟气暴露组和空白组之间的组间差异，研究中采用有监督的PLS-DA来判定对于造成这种聚集和离散的主要差异变量，根据变量权重值(VIP)找到与吸烟密切相关的差异表达代谢物。

图1所示为烟气暴露7天大鼠血浆样本PCA(a)与PLS-DA(b)模式识别比较，采用PCA方法对空白组、对照组和实验组的血样的代谢谱数据进行模式识别。从结果来看，虽然空白组跟对照组和实验组基本能分开，但是组内样品间离散较为严重，说明组内的个体差异较大，因此进一步采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对各组样本进行判别分析。PLS-DA模式识别结果显示，各样品组内聚集情况较好，组间也能得到较好地分离，从整体效应角度表征了不同卷烟对实验动物内源性代谢物的影响。

实施例2

1)大鼠适应性饲养一周后，随即分为：空白组、对照组和实验组；将卷烟由金属套筒固定在饲养箱中，每只大鼠每天吸食1支卷烟。大鼠手术前和手术后均禁食12小时，自由饮水。

2)动物处理及样本收集：在烟气暴露7、14、30天后，给大鼠称重，在代谢笼中收集大鼠24h的尿液，经麻醉后在肝门静脉处取血约6-8mL，放入经肝素钠处理过的10mL离心试管中，迅速在3000rpm下离心10min，取上层血浆，各生物样品在-80℃下保存。

3)LC-MS分析之前，取冻融后的血浆或尿液样本100μL，加入400μL甲醇，涡旋1min，充分混匀以沉淀蛋白，之后在4℃下13000rpm离心15min，取上清液并加入300μL超纯水稀释，用0.22μm滤膜过滤。

4)色谱分离、质谱分析、多元统计分析均同于具体实施例1

图-2所示为将所有样品用PLS-DA模式进行识别分组。可以看出血浆样本组内聚集情况较好，而尿样的同组样品离散程度较高，可能是因为尿液相比于血液个体代谢差异更为显著；各组样品间均能得到有效分离，从空白组跟对照组和实验组均有较好地分离来看，说明吸烟对机体的代谢有一定影响，造成代谢紊乱，但是实验组跟对照组也具有较好地分离，说明两者对机体的影响有一定的差异。随着烟气暴露时间的增长，血样和尿样PLS-DA分析图中实验组跟空白组逐步靠拢，具有一定地回调趋势，而对照组跟空白组则始终保持一定的分离，说明在长期干预下，添加有天然本草的某品牌卷烟对机体受到的损伤可能具有一定地保护作用，没有使机体损伤进一步加重。

应用具体实施例1、2代谢组学所获的代谢轮廓谱分析数据，进行差异表达代谢物的鉴定，运用MassLynx软件中的i-Fit功能，对所筛查到的具有差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式，然后再结合得到的精确质量数，在数据库(如KEGG，http://www.genome.jp；HMDB，http://www.hmdb.ca)中检索来鉴定标志物，部分标志物经过了标准品的验证。

根据PLS-DA分析中的VIP值，筛选各组中具有明显差异的化 合物，结果在各组中共找到了15个具有差异的化合物。在各样本中，血样得到的标志物以磷脂及脂肪酸代谢为主，而尿样中得到的大多是一些跟能量代谢和氧化损伤相关的标志物。烟气中含有大量自由基等物质，会对机体造成较为严重的氧化损伤，在所得的标志物中，去氢抗坏血酸、3-羟基-3-甲基-2-羟基吲哚、硫酸吲哚酚、甲酚硫酸盐和甲基马尿酸均跟氧化损伤相关，其中甲基马尿酸是脂肪酸β氧化的产物。

图3列出了几种已用标准品鉴定的重要代谢物在空白组、对照组和实验组的生物样本中的相对含量变化。在烟气暴露第7天时，跟空白组大鼠相比，各标志物在对照组和实验组中均具有显著性的差异，说明吸食普通卷烟和某品牌天然本草添加卷烟均会对机体造成损害；烟气暴露14天时，跟空白组比，各标志物在对照组中仍具有显著性差异，但是实验组的各标志物的显著性有所降低甚至没有显著性，说明吸食普通卷烟跟某品牌天然本草添加卷烟对机体造成的损伤程度有所不同，吸食某品牌卷烟造成的损害相对较小，可能是某品牌卷烟中的天然本草成分燃烧后可以减少一些自由基等物质，从而减少了氧化损伤等伤害；当烟气暴露30天时，对照组跟空白组相比，仍具有显著性差异，但是实验组的部分标志物水平有向正常水平回调的趋势，并且实验组跟对照组相比，标志物的差异具有显著性。

实施例3

1)大鼠适应性饲养一周后，随即分为：空白组，对照组和实验组；将卷烟由金属套筒固定在饲养箱中，每只大鼠每天分别暴露20min， 控制卷烟烟气遮光率为70％，控制温度为22±2℃，湿度保持在21±0.5％，氧气浓度保持在21±0.5％，压力为101325±40Pa。大鼠手术前和手术后均禁食12小时，自由饮水。

2)动物处理及样本收集：在烟气暴露7天、14天及30天时，给大鼠称重，经麻醉后取大鼠肺组织，用生理盐水洗净并用滤纸吸干水分，然后称重，在-80℃下保存。

3)肺组织样本前处理：取冻融后的肺组织样品，按1:3(g/mL)加入生理盐水进行匀浆。取200μL匀浆液，加入600μL甲醇，涡旋2min，4℃下10,000rpm离心15min，取上清液过0.22μm滤膜。

4)色谱分离、质谱分析、多元统计分析均同于具体实施例1和实施例2。

采用PCA方法对空白组、吸食普通卷烟和吸食某品牌天然本草添加烟大鼠肺组织的代谢谱数据按不同暴露时间分别进行模式识别。从结果来看，虽然空白组跟两吸烟组基本能分开，但是组内样品间离散较为严重，说明组内的个体差异较大，因此进一步采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)对各组样本进行判别分析。PLS-DA模式识别结果显示，各样品组内聚集情况较好，组间也能得到较好地分离，以烟气暴露7天大鼠肺组织样品为例，见图4。

将所有样品用PLS-DA模式进行识别分组，结果见图5。可以看出各肺组织样品组内聚集情况均较好，各组间均能得到有效分离，从空白组跟对照组和实验组均有较好地分离来看，说明吸烟对机体的代谢有一定影响，造成代谢紊乱，但是实验组跟对照组也具有较好地分 离，说明两者对机体的影响有一定的差异。随着烟气暴露时间的增长，三组间一直保持着一定的分离，说明作为烟气进入体内的直接作用器官，肺组织一直受到慢性损伤。

应用具体实施例3肺组织代谢组学所获的代谢轮廓谱分析数据，进行差异表达代谢物的鉴定，运用Mass Lynx软件中的i-Fit功能，对所筛查到的具有差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式，然后再结合得到的精确质量数，在数据库(如KEGG，http://www.genome.jp；HMDB，http://www.hmdb.ca)中检索来鉴定标志物，部分标志物经过了标准品的验证。

根据PLS-DA分析中的VIP值，筛选具有明显差异的化合物，结果共找到了11个具有差异的化合物。得到的标志物中，大多是与磷脂及脂肪酸代谢相关的标志物。已有文献报道吸烟会引起磷脂降解，体内磷脂代谢异常可能跟烟气中氧化性物质的吸入对机体细胞膜、脂蛋白、脂质等产生影响有关，而磷脂代谢的异常会增加心血管疾病的风险，特别是花生四烯酸水平的升高是心血管疾病的重要标志物之一，同时也是机体发生炎症反应的重要标志物之一，而炎症的发生跟心血管疾病、癌症等疾病相关。二十二碳五烯酸是亚麻酸氧化产物，其水平减少跟多种疾病相关，如冠心病、糖尿病。

图6列出了几种已用标准品鉴定的重要代谢物在空白组、对照组和实验组肺组织样本中的相对含量变化。LPC(16:0)跟磷脂代谢有关，烟气暴露的两组大鼠因烟气的吸入造成磷脂大量的降解，暴露30天后，实验组降低的程度要显著低于对照组，说明某品牌天然本 草添加烟在大鼠磷脂代谢紊乱时，具有一定的保护作用而使其受到的损害减少而接近空白组。

显然，以上所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。