一种基于适配体‑分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法与流程

本发明涉及一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，属于食品安全检测领域。

背景技术：

食物传播是人类感染鼠伤寒沙门氏菌的主要途经,肉类(尤其是禽肉)、蛋类及蛋制品、未经巴氏消毒的牛奶及奶制品、海产品等很多食品都与鼠伤寒沙门氏菌病有关。它是一种人畜共患致病菌，可污染食品并大量繁殖，其致病机制是随食物经口进入人体后会随淋巴系统进入血液，造成人体感染，不仅如此，鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道后菌体裂解后会产生大量内毒素，内毒素作用于肠粘膜引发宿主全身性炎症，出现中毒症状。由鼠伤寒沙门氏菌引起的食物中毒具有发病率高，发病时间短等特点。因此建立一种快速、准确、便捷的检测方法，对于从源头预防副溶血性弧菌的污染，预防中毒事故的发生具有重要意义。

检测沙门氏菌的方法主要包括传统的平板计数法、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增方法(LAMP)、免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光技术(IFT)、胶体金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离技术(IMB)等。平板计数法检验程序较繁琐，在检测时间、灵敏度与特异性等方面存在缺陷。新发展起来的实时荧光定量PCR技术，虽然能缩短检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分析法、电化学免疫分析法、酶联荧光分析法等，具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但抗体作为识别分子易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或细胞实验，繁琐费时，成本较高。近些年来，寡核苷酸适配体(aptamer)因其为体外制备获得，周期短成本低，且稳定性好，易于修饰，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注，广泛应用于生命科学等各个领域的研究工作中。

ATP合酶(F₀F₁-ATPase)是一旋转分子马达。它既能利用跨膜H⁺梯度合成ATP，又能水解ATP而反向转运H⁺。在ATP合成过程中，质子能够从载色体膜内泵到膜外侧，导致内膜微环境溶液H⁺浓度变化。在分子马达上连接负载会不同程度影响其旋转性能。自上世纪60年代起，就有许多科学家开始研究这个天然的分子马达，它具有纳米级别的尺寸、精巧的运作方式，能实现能量之间的转换，可作为生物传感器应用到食品安全、医疗等领域，有广阔的应用前景。因此本发明利用鼠伤寒沙门氏菌的适配体作为识别分子，将其与分子马达结合构建适配体分子马达传感系统检测鼠伤寒沙门氏菌。该发明可用于乳制品、肉制品等食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。

技术实现要素：

一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法：首先，从深红红螺菌中提取载色体，载色体再连上ε亚基抗体-生物素-亲和素-5’端生物素化的鼠伤寒沙门氏菌适配体，形成分子马达适配体传感器。由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形成载色体-适配体-菌体复合物。在F-7000荧光探测仪的荧光模式下，以496nm进行激发，记录515nm处荧光信号强度，通过对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的检测，建立标准曲线，达到对含鼠伤寒沙门氏菌样品进行定量检测的目的。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。

实现本发明的具体方法：

1)载色体的制备：将深红红螺菌Rhodospirillum rubrum菌种按比例1:100接种到液体培养基，26℃、150r/min，培养72h。然后5000r/min离心30min，4℃离心收集菌体。用提取Buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L NaCl溶液，2mmol/L MgCl₂溶液，1mmol/L DTT溶液)重悬菌体，离心去上清液(8000r/min、4℃离心10min)。加入提取Buffer重悬菌体(约1g加入10mL Buffer)，再加入终浓度1mmol/L PMSF，冰上超声破碎30min(超声5s，停8s)。将破碎菌体离心(25000r/min、4℃离心90min)，去沉淀取上清液。将上清液超速离心(50000r/min、4℃离心1.5h)，取沉淀即为载色体。最后用提取Buffer重悬沉淀并加入30％的甘油，置于-80℃保存。

2)荧光探针F-DHPE标记载色体以及生物素标记ε亚基抗体：先将F-DHPE用氯仿配成1mg/mL，分装成200μL/管后用氮气吹干，置于-80℃保存。从冰箱中取出1管已吹干的F-DHPE，加入200μL无水乙醇将其充分溶解。取200μL载色体原液放入1.5mL离心管中，加入30μL F-DHPE，上下颠倒混匀5次，用铝泊纸包起后避光放在室温摇床上孵育15min。15000r/min、4℃离心30min，收集沉淀。重复用PBS洗3次以去除多余的荧光探针，将沉淀用300μL PBS重悬备用，最终获得荧光探针F-DHPE标记的载色体。将2μL生物素(2μmol/L)加入到20μL亚基抗体中，室温孵育30min，抗体N端即被标记。

3)分子马达适配体传感器的构建：取300μL已标好F-DHPE的载色体于离心管中，加入40μg N-biotin标记ε亚基抗体，用PBS补加至1m L，37℃反应1h；4℃、15000r/min离心30min；弃上清液，将沉淀用500μL PBS重悬；加入2μL亲和素(1mg/mL)，用PBS补加至1mL，室温摇床上(转速50～100r/min)反应3h；4℃、15000r/min离心30min，弃上清液，将沉淀用500μL PBS重悬；加入生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌适配体(10μM)50μL，用PBS补加至1mL，室温摇床上(转速50～100r/min)反应30min)，弃上清液，用300μL含30％甘油的PBS重悬载色体，放入-20℃冰箱备用。最终获得适配体-分子马达复合物。

4)鼠伤寒沙门氏菌的检测：取不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌液，与载色体-适配体复合物进行孵育，然后加入ATP合成缓冲液启动反应。在F-7000的荧光模式下，以496nm进行激发，记录515nm处的荧光强度。当体系中不存在目标菌种时，捕获探针和荧光探针的适配体没有与目标物质结合，因此此时荧光强度最小(F₀)，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度的增加，荧光信号强度逐渐增加。根据荧光强度的增加值(ΔF)与对应的细菌的浓度的对数值建立标准曲线。

本发明的优点在于：

1.本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。

2.本发明将适配体与分子马达联用，构建适配体-F₀F₁-ATPase分子马达生物传感器，用于鼠伤寒沙门氏菌的检测，可大大缩短检出时间，具有快速、经济等优点，具有广阔的应用前景。

3.本发明中提供的检测方法与现有鼠伤寒沙门氏菌的检测方法相比，具有灵敏度高的特点，其检测限可达到10cfu/mL。

附图说明

图1基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法的示意图

图2载色体的紫外吸收光谱图

图3不同浓度鼠伤寒沙门氏菌引起的荧光强度变化光谱图

图4相对荧光强度与鼠伤寒沙门氏菌浓度的线性关系图

具体实施方式

下面实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实施例1：鼠伤寒沙门氏菌标准检测曲线的建立

取300μL载色体-适配体复合物，随后加入100μL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌液，37℃条件下孵育1h，然后4℃、15000r/min离心30min，弃上清液；然后加入30μL ATP合成缓冲液(0.1mM Tricine,10％glycerol,5mM NaH₂PO₄,5mM MgCl₂,ADP 0.35mM,NADH 2mM,pH 9.0)37℃孵育30min，接着加入450μL PBS，混合均匀。最后取300μL样品，在F-7000的荧光模式下，以496nm进行激发，记录515nm处的荧光强度。如图3所示，当体系中不存在目标菌种时，捕获探针和荧光探针的适配体没有与目标物质结合，因此此时荧光强度最小，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度的增加，荧光信号强度逐渐增加。如图4所示，鼠伤寒沙门氏菌在1×10¹～1×10⁴cfu/mL浓度范围内，与515nm处相对荧光强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝1085.13x+363.98(R²＝0.9944)，最低检出限为10cfu/mL。

实施例2：牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测

取从本地超市购买牛奶10mL，12000r/min离心15min，然后用0.22μm滤膜以除去牛奶中的蛋白质和脂肪，然后用Tris-HCl溶液将牛奶样品的pH值调为7.7，将处理过的牛奶样品分成9份，每份样品的体积为900μL，再将100μL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的培养物加到上述牛奶样品中，使样品的总体积达到1mL。分别取100μL含有不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的样品进行平板计数，另取100μL含有不同浓度的菌液的样品，采用本实验的方法进行检测，将得到的检测结果与平板计数法所得到的结果进行比较。结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。

表1牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

序列表

〈110〉 江南大学

〈120〉 一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法

〈130〉

〈160〉 1

〈170〉 PatentIn version 3.5

〈210〉 1

〈211〉 40

〈212〉 DNA

〈213〉 人工序列

〈400〉 1

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