本发明涉及一种利用顶空气相色谱-质谱联用(headspacegaschromatography-massspectrometry，hs-gc-ms)技术快速区分鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌的检测方法。
背景技术：
沙门氏菌(salmonella)是主要的肠道致病菌之一，易引起食物中毒。在我国，以沙门氏菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒的首位。目前沙门氏菌全世界已分离出两千多个血清型，其中以鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)最为常见。鼠伤寒沙门氏菌，是一群非适应性或泛嗜性的沙门氏菌，具有广泛的宿主，是目前世界各国分离率最高的菌型之一。该菌能引起各种家禽和哺乳动物的传染病，也可引起人类感染，具有重要的公共卫生意义。鼠伤寒沙门氏菌的检测多采用传统的生化反应实验等，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天。
奇异变形杆菌(proteusmirabilis)属于条件致病菌，广泛存在于水、土壤腐败的有机物以及人和动物的肠道中，主要污染动物性食品，特别是肉类，能够造成泌尿系统的感染，肾结石和膀胱结石的形成可能与奇异变形杆菌感染有关。
食品安全国家标准《gb4789.4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验》中，食品农产品样品经过预增菌、增菌后，可疑鼠伤寒沙门氏菌在木糖赖氨酸脱氧胆盐(xld)琼脂分离平板上形态：圆形，黑色中心，周围绕有透明圈，菌落直径为2-3mm。日常检测过程中，奇异变形杆菌按照《gb4789.4-2016食品微生物学检验沙门氏菌检验》中的预增菌、增菌后，其在(xld)琼脂分离平板上的形态与鼠伤寒沙门氏菌相似：圆形，黑色中心，周围绕有透明圈，菌落直径为2-3mm，两种致病菌在xld琼脂分离平板上难以区分。在商品化的沙门氏菌显色培养基中，伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌颜色接近，通过肉眼观察，产生漏检和假阳性的几率很大。通过进一步的生化试验区分两种致病菌，需要时间长，难以满足快速检测的要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速的鼠伤寒沙门氏菌检测方法。pcr技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有pcr抑制剂，从而影响pcr的扩增结果。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速区分鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌的检测方法，以克服现有技术的上述缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为：利用顶空气相色谱-质谱联用(headspacegaschromatography-massspectrometry，hs-gc-ms)技术检测鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌液态发酵产生的挥发性产物，根据两种致病菌产生的挥发性产物种类不同达到区分的目的，具体包括下列步骤：
1、鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌的培养物制备
接种环转接菌株到灭菌的营养肉汤培养基中，30-40℃，100-200r/min条件下，摇床振荡培养8-18h。吸取该培养物1-10ml转入20ml顶空进样瓶内，加盖密封，作为测试样品。
其中，营养肉汤组分为：
蛋白胨10.0g/l，牛肉粉3.0g/l，氯化钠5.0g/l，葡萄糖1.0g/l。
2、hs-gc-ms分析
顶空(hs)进样条件：加热箱温度50-60℃，定量环温度：100℃，传输线温度：115℃，样品平衡时间：30-60min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。
气相色谱(gc)条件：气相色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3ml/min；升温程序：初始温度35-55℃保持2-10min，以3-10℃/min升至120-200℃；再以5-10℃/min升至250℃，保持1-5min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(he)，流速：1ml/min。
质谱(ms)条件：离子源ei，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70ev，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：30-300u，溶剂延迟：1-3min。
3、鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌的挥发性产物区分
ms结果经计算机检索谱库进行定性分析，同时由软件系统完成手动对照检索。采用提取离子流方式报告挥发性物质的峰面积。
其中，鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌产生的挥发性产物种类不同，主要区分化合物为二甲基二硫(methyldisulfide，c2h6s2)和邻苯二甲酸异丁酯(phthalicacid,hept-4-ylisobutylester或phthalicacid,hex-3-ylisobutylester，)，鼠伤寒沙门氏菌的液态发酵的挥发性产物中可以检测到邻苯二甲酸异丁酯，未检测到二甲基二硫，并且采用面积归一法计算邻苯二甲酸异丁酯的相对含量为6％-15％，而奇异变形杆菌的液态发酵的挥发性产物中检测到二甲基二硫，未检测到邻苯二甲酸异丁酯，并且采用面积归一法计算二甲基二硫的相对含量为5％-10％。
进一步的，奇异变形杆菌产生的挥发性产物中可以检测到环己醇，鼠伤寒沙门氏菌的挥发性产物中没有环己醇。
本发明的有益效果：
本发明的方法作为一种筛选工具，比现有的传统生化实验鉴定时间缩短1-2天，可以快速区分xld平板或沙门氏菌显色平板上的鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌，实现快速筛选。相对于pcr方法和免疫方法，该筛选方法自动化程度更高，降低一线检测人员接触食源致病菌的几率，减少食源致病菌对人和环境污染的风险。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。
图1是鼠伤寒沙门氏菌atcc25241与奇异变形杆菌atcc25933产生的挥发性化合物的总离子流色谱图。
实施例1
(1)鼠伤寒沙门氏菌atcc25241与奇异变形杆菌atcc25933的培养物制备
接种环无菌操作转接鼠伤寒沙门氏菌atcc25241到5ml的灭菌营养肉汤中，36℃，120r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20ml安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为鼠伤寒沙门氏菌待测试培养物。
接种环无菌操作转接奇异变形杆菌atcc25933到5ml的灭菌营养肉汤中，36℃，120r/min条件下，摇床振荡培养12h。吸取全部培养物转入20ml安捷伦钳口顶空样品瓶内，加盖密封，作为奇异变形杆菌待测试培养物。
其中，营养肉汤组分为：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉3.0g/l，氯化钠5.0g/l，葡萄糖1.0g/l，购自北京陆桥技术责任有限公司。
(2)培养物的顶空气相色谱-质谱联用法分析
采用美国安捷伦公司agilent7890b-5977a系列气相色谱/质谱联用系统(配有agilent7697a顶空自动进样器)对鼠伤寒沙门氏菌待测试培养物、奇异变形杆菌待测试培养物进行挥发性产物的分析。顶空进样、气相色谱和质谱条件如下：
顶空(hs)进样条件：加热箱温度55℃，定量环温度：100℃，传输线温度：115℃，样品平衡时间：50min；色谱柱压力：7.7psi；填充压力：15psi；加压时间：0.2min；进样持续时间：1.0min，拔针时间：0.5min。
气相色谱(gc)条件：hp-innowax色谱柱(30m×250μm×0.25μm)；分流进样，分流比为5:1，隔垫吹扫流量为3ml/min；升温程序：初始温度50℃保持2min，以8℃/min升至180℃；再以10℃/min升至250℃，保持5min，进样口温度：250℃；载气：高纯氦(he)，流速：1ml/min。
质谱(ms)条件：离子源ei，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，电子能量70ev，传输线温度280℃，采集模式全扫描，质量扫描范围m/z：33～300u，溶剂延迟：2.2min。
(3)挥发性产物的定性与定量
采用安捷伦gcmschemstation软件中的谱库(nist11.l)对气相色谱-质谱结果进行化合物的定性分析，同时由nistmssearch2.0软件系统完成手动对照检索，要求正反向匹配因子(match)都大于700(良好匹配)，可能性(prob.％)大于60。采用提取离子流方式计算挥发性物质的峰面积，利用面积归一法计算挥发性化合物的相对含量。选取相对含量大于1％的代表性挥发性化合物作为区分鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌的挥发性化合物种类(表1)。
表1鼠伤寒沙门氏菌atcc25241与奇异变形杆菌atcc25933产生的各种挥发性化合物
注：cas编号是化学物质登录号。
鼠伤寒沙门氏菌atcc25241与奇异变形杆菌atcc25933产生的挥发性化合物的总离子流色谱图(图1)可以直观显示出两种致病菌的化合物种类差别。通过表1中两种致病菌挥发性化合物组分数据，可以发现鼠伤寒沙门氏菌atcc25241的挥发性化合物中检测到邻苯二甲酸异丁酯(相对含量为6.1％)，而在奇异变形杆菌atcc25933的挥发性化合物检测到二甲基二硫(相对含量6.6％)。
方法验证
一种快速区分鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌的检测方法，该方法通过对不同来源的鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌进行方法验证，产生的挥发性化合物见表2。表2数据结果表明该方法可以有效区分不同来源的鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌，方法的稳定性良好，通过进一步验证大量不同来源的鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌，可以应用于日常检测中区分鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌。
表2鼠伤寒沙门氏菌和奇异变形杆菌产生的各种挥发性化合物
注：鼠伤寒沙门氏菌atcc14028、鼠伤寒沙门氏菌atcc13311、鼠伤寒沙门氏菌atcc49416、鼠伤寒沙门氏菌cmcc(b)50115和奇异变形杆菌atcc12453为标准菌株；鼠伤寒沙门氏菌f16-25、奇异变形杆菌f3-9、奇异变形杆菌f5-6、奇异变形杆菌f7-5和奇异变形杆菌f13-3分离自不同的食品基质中，实验室甘油冷冻保存。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。