本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种优选胱抑素c检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：肾脏疾病是临床上一种常见的疾病，迄今为止，早诊断、早治疗以及逆转损伤的肾功能是唯一能阻止肾脏疾病恶化的途径。临床评价肾脏疾病进展和严重程度一般以肾功能为参考，以肾小球滤过率(gfr)作为反映肾功能最重要的指标。胱抑素c，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白或γ-后球蛋白，且是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，其分子量为13.3kd，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素c仅经肾小球滤过而被清除，为反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液。因此，可以通过血液中胱抑素c的浓度来反映肾小球的过滤速率。而且，胱抑素c血清浓度不受敏症过程、性别、年龄和肌肉重量影响，是反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物，并逐步发展为评估肾功能的一项敏感性好、特异性高的指标。目前，临床上主要依托免疫学方法完成胱抑素c的检测，借助抗原抗体的特异性结合，以双抗夹心的方式定量检测血清中胱抑素c的含量。具体的检测方法又包括：酶联免疫吸附测定法、化学发光法和免疫比浊法。前面两种方法由于操作繁琐、耗时长以及费用高等不足，严重限制其应用。随着全自动生化仪的普及和多种快速免疫比浊检测技术的发展，免疫比浊法兼具反应时间短，精密度好，检测范围宽，黄疸、溶血和脂血标本影响小，易于自动化等优势，已成为临床胱抑素c的主流检测方法。但是，由于免疫比浊法的检测原理缺乏酶促放大反应，导致现有的胱抑素c免疫比浊检测试剂盒不可避免的出现灵敏度较低等不足。同时，在试剂盒制备过程中，为保证产品达到所需灵敏度，较酶联免疫吸附测定法和化学发光法，免疫比浊法对所用抗体的质量要求更高，包被量和抗体使用量更大，也造成试剂盒成本的增加。且目前广泛使用在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。现有胱抑素c检测试剂盒的制备也存在着操作复杂、耗时长，对操作者专业技能限制的以及无法保证产品稳定性和准确性的缺憾。技术实现要素：本发明的目的就在于针对上述现有技术的不足，提供一种优选胱抑素c检测试剂盒，该试剂盒与现有胱抑素c检测试剂盒相比，能进一步提高胱抑素c检测的稳定性和准确性，且成本更低。本发明的另一目的是提供上述优选胱抑素c检测试剂盒的制备方法，该方法操作简单，易于推广使用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种优选胱抑素c检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1主要由缓冲液1、无机盐离子1、稳定剂1、防腐剂1、增溶剂1和加速剂1组成；所述试剂r2主要由交联胱抑素c抗体的聚苯乙烯微球、缓冲液2、稳定剂2、增溶剂2、防腐剂2和保护剂2组成，且保护剂2为β-环糊精；所述聚苯乙烯微球与胱抑素c抗体通过物理吸附连接或者聚苯乙烯微球表面氨基、羧基、酰肼或者环氧基与胱抑素c抗体表面氨基共价偶联，并被β-环糊精(保护剂2)包合，聚苯乙烯微球粒径为100nm。本技术方案中的防腐剂1和2是指可以抑制试剂中细菌和微生物污染的一类试剂，对试剂具有防腐杀菌的作用。试剂r2中的保护剂2是一类能够保护胶乳颗粒表面的抗体的试剂。无机盐离子1可以保持试剂r1内的电荷平衡。本技术方案中的优选胱抑素c检测试剂盒，将胱抑素c抗体交联在聚苯乙烯微球表面，并被β-环糊精包合，当血液中的胱抑素c与胱抑素c抗体反应时，带动聚苯乙烯微球聚集产生一定浊度，而浊度与血液中的胱抑素c含量在一定范围成正比，可以用全自动生化仪在400-800nm波长下检测血液中胱抑素c的含量。优选地，上述优选胱抑素c检测试剂盒的组成如下：试剂r1，其组分为：试剂r2，其组分为：进一步优选地，上述优选胱抑素c检测试剂盒的具体组成如下：试剂r1，其组分为：试剂r2，其组分为：优选地，所述试剂r1中的缓冲液1选自hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其ph为7.0～9.0；所述试剂r2中的缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、硼砂缓冲液、hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液中任意一种或多种的组合，其ph为7.0～9.0。优选地，所述试剂r1中的稳定剂1选自牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合；所述试剂r2中的稳定剂2选自牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合。优选地，所述试剂r1中的无机盐离子1选自氯化钾、氯化钠、氯化钙中的任意一种或多种的组合，具有价格低廉、原料易得的优点。优选地，所述试剂r1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者proclin300；所述试剂r2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或proclin300。防腐剂1和2具有优良的防腐杀菌性能。优选地，所述试剂r1中的加速剂1为聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合。优选地，所述试剂r1和试剂r2中的增溶剂1均为吐温20。还包括胱抑素c试剂的校准品，校准品为胱抑素c含量为0.1mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l，4.0mg/l和8.0mg/l的六个梯度标准品，溶液为牛血清白蛋白10g/l、吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l、磷酸盐缓冲液10mmol/l的缓冲液。如上述优选胱抑素c检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：(1)、试剂r1的制备：配制缓冲液1：磷酸盐缓冲液5～15mmol/l；在缓冲液1中加入牛血清白蛋白5～15g/l、吐温200.1～0.3mmol/l、聚乙二醇2.0～5.0mmol/l、氯化钠0.08～0.16mol/l、叠氮钠5～15mmol/l，搅拌混合均匀，即得试剂r1；(2)、试剂r2的制备：步骤一：将胱抑素c抗体进行4℃透析，再用磷酸盐缓冲液将胱抑素c抗体稀释至0.05～5mg/ml，得到胱抑素c抗体稀释液；将聚苯乙烯微球用纯化水离心、洗涤3次；步骤二：用磷酸盐缓冲液将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯微球稀释到质量浓度为0.1％～3％，再加入质量浓度为0.1～0.5％β-环糊精，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的β-环糊精，然后加入步骤一得到的胱抑素c抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入磷酸盐缓冲液5～15mmol/l、牛血清白蛋白5～15g/l、吐温200.1～0.5mmol/l、叠氮钠5～15mmol/l搅拌混合均匀即得试剂r2；(3)、校准品的制备：按照需要的胱抑素c含量为0.1mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l，4.0mg/l和8.0mg/l的六个梯度标准品，将相应的胱抑素c标准品分别加入含牛血清白蛋白10g/l、吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l、磷酸盐缓冲液10mmol/l缓冲液中。优选地，上述优选胱抑素c检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：(1)、试剂r1的制备：配制缓冲液1：磷酸盐缓冲液10mmol/l；在缓冲液1中加入牛血清白蛋白10g/l、吐温200.2mmol/l、聚乙二醇3.5mmol/l、氯化钠0.12mol/l、叠氮钠10mmol/l，搅拌混合均匀，即得试剂r1；(2)、试剂r2的制备：步骤一：将胱抑素c抗体进行4℃透析，再用磷酸盐缓冲液将胱抑素c抗体稀释至2mg/ml，得到胱抑素c抗体稀释液；将聚苯乙烯微球用纯化水离心、洗涤3次；步骤二：用磷酸盐缓冲液将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯微球稀释到质量浓度为1.0％，再加入质量浓度为0.3％β-环糊精，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的β-环糊精，然后加入步骤一得到的胱抑素c抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入磷酸盐缓冲液10mmol/l、牛血清白蛋白10g/l、吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l搅拌混合均匀即得试剂r2；(3)、校准品的制备：按照需要的胱抑素c含量为0.1mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l，4.0mg/l和8.0mg/l的六个梯度标准品，将相应的胱抑素c标准品分别加入含牛血清白蛋白10g/l、吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l、磷酸盐缓冲液10mmol/l缓冲液中。与现有检测技术相比，本发明的有益效果为：1、聚苯乙烯微球通过物理吸附与胱抑素c抗体连接或者通过其表面的氨基、羧基、酰肼或者环氧基等官能团和抗体表面的氨基等结合形成共价偶联结构，使胱抑素c抗体牢固的结合在微球表面。再进一步通过β-环糊精的包合，保证了试剂r2的稳定性，延长了试剂r2有效期。2、采用粒径为100nm的大颗粒聚苯乙烯微球颗粒，并以β-环糊精包合，使其具有较大的粒径，试剂盒在具有较高灵敏度的同时，相比现有试剂盒不仅提高了试剂的稳定性，而且增加了血液中胱抑素c和胱抑素c抗体反应时的浊度，从而提高了测试反应的准确性及抗干扰能力，并缩短了反应时间，确保测试结果稳定、可靠。3、使用β-环糊精作为保护剂2，不仅使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，还使得与现有试剂盒相比有效期得到延长。试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为24个月；开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为90天。同比现有试剂盒以及未使用β-环糊精作为保护剂的试剂盒有效期明显增长，更便于存放与使用。4、试剂盒成本低，制备方法操作简单，易于推广使用。具体实施方式一种优选胱抑素c检测试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，所述试剂r1主要由缓冲液1、无机盐离子1、稳定剂1、防腐剂1、增溶剂1和加速剂1组成；所述试剂r2主要由交联胱抑素c抗体的聚苯乙烯微球、缓冲液2、稳定剂2、增溶剂2、防腐剂2和保护剂2组成，且保护剂2为β-环糊精；所述聚苯乙烯微球与胱抑素c抗体通过物理吸附连接或者聚苯乙烯微球表面氨基、羧基、酰肼或者环氧基与胱抑素c抗体表面氨基共价偶联，并被β-环糊精(保护剂2)包合，聚苯乙烯微球粒径为100nm。优选地，所述试剂r1中的缓冲液1选自hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其ph为7.0～9.0；所述试剂r2中的缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、硼砂缓冲液、hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液中任意一种或多种的组合，其ph为7.0～9.0。优选地，所述试剂r1中的稳定剂1选自牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合；所述试剂r2中的稳定剂2选自牛血清白蛋白、甘露糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠、果糖中的一种或多种的组合。优选地，所述试剂r1中的无机盐离子1选自氯化钾、氯化钠、氯化钙中的任意一种或多种的组合，具有价格低廉、原料易得的优点。优选地，所述试剂r1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者proclin300；所述试剂r2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或proclin300。防腐剂1和2具有优良的防腐杀菌性能。优选地，所述试剂r1中的加速剂1为聚乙二醇-2000、聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种的组合。优选地，所述试剂r1和试剂r2中的增溶剂1均为吐温20。还包括胱抑素c试剂的校准品，校准品为胱抑素c含量为0.1mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l，4.0mg/l和8.0mg/l的六个梯度标准品，溶液为牛血清白蛋白10g/l、吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l、磷酸盐缓冲液10mmol/l的缓冲液。实施例1本发明的试剂盒举例是双试剂，其中：试剂r1试剂r2：实施例2作为优选，本发明公开了一种优选胱抑素c测定试剂盒，包括彼此独立的试剂r1和试剂r2组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：包被有胱抑素c抗体聚苯乙烯微球与β-环糊精颗粒，粒径100nm，浓度1％。校准品：按照需要的胱抑素c参考校准品浓度将相应的胱抑素c标准品分别加入上述缓冲液，制备得到不同浓度的一组校准品。实施例3试剂盒使用方法：1、试剂准备，试剂为液体双试剂，开瓶即用，其中：(1)、试剂r1的制备：配置缓冲液1：磷酸盐缓冲液10mmol/l；在缓冲液1中加入牛血清白蛋白10g/l、吐温200.2mmol/l、聚乙二醇3.5mmol/l、氯化钠0.12mol/l、叠氮钠10mmol/l，搅拌混合均匀，即得试剂r1；(2)、试剂r2的制备：步骤一：将胱抑素c抗体进行4℃透析，再用磷酸盐缓冲液将胱抑素c抗体稀释至2mg/ml，得到胱抑素c抗体稀释液；将聚苯乙烯微球用纯化水离心、洗涤3次；步骤二：用磷酸盐缓冲液将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯微球稀释到质量浓度为1.0％，再加入质量浓度为0.3％β-环糊精，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的β-环糊精，然后加入步骤一得到的胱抑素c抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入磷酸盐缓冲液10mmol/l、牛血清白蛋白10g/l、吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l搅拌混合均匀即得试剂r2；(3)、校准品的制备：按照需要的胱抑素c含量为0.1，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mg/l的六个梯度标准品，加入含吐温200.3mmol/l、叠氮钠10mmol/l、磷酸盐缓冲液10mmol/l缓冲液中。2、全自动生化仪参数设置(a)、检测波长：主波长为546nm，副波长为700nm；(b)、检测温度：37℃；(c)、反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂r2后立即测定读取吸光度a1，5分钟后读取吸光度a2，计算吸光度变化。δa＝a2-a1；(d)反应方向：负方向。3、检测步骤(a)、取200ul试剂r1与5ul血清样本(避免溶血)混匀；(b)、将混匀后的溶液在37℃孵育时间5min；(c)、再加入50ul试剂r2，立即测定读取吸光度a1，5分钟后读取吸光度a2，计算吸光度变化δa＝a2-a1。4、通过校准曲线计算出样本中胱抑素c胱抑素c的含量。下述测试为对实施例2试剂盒的性能测试将实施例2制备的胱抑素c检测试剂盒进行性能测试，主要测试其分析灵敏度、最低检出限、精密度、准确性、稳定性及抗干扰性等。1)灵敏度：灵敏度检测结果如下：2)最低检测限：采用10g/l牛血清白蛋白生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次，记录检测结果。结果显示其最低检测限为0.007ug/l。3)用本发明中的胱抑素c试剂盒检测低、中、高值3个胱抑素c含量的人血清样品各20次，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。使用3个批号试剂盒分别测定1个人血清样品20次，计算本发明检测试剂盒的批间相对极差。结果表明，本发明检测试剂盒的批内精密度和批间精密度均较好。制备的试剂盒的批内精密度结果样品1样品2样品3测定次数202020平均值(mg/l)0.513.825.04最小值(mg/l)0.503.784.97最大值(mg/l)0.533.845.11标准差(sd)0.0050.040.06变异系数(cv％)0.981.051.19制备的试剂盒的批间精密度结果试剂盒的批内精密度(cv％在0.99～1.2之间)和批间精密度(相对极差％在0.9～1.3之间)均表现良好，数据在此不一一列出。4)准确性：选择合适浓度的常规检测样本，向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本，定值样本用纯化水作为溶剂；在常规样本中加入同样量的纯化水制作成基础样本，加入定值标准品的量不超过总体积的1/10，每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为99.86％，准确度较高。5)稳定性：取胱抑素c检测试剂盒进行稳定性试验，2-8℃放置分别按时间0、3、6、9，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天、34天、36天、38天、40天、42天、44天、46天、48天、50天、52天、54天、56天、58天、60天、62天、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88和90天进行测定。结果显示胱抑素c检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为24个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为90天。6)抗干扰性：将不同浓度的干扰物加入到血清标本中，对照组加入纯化水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值，作为实测值，以加入纯化水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/l、血红蛋白≤1mg/ml、乳糜≤0.30％时对胱抑素c检测试剂盒检测结果的干扰小于9.7％。实施例4对比试剂盒的制备及使用：试剂r1中的缓冲液1采用磷酸盐缓冲液10mmol/l，其他试剂及实验方法均同实施例2。包被有胱抑素c抗体聚苯乙烯微球颗粒，粒径100nm，浓度1％。校准品：按照0.1mg/l，0.5mg/l，1.0mg/l，2.0mg/l，4.0mg/l和8.0mg/l的六个梯度标准品，将相应的胱抑素c标准品分别加入上述缓冲液，制备得到不同浓度的一组校准品。将实施例4制备的胱抑素c检测试剂盒进行性能测试，方法同实施例3。1)最低检测限：采用10g/l牛血清白蛋白生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次，记录检测结果。结果显示其最低检测限为1.0g/l。2)准确性：选择合适浓度的常规检测样本，向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本，定值样本用纯化水作为溶剂；在常规样本中加入同样量的纯化水制作成基础样本，加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10，每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为99.41％，准确度较高。3)稳定性：取本实施例的检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间0、3、6、9、12、13、14和15个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天和32天进行测定。结果显示本实施例的检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为13个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为25天。4)抗干扰性：将不同浓度的干扰物加入到血清标本中，对照组加入纯化水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值，作为实测值，以加入纯化水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/l、血红蛋白≤1mg/ml、乳糜≤0.30％时对胱抑素c检测试剂盒检测结果的干扰小于15％。综上所述，本发明所提供的优选胱抑素c检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性，且具有很好的灵敏性、准确性，有效期延长，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。当前第1页12