本发明涉及分子印迹制备领域，尤其涉及一种用于检测新霉素的新霉素分子印迹-量子点聚合物及制备方法。
背景技术：
氨基糖苷类抗生素便宜、广谱抗菌，可预防动物发病，并具有促进动物生长的作用，在我国广泛用于畜牧业和水产养殖业中，最常使用的氨基糖苷类兽药包括新霉素、庆大霉素、链霉素、二氢链霉素等。其中新霉素具有耳毒性、肾毒性、神经肌肉阻断等毒性，大量使用新霉素还容易产生耐药性。欧盟明确规定禁止使用新霉素作为家畜的生长促进剂。为保障人群健康，我国、美国、欧盟均确定了对动物源性食品中新霉素兽药最大允许残留限量。因此，如何快速准确地测定食品中新霉素兽药的残留，对保证食品安全、保障人群健康具有重要意义。
目前用于食品中新霉素兽药残留的方法有微生物法、酶联免疫(elisa)法、色谱法、质谱法等。微生物法利用抗生素可以抑制细菌生长的特点，根据细菌生长状况判断样品中是否存在抗生素，简单，无需复杂的设备，但是不能区分具体的抗生素种类。elisa法属于免疫分析方法，利用特定的抗体测定某种抗生素，操作简单，快速，特异性强，但新霉素为小分子化合物，其抗体制备困难，且抗体稳定性差，对热、ph、盐浓度等有严格要求，食品样品需要经过预处理，去除干扰物后，才能保证elisa检测的灵敏度和特异性，不宜用于现场直接快速检测。色谱法及质谱法均可测定具体新霉素的种类和含量，但需要复杂的样品前处理过程和昂贵的仪器设备，无法用于现场检测。特别是新霉素的结构缺少生色基团，在色谱检测中需要采用蒸发光散射检测器，或进行衍生后利用荧光进行测定。蒸发光散射检测器复杂昂贵，一般实验室不配备，且检测灵敏度低。衍生法灵敏度高，但影响因素众多，准确性较低。可见，目前迫切需要可快速准确地测定新霉素的新方法，以有效监测新霉素残留，保障人群健康。
荧光检测是常用的快速检测方法，灵敏度高，设备简单，但是新霉素属于无荧光基团的化合物，无法使用荧光直接检测。此外，荧光测定特异性较低，食品中的很多成分会干扰荧光检测的准确性。因此，需要一种可特异性结合靶抗生素，同时有效减少背景荧光干扰，且可以使用荧光测定不含荧光的新霉素的新方法。
人工抗体(又称分子印迹聚合物，mip)是化学合成的高分子聚合物，通过特定的空间结构和化学键(包括共价键、离子键、氢键等)特异性识别和结合靶分子，其吸附特异性与天然抗体类似，但耐受有机溶剂、离子、酸碱、高温和高压。其中含荧光的mip即荧光mip，不仅可以特异性结合模板分子，同时模板分子的结合还可以导致荧光mip发生荧光信号的改变(如荧光波长改变，或者荧光强度改变)，根据荧光信号的改变，即可测定与荧光mip特异性结合的模板分子的含量。可见，荧光mip可以利用荧光信号测定无荧光的化合物，且mip与模板分子的特异性结合保证了荧光mip检测的特异性，十分适合用于快速测定非荧光化合物，如参考文献“y.wu,etal.monitoringbisphenolaanditsbiodegradationinwaterusingafluorescentmolecularlyimprintedchemosensor.chemosphere,2015,119:515-523”。
新霉素结构上一般含两个或两个以上的氨基，并通过糖苷键进行连接。苯硼酸及其衍生物能与糖类化合物(包括氨基糖苷类抗生素)的1,2-或1,3-二醇基团以及多醇羟基相互共价键，这一反应具有较高的特异性。量子点是半导体荧光纳米材料，其荧光波谱有激发光谱宽，发射光谱窄，荧光强度高，不易发生荧光漂白等优点。已有研究发现，在量子点表面利用苯硼酸衍生物作为功能单体，合成糖蛋白mip凝胶，可同时利用mip的空间识别力和苯硼酸-糖基亲和结合力，提高mip对靶分子的结合特异性如文献“wzhang,etal.afluorescencenanosensorforglycoproteinswithactivitybasedonthemolecularlyimprintedspatialstructureofthetargetandboronateaffinity.angew.chem.int.ed.2014,53,12489–12493”。但是该方法制备的mip只能测定稀释了100倍的尿液中的靶蛋白质，显示该方法在存在高浓度干扰物的情况下检测效果不佳，不适合用于复杂样品的检测。
技术实现要素：
为了解决以上问题，本发明的目的是提供一种用于检测新霉素的新霉素分子印迹-量子点聚合物及制备方法，该新霉素分子印迹-量子点聚合物能可特异、快速、灵敏、高通量地检测新霉素含量，并提供用于检测新霉素的试剂盒。
为实现上述目的，本发明所设计技术方案包括：
用于检测新霉素的新霉素分子印迹-量子点聚合物的制备方法，包括以下步骤，首先在量子点表面修饰二氧化硅壳层得到二氧化硅壳层量子点，然后在二氧化硅壳层量子点的表面修饰硅烷化苯硼酸和新霉素得到量子点复合物，最后将量子点复合物中新霉素洗脱下来得到具有新霉素空间识别位点和苯硼酸-糖基亲和结合位点的新霉素分子印迹-量子点聚合物。
作为优选方案，用于检测新霉素的新霉素分子印迹-量子点聚合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备二氧化硅壳层量子点：
按质量比，cdte-gsh量子点(qds)、水、无水乙醇、四乙氧基硅烷(teos)与氨水为0.1～1.0:4～10:35～45:0.6～1.0:1混合均匀，无氧条件下搅拌16～24h后收集颗粒，经洗涤干燥后得到二氧化硅壳层量子点(qds@sio2)；
2)制备量子点复合物：
按摩尔比，新霉素与硅烷化苯硼酸为8～12:1溶于纯水中，然后加入qds@sio2、表面活性剂、交联剂与氨水，无氧条件下，室温搅拌20～28h后得到量子点复合物；
3)洗脱新霉素：
利用ph为4.0～5.0的盐酸溶液洗脱量子点复合物6～12次，每次洗脱30～50min，洗脱完毕后用纯水洗涤，最后离心干燥即得新霉素分子印迹-量子点聚合物(新霉素mip-量子点)。
作为优选方案，所述表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵(ctab)，所述交联剂为正硅酸乙酯(teos)。
用于检测新霉素的新霉素分子印迹-量子点聚合物，所述新霉素分子印迹-量子点聚合物为根据以上新霉素分子印迹-量子点聚合物的制备方法制备获得的。
新霉素检测试剂盒，它包括新霉素分子印迹-量子点聚合物、新霉素标准溶液以及硼酸硼砂缓冲液。
新霉素检测试剂盒使用方法为：
步骤一：将新霉素分子印迹-量子点聚合物溶解于检测液中得到新霉素mip-量子点溶液(0.025g/l),加入96孔酶标板中，立刻在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i0)。
步骤二：每孔加入10μl新霉素标准溶液或样品，反应3h后在在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i)。
步骤三：以i0/i为纵坐标，新霉素浓度为横坐标建立标准曲线，根据i0/i与新霉素浓度之间的线性关系，即可确定新霉素的浓度。
新霉素分子印迹-量子点聚合物在检测样品中新霉素含量的应用。尤其是在检测食品中新霉素含量的应用。
本发明制备新霉素分子印迹-量子点聚合物的原理为：
在量子点表面修饰透明的多孔硅胶壳层，并在其上进行分子印迹，得到多孔硅胶形成的网状结构，可起到类似分子筛的功能，不仅可以有效地保护量子点在复杂体系中的荧光稳定性(youngdokimetal.cdsequantumdot-encapsulatedmolecularlyimprintedmesoporoussilicaparticlesforfluorescentsensingofbisphenola.j.mater.chem.,2012,22,24075-24080)，还可以阻止大分子的蛋白质等物质进入。为此，本发明采用的制备方案为：首先在量子点表面修饰二氧化硅壳层，然后利用硅烷化苯硼酸为功能单体，在二氧化硅壳层表面制备同时具有空间识别位点和苯硼酸-糖基亲和结合位点的新霉素分子印迹-量子点聚合物，该新霉素分子印迹-量子点聚合物同时识别新霉素的空间结构和其表面的糖苷键，并根据新霉素与新霉素分子印迹-量子点聚合物结合前后的荧光改变，准确测定样品中的新霉素含量。
本发明的优点在于：
该方法同时利用具有新霉素空间识别位点以及苯硼酸-糖基亲和结合位点等多种结合力来提高荧光检测的特异性，量子点荧光保证了检测的灵敏度，并利用二氧化硅壳层的分子筛效应，有效减少生物单分子进入，从而提高荧光新霉素分子印迹-量子点聚合物检测食品等复杂基质中痕量的新霉素的稳定性和准确性，有效克服目前新霉素检测灵敏度和稳定性低、操作复杂等缺点，实现快速、灵敏准确地测定食品中新霉素含量，在农业、食品、环境等学科中将有很大的应用前景。
附图说明
图1为本发明合成新霉素分子印迹-量子点聚合物的流程图；
图2a为量子点(qds)的扫描电镜图，图2b为包被了二氧化硅的量子点(qds@sio2)的扫描电镜图，图2c为新霉素mip-量子点的扫描电镜图，图2d为nip-量子点(阴性对照)的扫描电镜图；
图3为新霉素mip-量子点的傅里叶变换红外光谱(ft-ir)图。其中a线为量子点，b线为qds@sio2，c线为新霉素mip-量子点，d线为nip-量子点。其纵坐标为透光度，横坐标为波数(厘米-1)；
图4为新霉素mip-量子点对不同氨基糖苷类抗生素的吸附特异性图；纵坐标为新霉素mip-量子点的荧光变化(i0/i)，横坐标为加入分析物的种类；
图5新霉素mip-量子点在含空间干扰物时对新霉素的检测特异性图；
图6为新霉素mip-量子点在含糖基位点干扰物时对新霉素的检测特异性图；
图7为新霉素检测试剂盒检测标准溶液时得到的标准曲线；
图8为多种干扰物(庆大霉素、阿米卡星、链霉素和d-葡萄糖)同时存在条件下，新霉素检测试剂盒检测新霉素的标准曲线。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。
实施例1
结合图1所示，新霉素分子印迹-量子点聚合物的制备方法是：
首先在量子点表面修饰二氧化硅壳层得到二氧化硅壳层量子点，然后在二氧化硅壳层量子点的表面修饰硅烷化苯硼酸和新霉素得到量子点复合物，最后将量子点复合物中新霉素洗脱下来得到具有新霉素空间识别位点和苯硼酸-糖基亲和结合位点的新霉素分子印迹-量子点聚合物。具体方法包括以下步骤：
1)制备二氧化硅壳层量子点：
称取0.4gcdte-gsh量子点(qds)溶于16ml纯水中，然后加入80g无水乙醇、1.6g四乙氧基硅烷与2g氨水混合均匀，无氧条件下搅拌20h后收集颗粒，经洗涤干燥后得到二氧化硅壳层量子点(qds@sio2)；
2)制备量子点复合物：
取10mol新霉素与1mol硅烷化苯硼酸，溶于纯水中混合均匀后，加入20mgqds@sio2、0.2933gctab、20μlteos与300μl氨水，无氧条件下，室温搅拌24h后得到量子点复合物；
3)洗脱新霉素：
利用ph为4.5的盐酸溶液洗脱量子点复合物10次，每次洗脱40min，洗脱完毕后用纯水洗涤6次，最后离心干燥即得新霉素分子印迹-量子点聚合物(新霉素mip-量子点)。
制备对比例：空白印迹聚合物(nip-量子点)的方法与以上新霉素mip-量子点的制备方法相同，不同在于步骤2)中不加入新霉素。
使用水热法合成亲水性cdte-gsh量子点(qds)：将cdcl2、gsh、na2teo3按摩尔比5:6:1的比例，加入过量nabh4，在ph＝10.5，温度为110℃的蒸馏水中搅拌1h后，终止反应，加入两倍体积无水乙醇，混合后离心10min(4500rpm)，弃去上清，重复3次后置于真空干燥箱中干燥，得到粉末即为cdte-gsh量子点(qds)
实施例2
以下新霉素分子印迹-量子点聚合物简写新霉素mip-量子点。
新霉素mip-量子点的性能评价
1)形态评价：如图2a～2d所示，透射电镜分析显示量子点的直径约为3nm，qds@sio2的直径约为9nm，新霉素mip-量子点的直径约为25nm，mip层的厚度约为8nm。如图3中a～d线所示，ft-ir显示qds@sio2在1068cm-1，795cm-1和463cm-1处有明显的的吸收峰，分别代表si–o–si的非对称伸缩振动、对称拉伸振动和弯曲振动，说明在量子点表面成功合成了sio2壳层。新霉素mip-量子点在在1402cm-1(b-o)和1602cm-1(c＝c)的吸收峰提示硅烷化苯硼酸功能单体的存在，证明本发明在qds@sio2的表面成功制备了mip层。
2)新霉素mip-量子点吸附容量评价：以scatchard曲线的斜率为平衡解离常数kd，以公式：[bond]/[free]＝-([bond]/kd)+(bmax/kd)，计算最大吸附容量bmax。
3)新霉素mip-量子点结合特异性评价：采用ipb(imprinting-inducedpromotionofbinding)值评价：ipb＝(cmip-cnip)/cnip×100％。其中，cmip为与新霉素mip-量子点结合的靶抗生素量，cnip为与nip-量子点结合的靶抗生素量。结果见下表1:
表1新霉素mip-量子点的吸附特性
从表1可见，新霉素mip-量子点可以特异性识别新霉素，显示本方法可以用于制备测定新霉素的mip-量子点。
实施例3
新霉素mip-量子点对新霉素的检测特异性
各种氨基糖苷类抗生素结构类似，有可能会干扰mip与模板分子的结合特异性。为此，进行以下实验：
新霉素mip-量子点对不同抗生素的检测特异性：首先将190μl新霉素mip-量子点溶液(0.025g/l)加入96孔酶标板中，立刻在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i0)。每孔加入10μl新霉素(500μg/l)，或庆大霉素+阿米卡星+链霉素+混合溶液，反应3小时后在多功能酶标仪上测定在620nm处的荧光强度(i)。计算加样前后的荧光变化值(i0/i)。结果如图4所示，新霉素对新霉素mip-量子点具有最强的荧光猝灭能力，而其它类似物所引起新霉素mip-量子点的荧光变化值(i0/i)与nip-量子点无显著差别，同时，新霉素mip-量子点的荧光变化值(i0/i)较nip-量子点大，且小于新霉素所导致的荧光变化，说明新霉素mip-量子点可特异性结合新霉素，对其他结构类似的抗生素吸附力很低。
实施例4
新霉素mip-量子点在含结构类似物时，检测新霉素的特异性
实施例3在分析了新霉素mip-量子点单独对某种抗生素结合特异性的基础上，分析新霉素mip-量子点在多种结构类似的抗生素(即存在空间结构干扰物时)，新霉素mip-量子点与新霉素的结合特异性。
新霉素mip-量子点在含空间干扰物时对新霉素的检测特异性：将190μl新霉素mip-量子点溶液(0.025g/l)加入96孔酶标板中，立刻在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i0)。每孔加入不同组合的抗生素混合液10μl(其中新霉素100μg/l，庆大霉素分别为0,10,100,500μg/l)，反应3小时后在多功能酶标仪上测定在620nm处的荧光强度(i)。如图5所示，结果表明在不同浓度庆大霉素存在条件下，新霉素mip-量子点的荧光改变(i0/i)无明显差异，说明庆大霉素的存在不影响新霉素mip-量子点对新霉素的准确定量。
实施例5
新霉素mip-量子点在含不同浓度糖基位点干扰物时，检测新霉素的特异性。
糖类化合物可能会干扰新霉素mip上苯硼酸-糖基亲和结合力，为此，分析存在糖基干扰物时，新霉素mip-量子点与模板分子的结合特异性。
新霉素mip-量子点在含糖基位点干扰物时对新霉素的检测特异性：将190μl新霉素mip-量子点溶液(0.025g/l)加入96孔酶标板中，立刻在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i0)。然后每孔分别加入10μl含新霉素和(100μg/l)和不同浓度的d-葡糖溶液(0,10,100,500μg/l)的混合液，反应3小时后在多功能酶标仪上测定在620nm处的荧光强度(i)。比较加入混合液前后的荧光变化值(i0/i)。图6所示，含d-葡萄糖的存在不影响新霉素mip-量子点对新霉素的特异性结合。
实施例6
新霉素检测试剂盒的灵敏度分析
(1)新霉素检测试剂盒对新霉素检测的灵敏度
将新霉素mip-量子点用硼酸硼砂缓冲液(ph＝9.0,0.02mol/l)稀释至0.025g/l，取190μl新霉素mip-量子点溶液加入96孔酶标板中，立刻在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i0)。每孔加入10μl新霉素标准溶液(0,2,10,50,100,250,500,1000μg/l)，反应3h后在在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i)。如图7，i0/i与新霉素浓度在2-1000μg/l范围内存线性关系，检测灵敏度为0.7μg/l，说明利用本发明制备的试剂盒检测线性范围广，灵敏度高，有望直接用于食品、环境和生物等实际样品中低浓度新霉素含量的检测分析(图7)。
(2)干扰物对新霉素检测试剂盒检测灵敏度的影响
将190μl新霉素mip-量子点溶液(0.025g/l)加入96孔酶标板中，立刻在多功能酶标仪上测定620nm处荧光强度(i0)。每孔加入10μl不同浓度新霉素(0,2,10,50,100,250,500,1000μg/l)与干扰物(庆大霉素、阿米卡星和链霉素均为100μg/l，d-葡萄糖为25μg/l)的混合液，反应3小时后在多功能酶标仪上测定在620nm处的荧光强度(i)。比较加入混合液前后的荧光变化值(i0/i)。如图8，结果表明干扰物不影响新霉素mip-量子点对新霉素的检测灵敏度(图8)。
实施例7
新霉素检测试剂盒的稳定性分析
新霉素检测试剂盒检测不同浓度新霉素标准液，新霉素的加标回收率在94.2-106.7％，日内偏差为8.1-9.5％(n＝6)，日间偏差为2.1-8.3％(n＝5)，组间差异为2.3-5.6％。
实施例8
利用新霉素检测试剂盒测定各种样品中的新霉素；
1)牛奶样品：
方法1：牛奶样品中加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，离心后，部分上清液氮气吹干后，用硼酸硼砂缓冲液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容后，用新霉素mip-量子点法检测新霉素含量。部分上清液利用商品化固相萃取(spe)进行固相萃取净化样品后，衍生后用hplc-fld测定新霉素含量。如表2所示，新霉素mip-量子点法可测定20μg/kg-400μg/kg的新霉素、而hplc-fld仅能测定100μg/kg-400μg/kg的新霉素。可见，虽然样品未经过固相萃取净化，新霉素mip-量子点法仍然可以测定样品中低浓度的新霉素，其检测灵敏度高于hplc-fld法。新霉素mip-量子点可以快速准确地测定不同浓度的新霉素。(表2)
方法2：牛奶样品离心后去除上层脂肪，再用3mol/l盐酸调节样品ph＝4.6，离心后使用mip-量子点法测定上清中新霉素的含量。由于本方法仅通过调节ph使牛奶中大部分的酪蛋白沉淀，但上清液中仍有少量的其他蛋白存在，不能直接使用hplc测定，以免造成hplc管路堵塞。结果表明新霉素mip-量子点法的加标回收率为75.9-110.7％，rsd为10.4-15.9％。可见，新霉素mip-量子点法可准确测定仅经简单处理、无法使用hplc测定的牛奶样品，新霉素mip-量子点法可用于快速测定食品中的痕量新霉素(表2)
肌肉类样品(鸡肉、猪肉、鱼肉)
肌肉组织中含有肌糖原，可以干扰mip上的苯硼酸-糖基亲和位点与新霉素含量的结合。鸡肉、猪肉、鱼肉匀浆样品中，分别加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，离心后，部分上清液氮气吹干后，用硼酸硼砂缓冲液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容，用新霉素mip-量子点法检测新霉素含量。部分上清液，利用商品化固相萃取柱(安捷伦ppl固相萃取柱)净化样品后，衍生后用hplc-fld测定新霉素含量。如表2所示，新霉素mip-量子点法可测定20μg/kg-400μg/kg的新霉素，而hplc-fld仅能测定100μg/kg-400μg/kg的新霉素。可见，虽然样品未经过固相萃取净化，新霉素mip-量子点法在多种干扰物存在时仍然可以测定肌肉样品中低浓度的新霉素含量，其检测灵敏度高于hplc-fld法。新霉素mip-量子点可以快速准确地测定肌肉组织中不同浓度的新霉素。(表2)
动物肝脏样品
动物肝脏中含有大量的肝糖原，可以干扰新霉素mip-量子点中的苯硼酸-糖基亲和位点与新霉素的结合。为此，在猪肝、鱼肝的匀浆样品中，分别加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，离心后，部分上清液氮气吹干后，用硼酸硼砂缓冲液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容，用新霉素mip-量子点法检测新霉素含量。部分上清液，利用商品化固相萃取柱(安捷伦ppl固相萃取柱)净化样品后，衍生后用hplc-fld测定新霉素含量。如表2所示，新霉素mip-量子点法可测定20μg/kg-400μg/kg的新霉素，而hplc-fld仅能测定100μg/kg-400μg/kg的新霉素。可见，虽然样品未经过固相萃取净化，新霉素mip-量子点法仍然可以测定肝脏样品中低浓度的新霉素含量，其检测灵敏度高于hplc-fld法(表2)
动物肾样品
在猪肾匀浆样品中，分别加入10％三氯乙酸(tca)作用3h，离心后，部分上清液氮气吹干后，用硼酸硼砂缓冲液(ph＝9.0,0.02mol/l)定容，用新霉素mip-量子点法检测新霉素含量。部分上清液，利用商品化固相萃取柱(安捷伦ppl固相萃取柱)净化样品后，衍生后用hplc-fld测定新霉素含量。结果显示，新霉素mip-量子点法可测定20μg/kg-400μg/kg的新霉素含量，而hplc-fld仅能测定100μg/kg-400μg/kg的新霉素含量。可见，虽然样品未经过固相萃取净化，新霉素mip-量子点法仍然可以测定肾脏样品中低浓度的新霉素含量，其检测灵敏度高于hplc-fld法。新霉素mip-量子点可以快速准确地测定猪肾中不同浓度的新霉素含量(表2)
具体结果见下表2。从表中可以看出，在加标浓度为100-400μg/kg时，新霉素检测试剂盒与hplc-fld法检测结果相当(经配对t检验，p>0.05，两种方法测定结果无显著性差异)。新霉素检测试剂盒可以检测出低浓度(20μg/kg)样品中的新霉素，而hplc-fld无法检测出，说明新霉素mip-量子点法的检测灵敏度高于hplc-fld。
表2不同方法测定各种样品中的新霉素
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。