一种乙酰谷酰胺代谢产物鉴定检测方法与流程

本发明属于药物检测分析领域，具体涉及一种乙酰谷酰胺代谢产物鉴定检测方法。

背景技术：

乙酰谷酰胺具有维持神经应激能力，改善脑功能等作用。乙酰谷酰胺通过血脑屏障后首先在星形胶质细胞内分解为γ-氨基丁酸（gaba）、谷氨酸。gaba从胶质细胞中转运释放后与神经元gaba受体结合，抑制突触后神经元兴奋，并抑制兴奋性氨基酸（eaa）的释放，对抗兴奋毒性，保护神经；gaba可提高葡萄糖磷酸酯化酶的活性，促进葡萄糖的代谢；gaba还可以促进乙酰胆碱的合成，改善神经细胞代谢，具有维持神经应激能力，改善脑功能。乙酰谷酰胺还有降低血氨的作用，在星型胶质细胞内的谷氨酸转化为谷胱甘肽，成为重要的抗氧化剂，在脑缺血和神经系统变性疾病中有着重要的神经保护作用；

谷红注射液（国药准字h22026638）是复方制剂，有效成分为乙酰谷酰胺和红花提取物，具有抗凝血、抗血栓、舒张血管、改善微循环及抗氧自由基等作用。因此用科学、准确的方法来评估乙酰谷酰胺的药效物质基础，了解其代谢产物和途径对于谷红注射液和乙酰谷酰胺的临床运用具有重要意义；

液质联用（lc-ms）技术可对相关成分进行在线分析检测，给出丰富的化合物结构信息，且由于其选择性强、碎片离子重现性好，对推测未知代谢物结构有重要意义，而且比目前采用化学结构分析手段更快速、更灵敏。四极杆-线性离子阱型串联质谱仪具有比较明显的特点，它既保留三重四极杆型的所有功能,如子离子扫描(pros)、母离子扫描(pres)、中性丢失扫描(nls)以及多反应监测或选择反应监测(mrm或srm)；又增加离子阱的多级子离子扫描功能，并且使全扫描方式的灵敏度提高。另外，还增加增强型全扫描(ems)、增强型子离子扫描(epi)、增强分辨率的q3扫描(erms)、时间延迟碎裂扫描(tdf)和多电荷增强扫描等功能；以及自动切换扫描(ida)等软件功能。同时克服传统3d离子阱的一些缺点，如低质量截止现象(1/3效应)、碰撞效率低和定量分析性能较差等。因此，这种qtrap型是一种集多种特异的定性功能与定量分析功能于一体的串联质谱仪，可广泛地应用于药物分析、药物代谢产物的定性定量分析及新药开发研究等多种领域。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种乙酰谷酰胺代谢产物鉴定检测方法，具体采用四极杆-线性离子阱型串联质谱仪，结合mim-ida和q3mi-ida扫描方法，在一针进样中同时完成乙酰谷酰胺代谢产物鉴定检测方法；

本发明采用的技术方案如下：

一种乙酰谷酰胺代谢产物鉴定检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)谷红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为8～15mg/kg。5min～8h分时间点静脉采血，血样置肝素化离心管中，离心分离血浆；

(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆，加乙腈，血浆与乙腈体积比1：3～3.5，旋涡混匀，离心，取上清作为样品待测；

(3)采用高效液相色谱-三重四极杆线性离子阱串联质谱对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、色谱条件：shimadzu20adxr；

柱温:40～60ºc；

流速:0.5～1.0ml/min；

流动相a:水（5mm乙酸铵,ph4.0～6.2）；

流动相b:乙腈；

色谱柱及洗脱方式：behamide柱，梯度洗脱：水相5%-60%；

b、质谱条件:absciexqtrap4500；

扫描模式scanmode：esinegativemode；

气帘气cur:25psi；

喷雾电压is:5500v；

离子源温度tem:500～650℃；

雾化气gs1:60psi；

加热气gs2:60psi；

碰撞气cad:medium；

(4)根据乙酰谷酰胺代谢特点，质谱采用mim-ida和q3mi-ida方法检测，multipleionmonitoring(mim)为预扫描模式，采用mim-ida-epi的工作流程。qtrap®系统结合lightsight®软件进行代谢物鉴定；

进一步，所述步骤（1）中，谷红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为10mg/kg，5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h。分时间点静脉采血，血样置肝素化离心管中，5000r/min离心分离血浆；

所述步骤（2）中，血样处理方法：微量加样器吸取血浆200μl，加乙腈，血浆与乙腈体积比1：3.5，旋涡混匀30s，12000r离心10min，取上清作为样品待测；

所述步骤（3）中，柱温:40ºc，流速:0.5ml/min；

所述步骤（3）中，流动相a:水（5mm乙酸铵，ph6.2）；

所述步骤（3）按以下方法操作：梯度洗脱条件：0～1min，流动相a的体积分数为5%；1～5min，流动相a的体积分数从5%增加为10%；5～10min，流动相a的体积分数从10%增加到60%；10～12min，流动相a的体积分数为60%，12～12.1min，流动相a的体积分数从60%减少到5%，12.1min之后，流动相a的体积分数保持5%。梯度洗脱中，流动相a和流动相b的体积分数之和为100%；

所述步骤（3）中，离子源温度tem:575℃；

更具体的，优选本发明方法按以下步骤操作：

(1)取谷红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为10mg/kg，5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h分时间点静脉采血，血样置肝素化离心管中，5000r/min离心分离血浆；

(2)血样处理方法：微量加样器吸取血浆200μl，加乙腈，血浆与乙腈体积比1：3.5，旋涡混匀30s，12000r离心10min，取上清作为样品待测；

(3)采用四极杆-线性离子阱型串联质谱仪，结合mim-ida和q3mi-ida扫描方法对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、色谱条件：shimadzu20adxr；

柱温:40ºc；

流速:0.5ml/min；

流动相a:水（5mm乙酸铵,ph6.2）；

流动相b:乙腈；

色谱柱及洗脱方式：behamide柱，梯度洗脱：0～1min，流动相a的体积分数为5%；1～5min，流动相a的体积分数从5%增加为10%；5～10min，流动相a的体积分数从10%增加到60%；10～12min，流动相a的体积分数为60%，12～12.1min，流动相a的体积分数从60%减少到5%，12.1min之后，流动相a的体积分数保持5%。梯度洗脱中，流动相a和流动相b的体积分数之和为100%；

b、质谱条件:absciexqtrap4500；

扫描模式scanmode：esinegativemode；

气帘气cur:25psi；

喷雾电压is:5500v；

离子源温度tem:575℃；

雾化气gs1:60psi；

加热气gs2:60psi；

碰撞气cad:medium；

(4)根据乙酰谷酰胺代谢特点，质谱采用mim-ida和q3mi-ida方法检测，multipleionmonitoring(mim)为预扫描模式，采用mim-ida-epi的工作流程。此模式采用q3和q1设置为相同质荷比的mrm方法，实验中检测101对离子对。质量范围为100.1da-200.1da，该模式下不需要预测可能的生物转化过程。为避免母离子在q2碰撞池碎裂，将ce设置为5v。每对离子对驻留和停顿时间设为1毫秒，一个扫描周期需要0.8秒。qtrap^®系统结合lightsight^®软件进行代谢物鉴定；

本检测方法发现通过mim-ida-epi采集模式检测到3种乙酰谷酰胺在体内的可能代谢产物（乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸）。乙酰谷酰胺标准品和血浆样品中均可发现保留时间不同的3个异构体峰，其二级谱图一致。除乙酰谷酰胺外，乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸均为内源性物质。因此，其药时曲线与一般外源性药物代谢产物的药时曲线不同。实验中未发现γ-氨基丁酸。推测可能是因为组织分布不同，γ-氨基丁酸更多的存在于神经系统中。此方法灵敏度高、可靠、快速，该方法的建立为今后同类药物的定性定量分析提供基础；

下面将结合附图、实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

附图说明

图1：乙酰谷酰胺在负离子模式下二级谱图；

图2：乙酰谷酰胺可能代谢途径图；

图3：乙酰谷酰胺质谱图和在血浆中的时间变化曲线图；

图4：乙酰谷氨酸质谱图和在血浆中的时间变化曲线图；

图5：谷氨酰胺质谱图和在血浆中的时间变化曲线图；

图6：谷氨酸质谱图和在血浆中的时间变化曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案、积极效果更加清楚明白，通过以下实施例对本发明进行进一步详细说明。以下对于具体实施方案的描述仅用于解释本发明，并不限定本发明；

一种乙酰谷酰胺代谢产物鉴定检测方法

一、仪器：

四极杆-线性离子阱型串联质谱仪（液相shimadzu20adxr，质谱absciexqtrap4500）；

二、样品准备：

取谷红注射液尾静脉注射sd大鼠，注射量为10mg/kg，5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h分时间点静脉采血，血样置肝素化离心管中，5000r/min离心分离血浆。微量加样器吸取血浆200μl，加乙腈，血浆与乙腈体积比1：3.5，旋涡混匀30s，12000r离心10min，取上清作为样品待测；

三、检测条件：

采用四极杆-线性离子阱型串联质谱仪，结合mim-ida和q3mi-ida扫描方法对样品进行检测分析，仪器条件如下：

a、色谱条件：shimadzu20adxr；

柱温:40ºc；

流速:0.5ml/min

流动相a:水（5mm乙酸铵,ph6.2）；

流动相b:乙腈；

色谱柱及洗脱方式：behamide柱，梯度洗脱：0～1min，流动相a的体积分数为5%；1～5min，流动相a的体积分数从5%增加为10%；5～10min，流动相a的体积分数从10%增加到60%；10～12min，流动相a的体积分数为60%，12～12.1min，流动相a的体积分数从60%减少到5%，12.1min之后，流动相a的体积分数保持5%。梯度洗脱中，流动相a和流动相b的体积分数之和为100%；

b、质谱条件:absciexqtrap4500；

扫描模式scanmode：esinegativemode；

气帘气cur:25psi；

喷雾电压is:5500v；

离子源温度tem:575℃；

雾化气gs1:60psi；

加热气gs2:60psi；

碰撞气cad:medium；

四、分析方法

根据乙酰谷酰胺代谢特点，质谱采用mim-ida和q3mi-ida方法检测，multipleionmonitoring(mim)为预扫描模式，采用mim-ida-epi的工作流程。此模式采用q3和q1设置为相同质荷比的mrm方法，实验中检测101对离子对。质量范围为100.1da-200.1da，该模式下不需要预测可能的生物转化过程。为避免母离子在q2碰撞池碎裂，将ce设置为5v。每对离子对驻留和停顿时间设为1毫秒，一个扫描周期需要0.8秒。qtrap^®系统结合lightsight^®软件进行代谢物鉴定；

乙酰谷酰胺代谢物鉴定小结：

①通过mim-ida-epi采集模式检测到3种乙酰谷酰胺在体内的可能代谢产物（乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸）；

②乙酰谷酰胺标准品和血浆样品中均可发现保留时间不同的3个异构体峰，其二级谱图一致；

③除乙酰谷酰胺外，乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸均为内源性物质。因此，其药时曲线与一般外源性药物代谢产物的药时曲线不同；

④实验中未发现γ-氨基丁酸。推测可能是因为组织分布不同，γ-氨基丁酸更多的存在于神经系统中；

此方法灵敏度高、可靠、快速，该方法的建立为今后同类药物的定性定量分析提供基础；本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。