一种牛源肌酸激酶同工酶双抗体夹心ELISA快速检测试剂盒的制作方法

本发明涉及胶体金免疫层析快速检测领域，具体涉及一种牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)双抗体夹心elisa快速检测试剂盒及方法。
背景技术：
：近年来我国奶牛业发展十分迅速，然而不孕症对奶牛养殖业的发展有着重要的影响。大量资料表明，不孕症占奶牛疾病的20％～30％，子宫内膜炎占不孕症的40％～60％。引起奶牛子宫内膜炎的病因较多，但主要原因是产后的早期感染所致，有研究表明奶牛产后的早期阶段有93％的牛发生子宫感染细菌，到46-60天时感染率降低到39％。奶牛子宫内膜炎使受精卵不能着床或胚胎早期死亡，延迟了产犊间隔，严重影响奶牛的繁殖和生产能力及效率，给奶牛生产造成极大的经济损失。据资料报道，美国每年有12.19％的奶牛由于不孕症或繁殖疾病而被淘汰，占淘汰母牛的52.37％，每年因不孕症损失高达2.7亿美元；北京农业大学对北京、南京、上海等16个城市调查，子宫内膜炎占不孕奶牛的68.34％，国内每年淘汰的不孕奶牛占淘汰总数的60％-70％。肌酸激酶(creatinekinase,ck；ec2.7.3.2)分子量81000～82000da，是由两个亚基(m和b)组成的二聚体，可逆催化肌酸与atp之间的转磷酰基反应，在肌酸和磷酸肌酸的转化反应中起着重要的作用。比如在能量代谢最旺盛的肌肉组织和脑组织中，ck的活性是最高的。在内脏器官中，子宫是ck第三活跃的器官，头两位是骨骼肌和心肌。根据其同工酶亚基和分布位置的不同，在牛中存在有三种ck同功酶，其中：ck-mm(特异存在于骨骼肌)、ck-mb(特异存在于心肌)和ck-bb(从牛脑中获得)。以上这些同功酶都存在于细胞质中，galitzer和oehme(1985)对牛所有器官的ck进行检测发现，内脏器官中含有的ck要远远少于骨骼肌和心肌，并且大部分的ck属于同功酶ck-bb。健康牛血清中的ck组成几乎全部由ck-mm构成，但研究发现在怀孕中和产后妇女、怀孕豚鼠的血清中还存在有可检测到的ck-bb(脑源或平滑肌源)和ck-mb(clarketal.,1994)。造成以上现象的原因很有可能是在怀孕后期对能量(新陈代谢)更高的需求(clarketal.,1994)，即子宫组织在分娩前后对其机械性和新陈代谢有更高的要求(abramovetal.,1996)。我们研究表明子宫内膜感染发炎后血清肌酸激酶活性显著增高，据研究结果其可作为奶牛子宫内膜炎的重要诊断指标。目前，奶牛子宫内膜炎的诊断主要依靠视诊、触诊和子宫探针为主的传统方法，存在早期诊断确诊率低和导致植入性病原菌二次感染的问题。因此，迫切需要研究建立一种适用于奶牛子宫内膜炎早期排查的快速、灵敏、经济适用、操作简便的现场快速检测方法。技术实现要素：本研究根据奶牛子宫内膜炎与血清肌酸激酶活性的正相关性，通过重组表达牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)，制备筛选鼠源单克隆抗体，进一步利用双抗体夹心elisa法研制了一种快速检测牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的双抗体夹心elisa试剂盒，用于田间监测产后奶牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)的变化。本发明的目的是提供一种牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的双抗体夹心elisa试剂盒及方法，由此快速即时检测子宫内膜炎，通过双抗体夹心elisa试剂盒定量检测的方法，检测牛血清中肌酸激酶同工酶(ck-bb)的浓度，从而用于评估奶牛子宫内膜炎情况，准确，快速，灵敏度高，无需专业人员操作，成本较低，便于推广使用。为达到上述目的，本发明采用第一技术方案：一种牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的双抗体夹心elisa试剂盒，包括：包被捕获抗体的酶标板，封闭液，洗涤液，底物显色液，终止液以及检测抗体。所述捕获抗体是鼠抗ck-bb单抗。所述检测抗体是hrp标记的鼠抗ck-bb单抗。利用所述牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的双抗体夹心elisa试剂盒检测牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的方法，其步骤如下：(1)用cb将ck-bb单抗稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃包被过夜；(2)洗板3-5次，拍干，标品/样本100ul，25℃反应45min；(3)洗板3-5次，拍干，加入酶标抗体，25℃避光反应30min；(4)洗板3-5次，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15min；加终止液后测值od450(5)标准方程的建立：使用酶标仪测定已知浓度的牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)，得到对应的od405-ck-bb浓度对数值，拟合得出线性标准线性方程；(6)待测样品的测定：将测得的od405值作为x值代入方程，计算出的y值，y值为ck-bb浓度(ng/ml)的对数值，进而计算出待测样品中ck-bb的浓度。与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：试剂盒中，作为检测标记物ck-bb的单克隆抗体，标记条件成熟稳定无毒，试剂盒本身分辨率、灵敏度、稳定较强，可做定量检测。本发明的ck-bb双抗体夹心elisa快速检测试剂盒及检测系统，操作简单直接加血清样本、检测时间短，适合于推广使用，克服了现有化学发光法，价格昂贵，检测耗时且需要投入专业操作人员的缺点，能独立处理数据从而定量检测的优点，特别适合牛血清ck-bb水平在基层牧场的检测。本发明通过临床验证、评价和对本方法的完善，提高检测血清肌酸激酶指标揭示和反应奶牛子宫内膜感染炎症程度的灵敏性、准确性，最终建立奶牛子宫内膜炎早期快速诊断新方法，做到不需要专业仪器，通过简单操作，实现在田间进行奶牛子宫内膜炎现场快速检测和辅助临床检查做出早期快速诊断。附图说明下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：图1以牛心源肌酸激酶(ck-mb)为标准物采用sds-page电泳，检测子宫内膜炎牛血清样本，图中的ck标准物为商品牛源ck-mb和兔源ck；图2样本牛血清与ck-bb多克隆抗体wb检测，图2-a为正常曝光时间拍得wb照片，图2-b为长时间曝拍得wb照片；图2-c表明所有样本血清中的均与抗ck-bb多克隆抗体有特异性反应；图3质粒pet28b-ck-bb经ndei和xhoi双酶切；图4牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白诱导结果：1：诱导前总蛋白，2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀；图5牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白蛋白纯化sds-page分析图，m：proteinmarker；1：上样；2：流出；3：10mmimidazole洗脱组分；4：20mmimidazole洗脱组分；5-9：50mmimidazole洗脱组分；10-12：500mmimidazole洗脱组分；图6为牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白蛋白sds-page分析图，m：proteinmarker；1：目的蛋白；图7牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白westernblot分析图m：proteinmarker；1：目的蛋白；图8试剂盒elisa条件优化标准曲线图；图9elisa线性标准线性方程。具体实施方式实施例1.奶牛血清中肌酸激酶与子宫内膜炎的相关性研究取得通过常规方法确诊为患有子宫内膜炎牛的血清，检测其肌酸激酶(ck)值，通过对照与阳性组的比较，确定牛子宫内膜炎与ck的相关性。采集到来自呼和浩特和包头周边牛场的多份临床症状为奶牛子宫内膜炎患牛血清，进行生化分析检测肌酸激酶活力并得到相关数据。以牛心源肌酸激酶(ck-mb)为标准物采用sds-page电泳，检测子宫内膜炎牛血清样本(图1)，通过观察目的条带的大小和颜色的深浅判断临床血清样本ck与牛心源肌酸激酶(ck-bb)为标准物的一致性和符合度。初步研究结果如下：1、临床诊断为奶牛子宫内膜炎的病牛血清样本中的ck活性比健康牛值显著增高。正常牛只的血清肌酸激酶活性在80-200u/l，主要集中在100-200u/l，感染牛只在200-1796u/l。2、图中的ck标准物为商品牛源ck-mb和兔源ck，与临床血清样本ck有较大差异，结合有关人和动物的ck监测结果，基本判定与临床确诊为子宫内膜炎相关的病牛血清样本ck本质是ck-bb。我们还从牛场采集到的临床症状符合奶牛子宫内膜炎的病牛血清6份，进行ck活力检测(表1)，同时采用蛋白免疫印迹方法wenstern-blot，以兔抗重组表达ck-bb的多克隆抗体检测临床样本血清中ck与重组表达ck-bb多克隆抗体的特异性结合率(图2)，以考察重组表达ck-bb与临床血清样本ck的相关性，结果显示：1、6个临床确诊子宫内膜炎病牛血清中肌酸激酶ck活性均增高。2、重组表达ck-bb的兔源多克隆抗体与临床确诊子宫内膜炎病牛血清中肌酸激酶ck有特异性的结合，为研制胶体金免疫层析试纸条奠定了理论基础。表1样本牛血清ck活力检测综合奶牛血清中肌酸激酶与子宫内膜炎的相关性研究结果及重组牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)蛋白免疫印迹(western-blot)分析结果，可以确定由重组牛肌酸激酶同工酶(ck-bb)开始研制检测牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)双抗体夹心elisa快速检测试剂盒。实施例2.全基因合成牛肌酸激酶同功酶ck-bb由于牛子宫内膜炎与血清中牛肌酸激酶同功酶ck-bb具有高相关性，因此采用牛肌酸激酶同功酶ck-bb作为抗原制备相关单抗和多抗。在本发明中，关键的试剂牛脑源或平滑肌源肌酸激酶ck-bb的短缺，严重制约了实验的开展。由于ck-bb的应用较小，市面上的牛源肌酸激酶大多数是以ck-mb为主要成分，没有ck-bb的商品，给研究造成了困难。为了解决ck-bb不足的问题，发明人研究决定采用全基因合成的方法合成牛源ck-bb基因，并对其进行原核表达。通过ncbi查询到牛肌酸激酶ck-bb的氨基酸序列，序列号为：genbank:aax08725.1并对其进行适用于大肠杆菌bl21的密码子优化，采用二步法人工合成牛ck-bb的全基因。接下来将合成好的全基因连接到表达载体pet28b，转化入大肠杆菌bl21(de3)，经小量表达试验测得有大量目的蛋白表达，成功制备了牛肌酸激酶同功酶ck-bb的大肠杆菌工程菌，为后期大量制备牛ck-bb奠定了坚实的基础。简述实验过程如下：2.1ck-bb基因遗传密码子改造及引物的设计和人工合成根据牛肌酸激酶同功酶ck-bb的氨基酸序列(genbank:aax08725.1)，在bioedit软件的辅助下推导出该基因的核苷酸序列，将起始密码子atg和终止密码子taa分别添加于ck-bb序列的5’端和3’端；使用dnaworks软件以大肠杆菌密码子使用频率为基准，对该基因的密码子进行优化，引物设计合成54条互相重叠的40bp的引物，从中选取引物ck-1和ck-54(见表2)分别引入ndei和xhoi酶切位点。引物合成后经脱盐、page纯化后备用。引物名称引物序列ck-1gcctggtgccgcgcggcagccatatgcctttcagcaack-54cagtggtggtggtggtggtgctcgagtttctgc表2ck-bb全基因合成和扩增编码dna引物序列2.2牛肌酸激酶同功酶ck-bb的全基因合成首先对合成ck-bb全基因测序结果，随后人工合成改造后的牛肌酸激酶同功酶ck-bb全基因序列(seqidno:1)，合成的质粒pet28b-ck-bb可经ndei和xhoi双酶切(图3)。2.3通过原核表达系统，小量表达重组牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白。pet28b-ck-bb阳性质粒转化原核表达宿主菌bl21和rosetta，涂布于对应固体培养基，37℃培养12-16h。挑取单菌落于对应液体培养基培养12-16h，保存甘油菌于-80℃。菌种活化：复苏菌种，37℃过夜培养活化。诱导表达：次日，菌种以1：50扩大培养5ml，37℃培养至od600＝0.4-0.6，收取2.5ml菌种经处理作为诱导前对照。剩余2.5ml加入0.5mm的iptg，37℃诱导表达3h，离心收集的菌体经处理作为诱导后样品，sds-page鉴定蛋白的表达情况。原核表达载体信息：复苏pet28b-ck-bb(bl21)菌种，37℃过夜培养活化。次日，菌种以1：50扩大培养800ml，37℃培养至od600＝0.4-0.6，加入0.5mm的iptg，37℃诱导表达5h。8000rpm、4℃离心5min，收集菌体。加100ml破碎液进行超声波裂解。裂解条件：温度冰浴、功率60％、超声2s、间隔2s、时间15min。12000rpm、4℃离心15min，收集上清和沉淀。sds-page检测，判断目的蛋白的表达形式。利用高亲和性ni树脂纯化上清，收集流穿液、洗脱液，sds-page检测蛋白纯化效果。将纯化的目的蛋白透析去除咪唑，sds-page检测蛋白透析效果。检测效果如下：(1)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白诱导结果通过对重组表达样品进行sds-page分析(图4)，由sds-page图可以看出，在37℃沉淀中有明显表达。(2)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白蛋白镍琼脂糖亲和层析sds-page结果(图5)通过图sds-page分析图可以看出，目的蛋白50mm、100mm和500mmimidazole时被陆续洗脱下来，在500mm处时目的蛋白的纯度较好。取10-12处的蛋白加0.3％skl透析至10mmpbs，0.1％skl，ph8.0中。浓缩，过滤除菌，分装后于-80℃保存。(3)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白最终纯化sds-page分析(图6)(4)牛肌酸激酶同功酶ck-bb蛋白westernblot分析(图7)实施例3.ck-bb单克隆抗体的制备1.小试：pet28b-ck-bb阳性质粒转化bl21和rosetta宿主菌，小试均有明显表达。2.抗原制备：大量诱导表达pet28b-ck-bb(bl21)，目的蛋白在上清和包涵体明显表达，优先纯化上清，上清经纯化、透析，最终得到ck-bb重组蛋白5mg，蛋白纯度＞90％。3.多抗制备：制备了多克隆抗体，效价1:243000。4.单抗制备：制备了单克隆抗体，筛选到阳性细胞株5株。5.抗体制备与纯化：植腹水，纯化得到单克隆抗体。6.抗体配对筛选：使用elisa方法对抗体进行配对筛选，获得能配对的抗体对。7.elisa条件优化：选取效果最好的抗体对进行elisa条件优化。制备方法简述如下：取2月龄雌性新西兰大白兔一只进行免疫，共进行三次免疫，采取大腿肌肉多点注射。每次每只新西兰大白兔抗原免疫用量为500ug，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，耳静脉注射。第二次免疫后14天静脉采血，通过间接法测抗体效价，以此确定是否有针对目标的抗体生成。效价达标之后第三次进行加强免疫；效价不达标，则第三次继续弗氏不完全佐剂皮下进行免疫，28天后第四次进行加强免疫。加强免疫14天后取血。取6周龄雌性balb/c小鼠四只进行免疫，共进行三次免疫，采取批下多点注射。每次每只小鼠抗原免疫用量为25ug，初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫用等量弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫用等量生理盐水混合，腹腔注射。第二次免疫后10天尾静脉采血，通过间接法测抗体效价，以此确定是否有针对抗原的抗体生成。比较四只小鼠效价，最后选择抗体效价较高的小鼠用于细胞融合。融合前三天，用抗原直接加强免疫一次，剂量同前。从液氮中取出冻存骨髓瘤细胞细胞，立即放入37℃水浴中融化，离心，弃上清，用少量完全培养液打散细胞团，加入约完全培养基于冻存管中，用吸管吹打均匀，全部吸出转至细胞培养瓶中，置于37℃二氧化碳培养箱中培养。待细胞长满瓶底后传至另一细胞瓶中培养，在倒置显微镜下观察其细胞状态，状态良好的细胞备做融合用。取效价最高且加强免疫的小鼠，眼球摘除采血，分离血清作为检测时的阳性对照血清。将小鼠颈椎脱臼致死，浸泡于酒精消毒，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开左侧皮肤和腹膜，无菌取出脾脏置于已盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛约有基础培养液的平皿内的滤膜中，用两个注射器上的弯针头将脾脏刺孔,然后其中一个弯针头固定滤膜，另一个弯针头挤压滤膜，使脾细胞完全释放到平皿中的基础培养液中。用无菌滴管吹打细胞制成单细胞悬液，收获脾细胞悬液。将平皿中脾细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次。用peg将分离得到的脾细胞与提前复苏备用的骨髓瘤细胞进行融合，离心，弃上清，用细胞培养液离心洗涤一次，加入用hat的细胞培养液吹打成单细胞悬液，铺入96孔细胞培养板。细胞融合后第7天，培养板孔底长出肉眼可见的克隆，首先通过elisa间接法对所有细胞孔进行初次筛选，记录呈现强阳性的细胞孔。对初筛呈阳性的各细胞孔应及时在24孔细胞培养板中进行扩大培养和克隆化。采用有限稀释法将细胞悬液连续稀释至统计上每孔加样仅含单个细胞，转移至96孔板培养，经过数次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将获得的阳性杂交瘤细胞在细胞培养瓶中扩大培养，而后冻存及制备腹水等。取6周龄健康雌性小鼠，腹腔注射0.5ml液体石蜡致敏，一到两周后，每只小鼠腹腔注射1-2x106个杂交瘤细胞，观察小鼠状态7-10天后待小鼠腹腔明显膨大后收集腹水，离心上清液即为腹水，分装、标记，备用。腹水离心15min(4000rpm，室温)，取上清，在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至半饱和，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)；在4℃搅拌下逐滴缓慢加入饱和硫酸铵至33％，继续搅拌30min，离心30min(13000rpm，4℃)，弃上清；沉淀溶于适量pbs(0.01m,ph7.4)，4℃透析过夜，测定抗体含量，-20℃冻存备用。硫酸铵沉淀后继续采用proteing小柱进行纯化，新柱子先用5ml超纯水过柱，再用5ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；继续10ml0.4mpb缓冲液(ph7.0)平衡纯化小柱；5ml0.1m甘氨酸-盐酸缓冲液(ph2.7)洗脱结合位点上的抗体，并加入1mtris-hcl(ph8.0)中和甘氨酸，使ph保持为适合抗体保存的中性。应用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒进行测定以及应用间接elisa方法测定抗体效价。实施例4.牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的双抗体夹心elisa试剂盒的制备方法1.elisa条件优化2.1单-单配对灵敏度检测选取配对效果较好的2组，进行灵敏度检测。fl155-2/4两支单抗作为捕捉抗体，fl155-1-hrp作为检测抗体，检测灵敏度达12.5ppb。2.2试剂盒条件优化fl155-2单抗作为捕捉抗体，fl155-1-hrp作为检测抗体，进行条件优化(图8)。标品ppbod802.207401.192200.763100.40900.075最终确定，fl155-2单抗5ug/ml包被，fl155-1-hrp1:1k稀释，检测灵敏度达10ppb，线性范围10-80ppb。实施例5.牛源肌酸激酶同工酶(ck-bb)的双抗体夹心elisa试剂盒的检测方法1、检测方法采用双抗夹心elisa法对实际样本进行检测，操作步骤如下：a、用cb将ck-bb单抗稀释至5ug/ml，每孔100ul，4℃包被过夜；b、洗板3-5次，拍干，标品/样本100ul，25℃反应45min；c、洗板3-5次，拍干，加入酶标抗体，25℃避光反应30min；d、洗板3-5次，拍干，加入显色剂，25℃避光反应15min；e、加终止液后测值od450。2、预实验6支样本10倍稀释后检测均为弱阳性，接下来降低样本稀释倍数。3、实际样本检测根据预实验的检测结果及样本量，将血清样本的稀释度调整为2。3.1标准曲线作图(图9)：提供3组样本，ck-bb血清样本检测结果如下：结论：3组共31个样本2倍稀释，基本都能检测出，具体数据参照检测结果。当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12