本发明涉及一种氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法。
背景技术：
氨甲环酸化学名反-4-(氨甲基)环己烷甲酸，又名止血酸、凝血酸，是一种蛋白酶抑制剂。目前，氨甲环酸作为化妆品原料中的美白成分已被广泛关注，它能美白淡化斑点，美白效果比维生素c高约50倍，是果酸的近10倍左右。氨甲环酸作为美白剂，关键品质项目为有关物质含量控制，品质标准中有关物质含量≤0.5％，如超出标准则影响产品品质。因此，有关物质含量控制对产品品质保障尤为关键。现有的通过hplc检测氨甲环酸或其有关物质的方法，都参照《中国药典》2015版二部方法，国内外药典如《英国药典》2007版检测方法相同，共同问题是流动相较复杂。童菲等的《氨甲环酸有关物质及其含量分析方法的研究》和陈玉兰的《化妆品原料美白剂氨甲环酸有关物质的测定及其含量分析》中，流动相均为：ph2.5磷酸盐缓冲液(取11.0g无水磷酸二氢钠，溶于500ml水中，加5ml三乙胺与1.4g十二烷基硫酸钠，用稀磷酸调节ph值至2.5，以水稀释至600ml，即得)-甲醇(60:40)。goobie及其团队中，将两种组分混合作为流动相，其中a组分为70mmol/l的乙酸钠(ph6.5)和乙腈(75:25v:v)，b组分为乙腈：水：甲醇(450:400:150v:v:v)。fiechtner等采用的流动相也较为复杂。通常氨甲环酸这类有机分子用液相色谱联用紫外分光光度检测，常使用普通的反相柱，比如c18柱；由于氨甲环酸分子结构的特殊性，必须使用特殊的缓冲盐流动相，比如：离子对试剂，从而改善其峰形进行定量检测。这样导致流动相非常复杂。可见，现有技术中氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法中，流动相的组成较为复杂，成本高，流动相中的水相需要另外配置，操作繁琐。因此，本领域亟需一种流动相组成简单、成本低、操作简便的用于检测氨甲环酸或其有关物质的含量的方法，既有利于企业对内部产品的质控，也可用来加强政府部门对市场的监控。技术实现要素：本发明为了克服现有技术中氨甲环酸或其有关物质的含量检测方法的流动相组成复杂，成本高，水相需要另外配置，操作繁琐，检测效率低等缺陷，而提供了一种氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法。本发明的方法，流动相组成简单，成本低，操作简便，同时采用该流动相进行检测后，色谱柱在正式进样检测前平衡时间短，色谱峰峰形对称无拖尾和前伸，检测准确性高，单次进样检测只需15min，因此样品分析效率大大提高，而且检测重现性和准确性也优于药典方法。对药典中的氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法的改进有一定的技术难度。本申请发明人在研发之初，试图调整药典方法的流动相，水相仅使用磷酸盐缓冲溶液的体系，分别配制高低两个浓度缓冲盐流动相10mmol/l-50mmol/l磷酸二氢钾(磷酸调ph＝2.5)，并尝试了以键合相c18的kromasil柱、eclipseplus柱、以金刚烷为键合相的adme柱，最终未得到对称的峰形，并无法准确定量。在上述相同的流动相下，本申请的发明人还尝试了cr柱，峰形对称性仍不理想，氨甲环酸和相关杂质分离度有待改进。此外，本申请的发明人还发现，用高浓度磷酸盐溶液作为流动相后，极易出现盐析，对hplc仪器的泵头和色谱柱产生危害，降低色谱柱寿命。相比之下，用简单的磷酸水溶液体系作为流动相更有优势，无固体盐析出问题对hplc的系统和色谱柱造成的损坏，降低了hplc日常维护难度。最终，本申请的发明人通过适用简单的磷酸水溶液和极性有机溶剂作为流动相，采用cr柱，并对氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法做了各项参数的考察，最终实现了氨甲环酸或其有关物质(即氨甲环酸自身的杂质)和化妆品配方的基质完全分离。本发明主要是通过以下技术方案解决上述技术难题的。本发明提供了一种氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法，其包含下列步骤：采用高效液相色谱联用紫外分光法分析氨甲环酸；其中，所述的高效液相色谱联用紫外分光法中的色谱柱为cr柱；流动相为磷酸、水和极性有机溶剂的混合溶液；所述的流动相中，所述的极性有机溶剂和水的体积比为20％：80％～80％：20％。所述的流动相中，所述的极性有机溶剂和水的体积比优选30％：70％～70％：30％；更优选65％：35％。所述的cr柱为本领域常规的cr柱，cr柱的填料通常为强阳离子交换与反相c18混合填料，优选c18与磺酸基按1:4-1:50混合的填料。所述的cr柱的填料的粒径优选3-5μm。所述的cr柱的内径优选2.0-4.6mm；长度优选35-250mm。本发明中，所述的cr柱优选capcellpakcr1：4(3μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：4(3μm，2.0mm×100mm)、capcellpakcr1：4(3μm，2.0mm×150mm)、capcellpakcr1：4(4.6μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：20(3μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：20(3μm，2.0mm×100mm)、capcellpakcr1：20(3μm，2.0mm×150mm)、capcellpakcr1：20(3μm，2.0mm×250mm)、capcellpakcr1：50(3μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：50(3μm，2.0mm×100mm)、capcellpakcr1：50(3μm，2.0mm×150mm)、capcellpakcr1：50(3μm，2.0mm×250mm)、capcellpakcr1：4(5μm，2.0mm×35mm)、capcellpakcr1：4(5μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：4(5μm，2.0mm×75mm)、capcellpakcr1：4(5μm，2.0mm×100mm)、capcellpakcr1：4(5μm，2.0mm×150mm)、capcellpakcr1：4(5μm，2.0mm×250mm)、capcellpakcr1：4(5μm，4.6mm×35mm)、capcellpakcr1：4(5μm，4.6mm×50mm)、capcellpakcr1：4(5μm，4.6mm×75mm)、capcellpakcr1：4(5μm，4.6mm×100mm)、capcellpakcr1：4(5μm，4.6mm×150mm)、capcellpakcr1：4(5μm，4.6mm×250mm)、capcellpakcr1：20(5μm，2.0mm×35mm)、capcellpakcr1：20(5μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：20(5μm，2.0mm×75mm)、capcellpakcr1：20(5μm，2.0mm×100mm)、capcellpakcr1：20(5μm，2.0mm×150mm)、capcellpakcr1：20(5μm，2.0mm×250mm)、capcellpakcr1：20(5μm，4.6mm×35mm)、capcellpakcr1：20(5μm，4.6mm×50mm)、capcellpakcr1：20(5μm，4.6mm×75mm)、capcellpakcr1：20(5μm，4.6mm×100mm)、capcellpakcr1：20(5μm，4.6mm×150mm)、capcellpakcr1：20(5μm，4.6mm×250mm)、capcellpakcr1：50(5μm，2.0mm×35mm)、capcellpakcr1：50(5μm，2.0mm×50mm)、capcellpakcr1：50(5μm，2.0mm×75mm)、capcellpakcr1：50(5μm，2.0mm×100mm)、capcellpakcr1：50(5μm，2.0mm×150mm)、capcellpakcr1：50(5μm，2.0mm×250mm)、capcellpakcr1：50(5μm，4.6mm×35mm)、capcellpakcr1：50(5μm，4.6mm×50mm)、capcellpakcr1：50(5μm，4.6mm×75mm)、capcellpakcr1：50(5μm，4.6mm×100mm)、capcellpakcr1：50(5μm，4.6mm×150mm)或capcellpakcr1：50(5μm，4.6mm×250mm)。所述的极性有机溶剂可为氨甲环酸或其有关物质检测方法中常规的极性有机溶剂，优选乙腈和/或甲醇。所述的流动相中，所述的磷酸的用量可为分析化学领域高效液相色谱法中常规的用量，其体积优选为极性有机溶剂和水总体积的0.05％-0.3％，更优选0.1％-0.3％(例如0.2％)。所述的磷酸为本领域常规的磷酸试剂，一般市售可得，其中磷酸含量优选85％以上，所述的百分比是指磷酸的质量占磷酸试剂总质量的百分比。所述的氨甲环酸是指本领域常规的氨甲环酸的制备方法制得的氨甲环酸原料药，或者市售可得的氨甲环酸试剂。本发明来自化妆品产品配方原料，由原料供应商提供(例如湖南洞庭药业股份有限公司，批号：x1501311m，hplc纯度100％)。本发明中，氨甲环酸标准品购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236。所述的高效液相色谱联用紫外分光法中，除流动相和色谱柱外，其他色谱条件可为本领域常规的色谱条件，本发明优选下列色谱条件：高效液相色谱仪为安捷伦1200高效液相色谱仪，联用二极管阵列检测器；柱温为20-60℃(优选30-60℃，进一步优选30℃)；检测波长为190nm-220nm(优选200nm-220nm，进一步优选210nm)；流速为0.4ml/min-2ml/min(优选1ml/min)；进样体积为5-20μl(优选20μl)。所述的高效液相色谱联用紫外分光法中，氨甲环酸待测样或氨甲环酸标准品可按照本领域常规的方法配置成氨甲环酸待测样溶液或氨甲环酸标准品溶液。本发明优选下列方法：采用蒸馏水或流动相溶解氨甲环酸待测样或氨甲环酸的标准品，配制成氨甲环酸待测样溶液或氨甲环酸标准品溶液。其中，所述的氨甲环酸待测样溶液或所述的氨甲环酸标准溶液中，氨甲环酸的质量浓度较佳地为10mg/l-10000mg/l，优选80-4000mg/l(其中，氨甲环酸的质量浓度是指单位体积(l)中氨甲环酸的质量(mg))。本发明还提供了一种化妆品中氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法，其包含下列步骤：采用高效液相色谱联用紫外分光法分析化妆品；其中，所述的高效液相色谱法的色谱条件同氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法所述。所述的化妆品可为本领域常规的化妆品，只要其中含有氨甲环酸即可。所述的高效液相分析法中，所述的化妆品可按照本领域常规的方法配置成样品溶液。本发明优选下列方法：采用蒸馏水或流动相溶解化妆品，配制成样品溶液。其中，所述的样品溶液中，氨甲环酸的质量浓度较佳地为100mg/l-400mg/l，优选200mg/l-400mg/l(氨甲环酸的质量浓度是指单位体积(l)中氨甲环酸的质量(mg))；其他色谱条件均同氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法中所述。在本发明一优选实施方式中，化妆品的样品溶液的制备方法优选包括下列步骤：将化妆品，与蒸馏水或极性有机溶剂(例如甲醇和/或乙腈)混合，超声，得一分散液，将所述的分散液与水混合，即可。其中，化妆品，与蒸馏水或极性有机溶剂的用量可不作具体限定，一般使最后制得的样品溶液中，氨甲环酸的质量浓度较佳地为100mg/l-400mg/l，优选200mg/l-400mg/l。所述的超声的操作为本领域常规的操作。所述的超声的时间优选1min。所述的化妆品中优选不包含烟酰胺。在本发明一优选实施方式中，所述的化妆品中包含烟酰胺，在这种情况下，所述的高效液相色谱联用紫外分光法中，柱温优选40℃-60℃，更优选45℃-60℃。在本发明一优选实施例方式中，当所述的化妆品中包含烟酰胺时，所述的流动相优选流动相a：流动相b＝60％:40％-30％:70％，v:v；其中，流动相a为极性有机溶剂、水和磷酸的混合溶剂，其中极性有机溶剂、水和磷酸的用量关系同氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法中所述；流动相b为纯水或乙腈。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明中，实验室用水均是纯水或蒸馏水，其中，纯水来自和泰纯水仪(18mω·cm)。蒸馏水采用常规方法或市售可得。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明的方法中，流动相组成简单，成本低，操作简便，同时采用该流动相进行检测时，色谱柱达到平衡所需的时间短，色谱峰无拖尾和时滞，检测准确性高，检测效率高。附图说明图1为采用药典方法检测氨甲环酸原料中氨甲环酸或其有关物质的hplc谱图。图2为采用药典方法检测氨甲环酸标准品中氨甲环酸或其有关物质的hplc谱图。图3为采用实施例1的方法检测氨甲环酸标准品中氨甲环酸(氨甲环酸质量浓度为1000mg/l)的hplc谱图。图4为采用实施例1的方法检测氨甲环酸标准品中氨甲环酸或其有关物质(氨甲环酸质量浓度为10000mg/l)的hplc谱图。图5为纯水空白样的hplc谱图。图6为实施例2中不同极性有机溶剂的体积百分比含量对氨甲环酸保留时间的影响示意图。图7为实施例2中不同磷酸体积百分比含量对氨甲环酸保留时间的影响示意图。图8为采用实施例4的方法测定氨甲环酸或其有关物质的hplc谱图。图9为采用实施例4的方法测定化妆品中的氨甲环酸或其有关物质的hplc谱图。图10为采用实施例5的方法测定样品药用乳液i中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图11为采用实施例5的方法测定样品药用乳液ii中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图12为采用实施例5的方法测定样品药用乳液iii中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图13为采用实施例5的方法测定样品化妆水i中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图14为采用实施例5的方法测定样品药用乳液iv中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图15为采用实施例5的方法测定样品化妆水ii中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图16为采用实施例5的方法测定样品玉乳中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图17为采用实施例5的方法测定样品滋养霜中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图18为采用实施例7的方法测定样品a中氨甲环酸的含量的hplc色谱图。图19为采用实施例7的方法，其中流动相a：流动相b＝60:40时样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图20为采用实施例7的方法，其中流动相a：流动相b＝50：50时样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图21为采用实施例7的方法，其中流动相a：流动相b＝30：70时样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图22为采用实施例7的方法，其中流动相a：流动相b＝20：80时样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图23为采用实施例7的方法，其中流动相a：流动相b＝10：90时样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图24为柱温为45℃时的流动相样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图25为柱温为60℃时的流动相样品a中烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。图26为对比实施例1中氨甲环酸标准品的hplc色谱图。图27为对比实施例2中采用极性有机溶剂和水的体积比为10％：90％时氨甲环酸的hplc色谱图。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实验操作，未限定操作温度的，均是指在室温条件下进行。下述实施例中流动相的百分比，百分含量等，均是指体积百分含量。其中极性有机溶剂和水的体积含量是指极性有机溶剂或水的体积，占极性有机溶剂和水总体积的百分比。磷酸的体积含量是指磷酸占极性有机溶剂和水总体积的百分比。下述实施例中磷酸均是指常规市售磷酸试剂，其质量分数为85％。用药典方法检测氨甲环酸或其有关物质的含量采用安捷伦1200联用二极管阵列检测器高效液相色谱仪，athenac18-wp色谱柱(4.6*250mm，5μm)，柱温30℃，进样体积20μl，检测波长220nm。流动相中，水相为ph2.5磷酸盐缓冲液(取11.0g无水磷酸二氢钠，溶于500ml水中，加5ml三乙胺与1.4g十二烷基硫酸钠，用稀磷酸调节ph值至2.5，以水稀释至600ml，有机相为400ml甲醇。流速1ml/min，采用恒度洗脱。分析样品为氨甲环酸(湖南洞庭药业股份有限公司，批号：x1501311m，hplc纯度100％)，配制成5000mg/l的样品溶液，对其进行检测，其hplc谱图见图1。同时，按照上述相同方法测定和氨甲环酸标准品(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236)，出峰顺序如下：氨甲环酸(13min)，环烯烃(16min)，氨甲苯酸(32min)，其hplc谱图见图2。结果显示，虽然对于氨甲环酸或其杂质具有良好的分离性能，但是流动相制备繁琐，峰形不对称，检测时间长。使用athenac18-wp柱，氨甲环酸的峰形拖尾，影响积分的重现性；检测时间至少35min。实施例1氨甲环酸或其有关物质含量的检测采用安捷伦1200高效液相色谱仪联用二极管阵列检测器；色谱柱：cr柱(1:4，5μm，4.6mm×150mm)，柱温30℃，进样体积20μl，检测波长210nm。流动相：乙腈+水+磷酸＝65％:35％:0.2％(v：v：v)。流速1ml/min；分析样品配置成水溶液。分析样品为氨甲环酸标准品，质量浓度分别为1000mg/l和10000mg/l(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236)，hplc色谱图见图3和图4。图3由于是低浓度，仅检测到氨甲环酸(11.111min)。图4由于高浓度，可检测出氨甲环酸或其有关物质，出峰顺序如下：氨甲环酸(10.150min)，环烯烃(7.445min)，氨甲苯酸(2.125min)。对于保留时间为2.8min左右的峰，为纯水中的杂质，具体见图5。图5为空白样的hplc谱图。由此可见，本方法对于氨甲环酸或其有关物质具有良好的分离性能。实施例2氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法中，高效液相色谱联用紫外分光法中hplc条件筛选2.1、氨甲环酸浓度采用实施例1相同的操作，分析样品为氨甲环酸标准品，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236；测试不同氨甲环酸浓度对保留时间和响应值的影响，具体见下列表1(由于氨甲环酸的质量浓度较低，故仅检测出氨甲环酸)。表1氨甲环酸浓度(mg/l)保留时间(min)峰面积响应值8012.0236.50.45620011.9793.30.46740011.92186.50.466100011.76467.00.467200011.52938.60.469400011.121890.50.473由此可见，氨甲环酸的检测浓度对保留时间和响应值影响不大，氨甲环酸在比较宽的浓度范围内(例如(80-4000mg/l)与峰面积成线性关系(r2＝0.9999)。2.2、极性有机溶剂的体积百分比含量采用实施例1相同的操作，分析样品为氨甲环酸原料，由化妆品原料供应商提供(湖南洞庭药业股份有限公司，批号：x1501311m，hplc纯度100％)；样品溶液中，氨甲环酸的质量浓度为10000mg/l；测试不同极性有机溶剂的体积百分比含量对氨甲环酸保留时间的影响，实验结果见图6。由图6可以看出，极性有机溶剂的体积含量为20％-80％时，保留时间在8-30分钟之间。2.3、磷酸体积百分比含量采用实施例1相同的操作，分析样品为氨甲环酸原料，由化妆品原料供应商提供(湖南洞庭药业股份有限公司，批号：x1501311m，hplc纯度100％)；样品溶液中，氨甲环酸的质量浓度为10000mg/l；测试不同磷酸体积百分比含量对氨甲环酸保留时间的影响，实验结果见图7。由图7可以看出，磷酸体积含量为0.1％-0.3％时，保留时间在9-17分钟之间。实施例3氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法的精密度采用实施例1相同的操作，分析样品为氨甲环酸标准品，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236；测试不同氨甲环酸或其有关物质含量的检测方法的精密度，具体见下列表2。表2该表格表示400mg/l浓度氨甲环酸标准溶液连续5次进样，以峰面积计算rsd值为0.56％，表明精密度良好。实施例4化妆品中氨甲环酸和基质分离度测试采用安捷伦1200高效液相色谱仪联用二极管阵列检测器；色谱柱：cr柱(1:4，5μm，4.6mm×150mm)，柱温30℃，进样体积20μl，检测波长210nm。流动相：乙腈+水+磷酸＝65％:35％:0.2％。流速1ml/min；分析样品配置成样品溶液，使氨甲环酸的质量浓度为400mg/l。1)分析样品为氨甲环酸，由化妆品原料供应商提供(湖南洞庭药业股份有限公司，批号：x1501311m，hplc纯度100％)，hplc色谱图见图8。2)分析样品为化妆水ii(常规市售可得化妆水，其中含有氨甲环酸)，hplc色谱图见图9。由图8和图9可以看出，化妆品中的氨甲环酸和化妆品中的基质分离度良好，即化妆品中的基质不影响氨甲环酸的定量检测。实施例5化妆品中氨甲环酸含量的检测采用安捷伦1200联用二极管阵列检测器高效液相色谱仪，capcellpakcr色谱柱(1:4，4.6*150mm，5μm)，柱温30℃，进样体积20μl，检测波长210nm。流动相乙腈：水：磷酸水溶液＝65％：35％：0.2％。流速1ml/min。分析样品配制成样品溶液：准确称量待测样0.5g于20ml容量瓶中，用纯水分散溶解(分散溶解时，一般采用超声的操作)，并定容(用纯水定容)，使氨甲环酸最终溶液浓度在200-400mg/l。hplc色谱图见附图10-17。分析样品为常规市售化妆品，其中含有氨甲环酸。其中，样品中的玉乳和滋养霜中，氨甲环酸的含量理论值为2％，测定结果见下列表3。表3样品检测结果由表3和图10-17可以看出，本发明中的检测方法能够有效检测化妆品种氨甲环酸的含量，应用范围广，对化妆品种类物特殊要求，只要其中含有氨甲环酸即可。实施例6氨甲环酸化妆品回收率试验在某一市售化妆品的基础配方中，分别加入氨甲环酸标准品配制成高中低三个质量浓度的溶液，hplc检测。实验结果见下列表4。表4氨甲环酸化妆品回收率试验结果表4中数据表示氨甲环酸在化妆品配方中基质加标回收的考察，高中低浓度下分别加标回收(n＝6)考察，回收率在100.2％-106.5％之间，rsd值在0.2％-1.7％之间，表明回收率和精密度良好。实施例7按照实施例5相同的操作，测定某一市售化妆品(样品a)中氨甲环酸的含量。其hplc色谱图见图18。由图18可知，保留时间为12.278min处的峰面积明显高于相同条件下其他样品(见图10-17)。基于此，可初步判断，该市售化妆品中存在一个色谱性质和氨甲环酸相似的物质。经分析该市售化妆品中的成分，判断与氨甲环酸性质相似的物质为烟酰胺。烟酰胺和氨甲环酸的分离(下述操作，如未作特别说明，其余色谱条件均参照实施例5)1)改变流动相在实验研究中，通过微调极性有机溶剂的含量，可以判断氨甲环酸峰中是否有重合杂质。以此，将流动相调整为流动相a和流动相b的混合溶剂；流动相a为极性有机溶剂、水和磷酸的混合溶剂，其中极性有机溶剂：水＝20％：80％～80％：20％，v:v；磷酸的含量为0.1％-0.3％；流动相b为纯水；流动相a：流动相b＝60％:40％-30％:70％，v:v。具体地，流动相a为乙腈：水：磷酸＝65％：35％：0.2％(v:v:v)；流动相b为纯水；流速：1ml/min；①流动相a：流动相b＝60:40(hplc谱图见图19)；②流动相a：流动相b＝50：50(hplc谱图见图20)；③流动相a：流动相b＝30：70(hplc谱图见图21)；④流动相a：流动相b＝20：80(hplc谱图见图22)；⑤流动相a：流动相b＝10：90(hplc谱图见图23)。由图19-23可知，提高纯水相的体积含量，烟酰胺和氨甲环酸的分离度提高，但保留时间也推迟；半峰宽较宽，影响定量。2)调节柱温按照实施例4相同的条件，柱温升至45℃-60℃，烟酰胺和氨甲环酸的分离度有改善。图24和25分别为柱温45℃和柱温60℃时，烟酰胺和氨甲环酸分离的hplc谱图。由图24和25可以看出，柱温对烟酰胺和氨甲环酸的影响相反，烟酰胺前移，氨甲环酸滞后，因此，二者分离度明显提高。对比实施例1采用实施例1相同的操作，区别仅在与将色谱柱替换为adme色谱柱(资生堂capcellpakadme5um,4.6*250mm)，分析样品为氨甲环酸标准品(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236)，其hplc谱图见图26。由图26可知，在流动相为乙腈+水+磷酸水溶液＝20％:80％:0.1％的体系下，氨甲环酸在adme色谱柱上峰形不对称，与杂质的分离度较差，根本无法运用在化妆品中定量检测。对比实施例2采用实施例1相同的操作，区别仅在于流动相中极性有机溶剂和水的体积比为10％：90％，结果噪音基线波动较大。分析样品为氨甲环酸标准品(购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(tci)，>98％(gc)(t)，产品编码：a0236)，其hplc谱图见图27。当前第1页12