一种红小豆抗寒性鉴定与评价的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种红小豆抗寒性鉴定与评价的方法。

背景技术：

低温是影响植物生长、发育和生物产量的重要环境因子。低温伤害是农业生产中经常发生的自然灾害，严重影响农作物的品质和产量，甚至造成农作物大面积死亡。迄今为止，尚没有解决低温伤害的根本办法。

我国是红小豆栽培面积最大、出口量最多的国家。红小豆是我国的主要食用豆类作物，但与其它豆类相比是最不抗寒的低温敏感作物，导致寒冷地区的红小豆产量不稳。红小豆品种的抗寒性是决定它种植推广的主要因素，确定不同品种的抗寒力，制定一套准确而快速的红小豆抗寒性鉴定与评价方法对于品种资源的利用，种植地点的合理规划布局和抗寒育种均具有重要的意义。

红小豆的低温冷害发生在出苗期、生长初期和开花期。出苗期处于长期低温和日照不足，引起叶片向内翻转的碗形症状并枯死；4～5叶期时遭遇的低温冷害引起生育障碍(生长点停止现象)；开花期遭遇低温冷害引起花粉不育导致结荚障碍，这些症状各有不同。红小豆苗期的低温障碍由于低温寡照、初生叶叶绿素合成受到阻碍而引起的叶片生育延迟，致使叶片光合作用不正常而引起营养枯竭，最终不能恢复而枯死。研究表明，植物在生长过程中，温度骤然变化会引起叶绿素退色、叶片坏死等现象。叶绿素以及前质体是导致活性氧发生的光增感剂，而活性氧可引起细胞内膜、蛋白质损伤、光合作用阻碍等生理障碍。一旦叶绿素破坏就会引起叶绿素退色、叶片坏死等现象。为了解毒O₂^-和H₂O₂，植物细胞内同时存在着由超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血栓过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)等构成的抗氧化系统。这些抗氧化酶与胁迫条件生成的活性氧的量、抗氧化酶活性等密切相关。

技术实现要素：

本发明的目的是提供鉴定或辅助鉴定红小豆抗寒性的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定红小豆抗寒性的方法，包括如下步骤：将待测红小豆播种，待出苗后移至光强为700-1000μmol/m²/s、温度为10-13℃的环境下生长28-30天，然后将植株转移至光强为1000-1500μmol/m²/s、温度为20-25℃的环境下进行绿化；以绿化过程中测得的如下任一指标来确定待测红小豆的抗寒性强弱：植株中H₂O₂含量变化、植株中叶绿素含量变化、植株中超氧化物歧化酶活性变化、植株中抗坏血酸过氧化物酶活性变化、植株中过氧化氢酶活性变化。

具体而言，本发明所提供的鉴定或辅助鉴定红小豆抗寒性的方法，可为如下五种方法中的任一种：

方法一，具体可包括如下步骤：

(A1)将待测红小豆播种，待出苗后移至光强为700-1000μmol/m²/s、温度为10-13℃的环境下生长28-30天(如28天)，然后将植株转移至光强为1000-1500μmol/m²/s、温度为20-25℃的环境下进行绿化；

(A2)测定绿化时间为0h时植株中H₂O₂含量，和/或随着绿化时间的推移植株中H₂O₂含量的变化情况，按照如下确定待测红小豆的抗寒性强弱：绿化时间为0h时植株中H₂O₂含量越低的待测红小豆品种的抗寒性越强；和/或植株中H₂O₂含量随着绿化时间推移无显著变化且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于植株中H₂O₂含量随着绿化时间推移下降至0点的待测红小豆品种。

在步骤(A2)中，所述“植株中H₂O₂含量随着绿化时间推移无显著变化”是指在绿化时间内设置的不同测定时间点测得的植株中H₂O₂含量彼此之间无显著变化。

方法二，具体可包括如下步骤：

(B1)将待测红小豆播种，待出苗后移至光强为700-1000μmol/m²/s、温度为10-13℃的环境下生长28-30天(如28天)，然后将植株转移至光强为1000-1500μmol/m²/s、温度为20-25℃的环境下进行绿化；

(B2)测定随着绿化时间的推移植株中叶绿素含量的变化情况，按照如下确定待测红小豆的抗寒性强弱：随着绿化时间的推移植株中叶绿素含量上升的待测红小豆品种的抗寒性强于或候选强于随着绿化时间的推移植株中叶绿素含量下降的待测红小豆品种的抗寒性。

方法三，具体可包括如下步骤：

(C1)将待测红小豆播种，待出苗后移至光强为700-1000μmol/m²/s、温度为10-13℃的环境下生长28-30天(如28天)，然后将植株转移至光强为1000-1500μmol/m²/s、温度为20-25℃的环境下进行绿化；

(C2)测定随着绿化时间的推移植株中超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化情况，按照如下确定待测红小豆的抗寒性强弱：随着绿化时间的推移植株中超氧化物歧化酶(SOD)活性呈现波动状态且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于或候选强于随着绿化时间的推移植株中超氧化物歧化酶(SOD)活性下降至0点的待测红小豆品种的抗寒性。

方法四，具体可包括如下步骤：

(D1)将待测红小豆播种，待出苗后移至光强为700-1000μmol/m²/s、温度为10-13℃的环境下生长28-30天(如28天)，然后将植株转移至光强为1000-1500μmol/m²/s、温度为20-25℃的环境下进行绿化；

(D2)测定随着绿化时间的推移植株中抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的变化情况，按照如下确定待测红小豆的抗寒性强弱：随着绿化时间的推移植株中抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性呈现波动状态且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于或候选强于随着绿化时间的推移植株中抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性下降至0点的待测红小豆品种的抗寒性。

方法五，具体可包括如下步骤：

(E1)将待测红小豆播种，待出苗后移至光强为700-1000μmol/m²/s、温度为10-13℃的环境下生长28-30天(如28天)，然后将植株转移至光强为1000-1500μmol/m²/s、温度为20-25℃的环境下进行绿化；

(E2)测定随着绿化时间的推移植株中过氧化氢酶(CAT)活性的变化情况，按照如下确定待测红小豆的抗寒性强弱：随着绿化时间的推移植株中过氧化氢酶(CAT)活性呈现波动状态且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于或候选强于随着绿化时间的推移植株中过氧化氢酶(CAT)活性先上升后下降至0点的待测红小豆品种的抗寒性。

在上述五种方法中，步骤(A2)中测定随着绿化时间的推移植株中H₂O₂含量的变化情况时、步骤(B2)中测定随着绿化时间的推移植株中叶绿素含量的变化情况时、步骤(C2)中测定随着绿化时间的推移植株中SOD酶活性的变化情况时、步骤(D2)中测定随着绿化时间的推移植株中APX酶活性的变化情况时，以及步骤(E2)中测定随着绿化时间的推移植株中CAT酶活性的变化情况时，测定时间点均可设置在绿化时间为0-28h的范围内，具体如测定时间点均设置为绿化时间0h、3h、8h和28h。

在上述五种方法中，步骤(A2)中，所述植株中H₂O₂含量为植株叶片中H₂O₂含量；步骤(B2)中，所述植株中叶绿素含量为植株叶片中叶绿素含量；步骤(C2)中，所述植株中SOD酶活性为植株叶片中SOD酶活性；步骤(D2)中，所述植株中APX酶活性为植株叶片中APX酶活性；步骤(E2)中，所述植株中CAT酶活性为植株叶片中CAT酶活性。

在上述五种方法中，步骤(A1)、(B1)、(C1)、(D1)和(E1)中，将所述待测红小豆播种后，均是置于25℃恒温和100％黑暗无光条件下出苗的。

在上述五种方法中，所述待测红小豆可为任意品种的红小豆。

在本发明的一个实施例中，所述待测红小豆为红小豆抗寒品种赤根大纳言和不抗寒品种斑小粒系-1。

本发明以红小豆抗寒和不抗寒品种为试验材料，发现低温遮光处理28天是鉴定红小豆抗寒性重要时间点，经过低温遮光处理28天后进行绿化处理，检测植株中H₂O₂含量、叶绿素、SOD酶活性、APX酶活性或者CAT酶活性即可鉴定不同红小豆品种的抗寒性。本发明提供了一套准确而快速的红小豆抗寒性鉴定与评价方法对于品种资源的利用，种植地点的合理规划布局和抗寒育种均具有重要的意义。

附图说明

图1为红小豆品种短期低温处理18天后绿化情况。其中，A-D为抗寒品种赤根大纳言。A为绿化0h；B为绿化3h；C为绿化8h；D为绿化28h。E-H为不抗寒品种斑小粒系-1。E为绿化0h；F为绿化3h；G为绿化8h；H为绿化28h。

图2为红小豆品种短期低温处理28天后绿化情况。其中，A-D为抗寒品种赤根大纳言。A为绿化0h；B为绿化3h；C为绿化8h；D为绿化28h。E-H为不抗寒品种斑小粒系-1。E为绿化0h；F为绿化3h；G为绿化8h；H为绿化28h。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

红小豆抗寒品种赤根大纳言和不抗寒品种斑小粒系-1，记载于如下文献中：”千叶一美等.日本小豆品种的分化和育种.国外农学-杂粮作物,1984,(02),43-46.”公众可从黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、通过H₂O₂含量变化鉴定红小豆抗寒性

一、红小豆的处理方法

选用日本北海道最具代表性的出苗期抗寒品种—赤根大纳言和出苗期不抗寒品种—斑小粒系-1。两个品种分别种在营养钵中，营养钵中装入蛭石，每个营养钵种30-40粒红小豆种子间隔2cm播种一粒，三次重复。播种后置于25℃恒温和100％黑暗条件下出苗，出苗后移到光强为700-1000μmol/m²/s，每个品种的红小豆分两大组，在低温条件下(昼夜10℃～13℃)分别生长18d和28d，然后每组分成三小组移到昼夜20℃～25℃的自然光室(晴天，光强为1000-1500μmol/m²/s)分别进行3h、8h和28h的绿化处理。整个生育期间由人工气候室的自动灌水装置定期浇水。采集幼嫩的初生叶片，称量后液氮速冻-80℃保存。

二、H₂O₂含量测定

植株体内存在的O₂^-和H₂O₂会产生毒性很强的OH^-，H₂O₂诱导细胞膜过氧化、DNA链断裂和蛋白质的损伤，给植物细胞造成伤害。取抗寒品种赤根大纳言和不抗寒品种斑小粒系-1幼嫩的叶片，分别测量短期低温处理18d和长期低温处理28d后绿化处理0h、3h、8h和28h苗期叶片的H₂O₂含量。H₂O₂含量的测定是根据Erich Warm(Erich Warm·George G,Laties Quantification of hydrogen peroxide in plant extracts by the chemiluminescence reaction with luminal.Hytochemistry.1982，21(4):827－831.)的方法进行测定的。每个处理设置至少3次重复。

结果如表1所示。

表1不同低温条件经绿化处理后红小豆苗期叶片过氧化氢含量

注：数据使用平均值±标准偏差表示；大、小写字母分别表示两个品种、不同处理在5％和1％水平的显著性差异；过氧化氢单位：m mol/kg/fr·wt。

抗寒品种无论是短期低温处理(18d)还是长期低温处理(28d)，无论是绿化前(0h)还是绿化后(3h、8h和28h)对H₂O₂含量的影响都不大，如图1中A-D和图2中A-D无显著差异，而且长期低温处理后H₂O₂含量(0.27m mol/kg/fr·wt)反而更低，是短期低温处理(0.64m mol/kg/fr·wt)的42％。

不抗寒品种短期低温处理(18d)绿化后3h其H₂O₂含量与绿化前(0h)相比显著提高，随着绿化时间的延长，H₂O₂含量逐渐下降趋于绿化前水平；长期低温处理(28d)绿化前(0h)其H₂O₂含量即达到最大值(17.78m mol/kg/fr·wt)，是短期低温处理绿化前(1.35m mol/kg/fr·wt)的13倍，绿化3h(7.11m mol/kg/fr·wt)其H₂O₂含量与绿化前(17.78m mol/kg/fr·wt)相比显著下降，随着绿化时间的延长，H₂O₂含量仍然显著下降，至绿化8h时，其H₂O₂含量降为0.00m mol/kg/fr·wt，此时叶片部分黄化萎蔫，如图2中G所示枯死率达到35％；至绿化28h时，如图2中H所示枯死率达到40％。

上述结果表明：长期低温胁迫(28d)导致不抗寒品种绿化前H₂O₂含量显著升高(与抗寒品种相比)，随着绿化时间的延长H₂O₂含量逐渐降低至0，大部分叶片枯黄萎蔫；而抗寒品种H₂O₂含量绿化前后始终保持在正常水平，因此长期低温处理红小豆幼苗(28d)后，通过比较不同品种绿化处理时(0h、3h、8h和28h)H₂O₂含量变化趋势可鉴定红小豆品种抗寒性。

即，鉴定红小豆抗寒性，可通过测定绿化时间为0h时植株中H₂O₂含量和/或随着绿化时间的推移植株中H₂O₂含量的变化情况，按照如下确定待测红小豆的抗寒性强弱：绿化时间为0h时植株中H₂O₂含量越低的待测红小豆品种的抗寒性越强；植株中H₂O₂含量随着绿化时间推移无显著变化且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于植株中H₂O₂含量随着绿化时间推移下降至0点的待测红小豆品种。

实施例2、通过叶绿素含量变化鉴定红小豆抗寒性

一、红小豆的处理方法

同实施例1步骤一。

二、叶绿素含量测定

取抗寒品种赤根大纳言和不抗寒品种斑小粒系-1幼嫩的叶片，分别测量短期低温处理18d和长期低温处理28d后绿化处理0h、3h、8h和28h苗期叶片的叶绿素含量。叶绿素含量的测定按加藤荣(光合作用研究方法.日本共立出版社,东京,1981,40-41)的方法进行。每个处理设置至少3次重复。

测定结果如表2所示。

表2不同低温条件经绿化处理后红小豆苗期叶片叶绿素含量

注：数据使用平均值±标准偏差表示；大、小写字母分别表示两个品种、不同处理在5％和1％水平的显著性差异；叶绿素单位：μg/g。

抗寒品种短期低温处理18d后绿化8h与绿化前(绿化0h)相比，叶绿素含量显著提高，由32.1μg/g上升到46.8μg/g，随着绿化时间的延长，叶绿素含量逐渐升高，绿化28h叶绿素含量达到最高，与绿化前相比叶绿素含量极显著升高；不抗寒品种短期低温处理18d后尽管叶绿素含量也随绿化的时间延长而增加，但绿化28h与未绿化相比叶绿素含量无显著差异。

抗寒品种长期低温处理28d后绿化3h与绿化前(绿化0h)相比，叶绿素含量极显著提高，由19.9μg/g上升到32.6μg/g，随着绿化时间的延长，叶绿素含量始终维持在一定水平下，绿化8h叶绿素含量达到最高值，与绿化3h相比叶绿素含量无明显差异；不抗寒品种长期低温处理28d后，绿化8h后与绿化前(绿化0h)相比，叶绿素含量显著下降为0.0μg/g，由于绿化时间过长不抗寒品种叶片无法恢复正常状态，大部分叶片枯黄萎蔫。

抗寒品种经低温遮光18d和28d处理再绿化后，初生叶均迅速绿化；而不抗寒品种处理18d后，绿化速度延迟，处理28d绿化处理前的枯死率为20％，如图2中E所示；随绿化处理时间延长植株枯死数逐渐增多，绿化处理3h的枯死率为30％，如图2中F所示；绿化处理8h的枯死率为35％，如图2中G所示；绿化处理28h的枯死率为40％，如图2中H所示。

上述结果表明：长期低温胁迫(28d)导致不抗寒品种叶绿素含量显著下降，绿化处理3h后抗寒品种叶绿素含量显著提高，而不抗寒品种8h后叶绿素含量降为0。因此长期低温处理红小豆幼苗(28d)后，随着绿化时间的推移叶绿素含量上升的品种要比随着绿化时间的推移叶绿素含量下降的品种具有更强的抗寒性。

实施例3、抗氧化酶的活性测定

一、红小豆的处理方法

同实施例1步骤一。

二、抗氧化酶的活性测定

在逆境条件下，植物体内产生的自由基可引起质膜的脱脂化和过氧化，破坏生物膜的结构和功能，而植物体内的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和过氧化氢酶(CAT)等，能在一定程度上消除活性氧和过氧化物的不利影响，维持细胞膜的稳定性。

SOD是需氧生物普遍存在的一种金属酶，它与过氧化物酶、过氧化氢酶等协同作用防御活性氧或其它过氧化物自由基对细胞膜的伤害，SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢，过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化为氧分子和水。因此SOD活力与抗逆性有密切联系，是植物逆境生理学的重要研究对象。

逆境条件下植物细胞产生大量氧自由基，引起一系列不良生理变化，为了响应和防御氧化胁迫，植物自身形成一套清除机制。抗坏血酸过氧化酶(APX)是植物体内清除过氧化物的重要关键酶，主要功能是通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环(AsA-GSH)分解H₂O₂，由于APX对H₂O₂具有更高的亲和力，所以叶绿体中的H₂O₂主要由APX清除。此外，APX还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢。因此，APX被认为与植物的抗寒性密切相关。

过氧化氢酶(CAT)是一类广泛存在于动物、植物和微生物体内的酶，是生物防御系统的关键酶之一，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢的分解防止过氧化，在植物中CAT主要参与抗逆性和氧化衰老等生理过程。

取抗寒品种赤根大纳言和不抗寒品种斑小粒系-1幼嫩的叶片，分别测量短期低温处理18d和长期低温处理28d后绿化处理0h、3h、8h和28h苗期叶片SOD酶、APX酶和CAT酶活性。

1、酶液制备

称取冷冻的叶片(0.3g)放研钵中加入液体氮研磨。每1g粉碎的叶片加入3.5ml的提取液[0.4mM EDTA，1mM抗坏血酸，2％(W/V)PVP含有25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)]搅拌均匀，4℃，14000rpm离心25min后得到的上清液即为酶液。

2、酶液蛋白质的测定

酶液蛋白质的测定按沈利星(杂草科学实验方法，植物抗氧化活性测定法。日本杂草学会发行，东京。2001 296-298)的方法。

3、抗氧化酶(SOD、APX、CAT活性)的测定

SOD活性、APX活性、CAT活性的测定按沈利星(杂草科学实验方法,植物抗氧化活性测定法.日本杂草学会发行,东京.2001 296-298)的方法。每个处理设置至少3次重复。

4、结果

(1)SOD酶活性测定结果

SOD酶活性测定结果如表3所示。

表3不同低温条件经绿化处理后红小豆苗期超氧化物歧化酶(SOD)活性

注：数据使用平均值±标准偏差表示；大、小写字母分别表示两个品种、不同处理在5％和1％水平的显著性差异；SOD单位：Unit/mg protein。

抗寒品种无论是短期低温处理(18d)还是长期低温处理(28d)，绿化3h后SOD酶活性与绿化前(0h)相比显著提高，绿化8h达到最大值，随着时间的延长，SOD活性逐渐降低，长期低温处理后绿化28h时SOD活性(0.020Unit/mg protein)接近绿化前(0.013Unit/mg protein)状态。

不抗寒品种短期低温处理(18d)，绿化后SOD酶活性一直保持在绿化前水平，到绿化8h时SOD活性明显下降，然后又逐步上升绿化28h时SOD活性(0.017Unit/mg protein)接近绿化前水平(0.014Unit/mg protein)；长期低温处理(28d)绿化前(0h)SOD活性达到最高值(0.063Unit/mg protein)，随着绿化开始SOD酶活性逐渐下降，绿化3h时SOD活性显著下降至0.016Unit/mg protein，绿化8h时SOD活性降至0.000Unit/mg protein，随着绿化时间的延长SOD活性一直保持在0.000Unit/mg protein，不再恢复，如图2中E-H所示整个绿化过程中随着绿化时间延长，叶片逐渐枯黄萎蔫，SOD酶活性一直处于下降状态。

上述结果表明：不同红小豆品种在长期低温处理条件下，抗寒品种SOD酶活性呈波动状态且不为0；而不抗寒品种SOD酶活性下降至0点。因此，长期低温处理红小豆幼苗(28d)，随着绿化时间的推移植株中SOD酶活性呈现波动状态且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于随着绿化时间的推移植株中SOD酶活性下降至0点的待测红小豆品种的抗寒性。

(2)APX酶活性测定结果

APX酶活性测定结果如表4所示。

表4不同低温条件经绿化处理后红小豆苗期抗坏血酸过氧化酶(APX)活性

注：数据使用平均值±标准偏差表示；大、小写字母分别表示两个品种、不同处理在5％和1％水平的显著性差异；APX单位：μmol/min/mg protein。

抗寒品种短期低温处理(18d)绿化后(3h、8h)APX酶活性逐步升高，直至绿化8h酶活性达到最高值0.21μmol/min/mg protein但是与绿化前(0h)无显著差异，随着绿化时间的延长，APX酶活性逐渐下降，绿化28h时显著下降到最低值0.11μmol/min/mg protein；长期低温处理(28d)与短期低温处理情况类似，绿化后(3h、8h)APX酶活性逐步升高，直至绿化8h酶活性显著升高至0.20μmol/min/mg protein，随着绿化时间的延长，APX酶活性逐渐下降，绿化28h时下降到0.14μmol/min/mg protein。

不抗寒品种短期低温处理(18d)，绿化后(3h、8h、28h)与绿化前(0h)相比APX酶活性随着绿化时间的延长活性持续下降，绿化28h时APX酶活性显著下降至0.08μmol/min/mg protein；长期低温处理(28d)绿化后(3h)与绿化前(0h)相比APX酶活性无显著差异，维持在一定的水平，随着绿化时间的延长，绿化8h时APX酶活性显著下降至0.00μmol/min/mg protein，一直没有恢复直到绿化28h。

上述结果表明：不同红小豆品种在长期低温处理条件下，抗寒品种APX酶活性呈波动状态且不为0；而不抗寒品种APX酶活性下降至0点。因此，长期低温处理红小豆幼苗(28d)后，随着绿化时间的推移植株中APX酶活性呈现波动状态且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于随着绿化时间的推移植株中APX酶活性下降至0点的待测红小豆品种的抗寒性。

(3)CAT酶活性测定结果

CAT酶活性测定结果如表5所示。

表5不同低温条件经绿化处理后红小豆苗期过氧化氢酶(CAT)活性

注：数据使用平均值±标准偏差表示；大、小写字母分别表示两个品种、不同处理在5％和1％水平的显著性差异；CAT单位：μmol/min/mg protein。

抗寒品种短期低温处理(18d)绿化后(3h、8h)CAT酶活性逐步升高，直至绿化8h酶活性达到最高值1.87μmol/min/mg protein，与绿化前(0h)相比显著上升，随着绿化时间的延长，CAT酶活性逐渐下降，绿化28h时显著下降至0.93μmol/min/mg protein；长期低温处理(28d)与短期低温处理情况类似，绿化后(3h、8h)CAT酶活性逐步升高，直至绿化8h酶活性显著升高至1.19μmol/min/mg protein，随着绿化时间的延长，CAT酶活性逐渐下降，绿化28h时下降到0.81μmol/min/mg protein。

不抗寒品种短期低温处理(18d)，绿化后3h与绿化前(0h)相比CAT酶活性显著上升达到最高值1.95μmol/min/mg protein，随着绿化时间的延长，CAT酶活性逐渐下降，绿化28h时下降至1.03μmol/min/mg protein；长期低温处理(28d)绿化后(3h)与绿化前(0h)相比CAT酶活性显著上升达到最高值1.59μmol/min/mg protein，随着绿化时间的延长活性下降，绿化8h时CAT酶活性显著下降至0.00μmol/min/mg protein，由于绿化时间过长不抗寒品种叶片无法恢复正常状态，大部分叶片枯黄萎蔫。

上述结果表明：不同红小豆品种在长期低温处理(28d)条件下抗寒品种CAT酶活性呈波动状态且不为0，而不抗寒品种CAT酶活性先上升后下降至0点。因此，长期低温处理红小豆幼苗(28d)后，随着绿化时间的推移植株中CAT酶活性呈现波动状态且不为0的待测红小豆品种的抗寒性强于随着绿化时间的推移植株中CAT酶活性先上升后下降至0点的待测红小豆品种的抗寒性。

上述所有实施例的试验结果表明：长期低温处理(28d)后绿化(0h、3h、8h和28h)，抗寒品种(图2中A-D)的叶片能够迅速从黄化状态恢复，至28h时叶片呈绿色、舒展的正常生长状态；不抗寒品种(图2中E-H)的叶片不能够从黄化状态中恢复，部分枯萎死亡。综上所述通过比较不同品种H₂O₂含量、叶绿素含量、SOD酶活性、APX酶活性和CAT酶活性是鉴定红小豆抗寒性的重要指标和方法。