一种莲藕多糖二元指纹图谱及其构建方法与流程

本发明属于农产品及其功能成分的质量分析领域，具体涉及一种莲藕多糖二元指纹图谱及其构建方法。

背景技术：

莲藕是我国栽培最广、销售量和销售范围最大的水生蔬菜。据中药大辞典所述，莲藕生用可清热、凉血、散疲、治热病烦渴，熟用可健脾、开胃、益血、生肌、止泻。上述功效可能部分与多糖有关，莲藕多糖经研究证实具有抗疲劳(周桃英，2011)、降血糖(罗登宏，2011)、抗氧化(罗登宏，2011；严浪，2008；jiang,2011)和免疫调节(jiang,2011)等活性。新鲜莲藕中多糖提取得率可达5％(孙杰，2016；王瑜，2007)，且藕皮、藕节和藕渣等传统加工副产物中也含有丰富的多糖(李正一，2016；严浪，2007)。目前，莲藕加工科技水平薄弱，产品“同质化”现象严重，经济附加值不高，且加工过程中产生大量的藕皮、藕节和藕渣等副产物均未得到有效开发利用。相应地，莲藕多糖的高值开发利用有助于完善产品结构和拓展产业链，在功能食品和生物医药领域应用前景良好，而多糖的质量控制极为关键。

多糖的指纹图谱技术在多糖及其原料质量控制方面有广泛的应用。枸杞多糖(高向东，2014)、猴头菇多糖(周春晖，2016)、铁皮石斛多糖(罗建平，2009)、决明子多糖(高新开，2014)、芦荟多糖(董银卯，2015)的指纹图谱技术不仅可以突破多糖品质与真伪鉴别，还可以实现原料品种及产地的区别。然而，莲藕多糖的指纹图谱技术尚未见报道。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的莲藕多糖质量控制和真伪鉴别技术缺乏等问题，本发明提供一种莲藕多糖二元指纹图谱及其构建方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种莲藕多糖二元指纹图谱的构建方法，其包括如下步骤：

1)取莲藕洗净后切分为藕段和藕节，藕段刨取皮部，藕节切除须根，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位，分别粉碎至5～20目待用；

2)将步骤1)中粉碎的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位分别进行多糖提取处理，分别得到相应的三份莲藕多糖样品；

3)以步骤2)得到的三份莲藕多糖样品为测试对象，分别进行ftir检测和hplc检测，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位相应的多糖红外图谱和多糖高效液相色谱图；

4)多次重复步骤1)、2)和3)分别得到多个不同品种莲藕的藕皮、食用部位和藕节三个供试部位的多糖红外图谱和多糖高效液相色谱图，以所有多糖红外图谱的平均向量构建得莲藕多糖红外标准指纹图谱，以所有多糖高效液相色谱图的平均向量构建得莲藕多糖高效液相色谱标准指纹图谱，则构建出所述的莲藕多糖二元指纹图谱。

上述技术方案可以有如下更进一步的具体选择。

具体的，步骤2)中的多糖提取处理的具体内容为：将供试部位按料液比1g:15ml加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液ph至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至ph4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至还原糖含量不再增加，升温至95℃并保持10min灭酶；酶解提取液在70℃下真空浓缩至原体积1/4，采用sevage法脱蛋白后加入无水乙醇至80％乙醇体积浓度，于4℃静置过夜；采用4500r/min离心10min分离沉淀多糖；多糖经80％乙醇洗涤后挥发乙醇，以少量水复溶后冷冻干燥得到莲藕多糖样品。

具体的，步骤3)中ftir检测的具体内容为：将步骤2)得到的莲藕多糖样品与kbr粉末按质量比1:100在研钵中混匀研磨，置于模具内压成透明薄片，在4000～400cm^-1波数范围内进行扫描获得多糖红外图谱。

具体的，步骤3)中hplc检测的具体内容为：将步骤2)得到的莲藕多糖样品加蒸馏水配置成5mg/ml的多糖溶液，取100μl多糖溶液于安瓿瓶中，加入100μl的三氟乙酸水溶液，充氮气封管，并置于110℃烘箱中水解8h；水解结束后，将冷却的水解液转移至离心管，分两次用150μl甲醇洗涤安瓿瓶，且一并移入离心管；水解液用n2吹干，重复加甲醇吹干2次，去除三氟乙酸，加入100-150μl超纯水溶解后得到水解液样品；取50μl水解液样品与50μl的naoh溶液混匀，加入100μl的pmp甲醇溶液后于70℃烘箱中避光反应100min；反应结束后室温避光冷却10min，加入100μl的hcl溶液中和，补水至2ml；加入等体积氯仿，漩涡混匀，静置分层后弃去氯仿相，重复操作3次；取水相，经0.45μm微孔滤膜过滤后供hplc定性、定量分析，得多糖高效液相色谱图。

具体的，所述三氟乙酸水溶液的浓度为4mol/l，所述naoh溶液的浓度为0.6mol/l，所述pmp甲醇溶液的浓度为0.5mol/l,所述hcl溶液的浓度为0.3mol/l。

具体的，所述莲藕多糖红外标准指纹图谱包括5个共有特征峰，依次为：1076cm^-1、1420cm^-1、1630cm^-1、2930cm^-1、3410cm^-1。

具体的，所述莲藕多糖高效液相色谱标准指纹图谱包括7个共有特征峰，其保留时间依次为：12.94min、18.39min、20.35min、23.03min、27.90min、31.49min、33.67min。

具体的，步骤4)中多个不同品种莲藕的数量为13个以上。

此外，本发明还请求保护通过以上方法得到的莲藕多糖二元指纹图谱。

本发明的有益效果为：

1)以不同品种莲藕的藕皮、藕节及食用部位为供试部位分别提取了莲藕多糖并获得相应的莲藕多糖红外指纹图谱，并以多个莲藕多糖红外指纹图谱的平均向量构建了莲藕多糖红外标准指纹图谱，以此为参照图谱，采用相关系数(r)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位多糖ftir指纹图谱相似性，发现不同品种莲藕及不同部位多糖的红外指纹图谱极为相似，可作为莲藕来源多糖的鉴别和质量控制的依据，也可用于莲藕类食品的真实性鉴别；

2)同样的，本发明还以多个莲藕多糖高效液相色谱指纹图谱的平均向量构建了莲藕多糖高效液相色谱标准指纹图谱，以其为参照，经相似度分析发现不同品种不同部位的莲藕多糖的高效液相色谱指纹特征较为相似，故莲藕多糖高效液相色谱标准指纹图谱也可作为莲藕来源多糖的鉴别和质量控制的依据，以及应用于莲藕类食品的真实性鉴别；

3)本发明以从多个品种莲藕的藕皮、藕节和食用部位提取的多糖为研究对象，整合莲藕资源中多糖的多维数据体系，增加了指纹图谱信息的全面性和可靠性；

4)构建了莲藕多糖红外标准指纹图谱和高效液相色谱标准指纹图谱，以此二元指纹图谱进行莲藕来源多糖的鉴别和质量控制，相比于单一指纹图谱，准确度更高。

附图说明

图1为莲藕多糖的ftir指纹图谱，其中a为莲藕食用部位多糖ftir指纹图谱、b为藕皮多糖ftir指纹图谱、c为藕节多糖ftir指纹图谱、d为莲藕多糖ftir标准指纹图谱，图中标号1至13代表13个品种的相应部位提取多糖进行测试得到的对应图谱，在图中曲线从上至下依次对应1至13个品种的图谱；

图2为单糖混合标准品的hplc色谱图；

图3为莲藕多糖中单糖组成分析hplc色谱图，其中a和b分别为为莲藕食用部位多糖hplc指纹图谱及其标准图谱、c和d分别为藕皮多糖hplc指纹图谱及其标准图谱、e和f分别为藕节多糖hplc指纹图谱及其标准图谱；g为39个莲藕多糖样品的hplc标准指纹图谱。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明提供一种莲藕多糖二元指纹图谱构建方法，该方法包括如下具体内容：

1.莲藕供试样品的制备

鄂莲5号、鄂莲6号、鄂莲7号、鄂莲8号、应城白莲、走马羊、贵溪浮藕、巴河藕、白泡子、博白藕、武植2号、8143、常州漂江，共计13个品种莲藕由国家种质武汉水生蔬菜资源圃提供，取样时间为2015年10月。

取莲藕洗净后切分为藕段和藕节；藕段刨取皮部，藕节切除须根，得到藕皮、食用部位和藕节三个供试部位；供试部位分别粉碎至5～20目待用。2.莲藕多糖的制备

称取步骤1)中莲藕供试样品100g，按料液比(g/ml)1:15加入蒸馏水，在12000r/min的转速下均质处理5min后转入90℃水浴恒温浸提2h；浸提结束后，采用4500r/min离心10min，过滤分离多糖提取液；调节多糖提取液ph至6.5，加入α-淀粉酶在70℃水浴中酶解至碘液反应呈阴性，冷却至室温后调节至ph4.5，加入糖化酶在55℃水浴中酶解至还原糖含量不再增加，升温至95℃并保持10min灭酶；酶解提取液在70℃下真空浓缩至原体积1/4，采用sevage法脱蛋白后加入无水乙醇至80％乙醇体积浓度，于4℃静置过夜；采用4500r/min离心10min分离沉淀多糖；多糖经80％乙醇洗涤后挥发乙醇，以少量水复溶后冷冻干燥得到莲藕多糖。

3.莲藕多糖二元标准指纹图谱的构建及分析

3-1.莲藕多糖的ftir指纹图谱分析

取多糖样品与kbr粉末按质量比1:100在研钵中混匀研磨，置于模具内压成透明薄片，在4000～400cm^-1波数范围内进行扫描获得ftir图谱。

13个品种莲藕的食用部位、皮部、节部制备所得多糖的ftir指纹图谱及以39个多糖样品ftir指纹图谱的平均向量构建标准ftir指纹图谱，如图1所示。以构建的标准ftir指纹图谱为参照图谱，采用相关系数(r)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位多糖ftir指纹图谱相似性，相关数据如表1所示。39个多糖样品的相关系数值为0.9856±0.2049(n＝39)，而夹角余弦值为0.9991±0.0014(n＝39)，由此说明不同品种莲藕及不同部位多糖的ftir指纹图谱极为相似，可作为藕源性多糖的鉴别依据。

表1.莲藕多糖ftir指纹图谱的相似度分析

3-2.莲藕多糖的hplc指纹图谱分析

(1)单糖组成分析的pcd-hplc法的构建

分别配制浓度均为5mmol/l的甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖标准品溶液；配制浓度分别为1、2、3、4、5mmol/l的单糖混合标准液。分别吸取50μl的单糖标准液及不同浓度梯度的混合标准溶液，各加50μl的naoh溶液(0.6mol/l)置于5ml具塞试管中，漩涡混匀；加100μl的pmp(0.5mol/l)甲醇溶液，漩涡混匀，在70℃烘箱中避光反应100min，取出避光冷却10min至室温，加入100μl的hcl溶液(0.3mol/l)中和，补水至2ml；加入等体积氯仿漩涡混匀，静置分层后弃去氯仿相，如此萃取3次；将水相用0.45μm微孔滤膜过滤后供hplc进行分析，作为定性定量的依据。采用hplc法检测单糖组成及含量，色谱分析条件为：uv检测器波长为250nm，色谱柱为agilentextend-c18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，柱温为30℃，流动相a(0.1mol/l的磷酸钠盐缓冲液，ph6.7)与流动相b(乙腈)采用梯度洗脱(0～25min，流动相a和b的体积比维持84:16；25～36min，流动相a和b的体积比降至80:20；36～40min，流动相a和b的体积比升至84:16)，洗脱流速为1.0ml/min，进样体积为20μl。得到的单糖标准品的hplc色谱图如图2所示。

由图2可见，8种单糖混合标准品在色谱图中得到较好的分离，各单糖(1→8)对应的保留时间依次为：甘露糖(man)12.87min、核糖(rib)16.99min、鼠李糖(rha)18.32min、葡萄糖醛(glcua)20.13min、半乳糖醛酸(galua)22.85min、葡萄糖(glc)27.62min、半乳糖(gal)31.19min、阿拉伯糖(ara)33.45min。8种单糖的浓度与峰面积的线性相关系数介于0.9925～0.9951。

(2)莲藕多糖的单糖组成分析及方法学评价

取100μl多糖溶液(5mg/ml)于安瓿瓶中，加入100μl的三氟乙酸(tfa，4mol/l)溶液，充氮气封管，并置于110℃烘箱中水解8h；水解结束后，将冷却的水解液转移至离心管，分两次用150μl甲醇洗涤安瓿瓶，且一并移入离心管；水解液用n2吹干，重复加甲醇吹干2次，去除tfa，加入超纯水溶解后得到水解液样品；取50μl水解液与50μl的naoh溶液(0.6mol/l)混匀，加入100μl的pmp甲醇溶液(0.5mol/l)后于70℃烘箱中避光反应100min；反应结束后室温避光冷却10min，加入100μl的hcl溶液(0.3mol/l)中和，补水至2ml；加入等体积氯仿，漩涡混匀，静置分层后弃去氯仿相，重复操作3次；取水相，经0.45μm微孔滤膜过滤后供hplc定性、定量分析。

取混合单糖标准品的pmp衍生物，重复进样5次，8种单糖峰面积和保留时间的rsd值均小于5％，说明检测方法精密度较良好。

将水解、衍生化和中和萃取后的莲藕多糖样品分别放置0、4、8和12h后测定单糖组成及含量，结果表明样品各色谱峰的峰面积标准偏差rsd介于2.11％～2.98％，保留时间rsd值介于1.32％～2.03％，检测方法在12h内具有良好稳定性。

对5份莲藕多糖样品溶液，分别进行水解、衍生化、中和萃取操作制备得到平行的莲藕多糖hplc供试液5份。测定单糖组成及含量发现，各色谱峰的峰面积rsd值介于1.35％～3.56％，保留时间rsd值介于1.13％～3.31％，表明检测方法的重复性良好。

(3)莲藕多糖的pcd-hplc指纹图谱构建

按照(2)的方法进行莲藕多糖的单糖组成分析，得到的莲藕不同部位的pcd-hplc指纹图谱如图3所示，由图3a至图3e可见，不同部位莲藕多糖的pcd-hplc指纹图谱较为相似，但亦略有差异。以最小共有峰值1％分析其共有模式的指纹特征，具体分析数据如表2所示，由表2可见不同部位的相似之处在于均含有man、galua、glc、gal和ara的共有峰，且glc和gal对应特征峰的峰面积百分比均超过91％。而微弱的差异之处在于：食用部位多糖还含有rha的共有峰；皮部多糖还含有rib的共有峰；而藕节多糖同时含有rha、rib和glcua的共有峰。

对39个多糖样品pcd-hplc图谱的平均向量构建莲藕多糖标准hplc指纹图谱(图3f所示)，以此为参照图谱，采用相关系数(r)和夹角余弦(cosθ)分析不同品种及不同部位多糖的pcd-hplc指纹图谱相似性，具体分析数据如表3所示，两种相似度值之间的pearon相关性极显著(p<0.001)。除贵溪浮藕食用部位多糖和博白藕皮部多糖外，其余37个多糖样品的相关系数值和夹角余弦值均高于0.9。由此说明，不同品种及不同部位多糖的hplc指纹特征较为相似，其标准指纹图谱可以作为莲藕多糖真伪鉴别的重要依据，而贵溪浮藕食用部位多糖的hplc指纹图谱特异性可以用于品种鉴别参考。

表2.莲藕多糖的pcd-hplc指纹图谱的共有峰信息

注：“nd”表示取最小共有峰值为1％时，在共有模式中该单糖未检出。

表3.莲藕多糖pcd-hplc指纹图谱的相似度分析

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。