检测人血浆中匹伐他汀的液相色谱‑串联质谱方法及临床药动学研究的应用与流程

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及检测人血浆中匹伐他汀的液相色谱-串联质谱方法及其应用。

背景技术：

匹伐他汀(pitavastatin，ptv)结构式如图1所示，是由日本日产化学工业株式会社与兴和株式会社共同开发的第三代他汀类药物，是一种羟甲戊二酰辅酶a(hmg-coa)抑制剂，能有效降低血脂水平，临床用于治疗原发性高脂血症和混合型血脂异常等。ptv在人体内主要以原形的方式存在，同其它他汀类化合物一样。ptv结构中含有羟基羧酸结构，在体内和体外均能脱水关环形成匹伐他汀内酯结构。由于匹伐他汀内酯在体外易水解转化为匹伐他汀，从而对匹伐他汀血药浓度的准确测定有影响。为了减弱匹伐他汀内酯和匹伐他汀两者之间在样品采集、存储和预处理等过程中发生羟基羧酸型与内酯型结构的相互转化、获得较准确的测定结果，要求生物样品在采集存储以及预处理等过程中操作步骤简单、快速且条件易于控制，如控制温度和ph等，有利于匹伐他汀内酯和匹伐他汀相互转化。

目前，对血浆样品预处理的方法主要有三种：蛋白沉淀法、液-液提取法和固相萃取法。现有技术检测人血浆中匹伐他汀的分析方法，如shen-tu于2009年建立的检测方法，采用蛋白沉淀法的预处理方法，帕罗西汀为内标物，但该方法未评估内酯和羟基羧酸的相互转化。如deng于2008年建立的检测方法，采用复杂的固相萃取预处理方法，氟伐他汀为内标物，分析时间过长为5分钟，但该方法仍未评估内酯和羟基羧酸的相互转化。如yin、luo和huang分别于2014、2015、2014年建立的检测方法，预处理方法均为液-液提取，并在提取过程中分别使用了磷酸、甲酸、和ph4.2缓冲液，然而这些酸性试剂会导致匹伐他汀转化为其内酯形代谢物，导致造成测定结果偏低。还有nirogi于2007年建立的检测方法，采用复杂的固相萃取法的预处理方法，瑞舒伐他汀为内标物，需要消耗血浆大约0.5毫升，分析时长6min，有样品量大、分析时间过长的不足。

上述方法大部分采用液-液提取法或固相萃取法。两种方法在实际操作过程中，预处理步骤比较繁琐、血浆用量大、费时、提取条件不易控制，不适用于测定血浆中不稳定药物的浓度，并且，均未评估匹伐他汀和内酯之间的相互转化，有的方法甚至使用了酸性试剂，导致了错误的测定结果，除此之外还有色谱分析时间长的缺点。另外，上述现有技术所采用的内标物，重现性、准确性不佳，同样具有导致测定结果不准的隐患。

有鉴于上述的缺陷，为满足临床生物样品分析的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，为了建立简单、可靠、高通量、条件可控的提取及检测的沉淀蛋白法，并采用氘代内标作为校正，用于测定人血浆中匹伐他汀的血浆浓度，以解决生物样品分析周期长，预处理复杂、药物不稳定等问题。本发明技术方案如下：

一种检测人血浆中匹伐他汀的液相色谱-串联质谱方法，包括下述步骤：

预处理，融化血浆，加入内标d4-匹伐他汀，加入乙腈沉淀蛋白，涡流及离心后取上清液为待测样品；

色谱，将待测样品液相色谱分离，采用eclipseplusphenyl-hexyl柱，等度洗脱，流动相a:流动相b体积比为65:35，流速0.5μl/min，柱温40℃，进样量2.0μl，流动相a为2mm醋酸铵水溶液，流动相b为乙腈；

质谱，采用电喷雾电离源离子源，正离子多反应监测(+mrm)扫描，喷雾电压5000v，内源气体1(n2)60psi，气体2(n2)70psi，气帘气体(n2)40psi，离子源温度500℃，匹伐他汀反应监测离子[m+h]+m/z422→m/z290，ce37ev，d4-匹伐他汀反应监测离子[m+h]+m/z426→m/z294，ce37ev；

计算，以匹伐他汀浓度为横坐标，匹伐他汀与内标d4-匹伐他汀的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算匹伐他汀的血药浓度。

本发明方法进一步的，所述预处理步骤，在冰水浴条件下融化血浆。

本发明方法进一步的，所述预处理步骤，内标d4-匹伐他汀溶液配制如：称取d4-匹伐他汀钙以甲醇溶解并定容制得1.00mg/ml的内标贮备液，吸取所述内标贮备液适量，加入稀释液得浓度5.00ng/ml的d4-匹伐他汀内标溶液，所述稀释液为乙腈和水混合液，乙腈:水的体积比为50:50。

本发明方法更进一步的，所述预处理步骤，取50.0μl融化后血浆，分别加入50.0μl内标d4-匹伐他汀溶液和200μl乙腈，涡流及离心后取上清液为待测样品。

本发明方法更进一步的，所述涡流及离心条件为，涡流1min，14000rpm离心5min。

本发明方法进一步的，所述色谱步骤，将待测样品置于自动进样器内，进行lc-ms/ms分析，进样体积为2.00μl，进样器温度4℃，并且，在泵和进样器之间设置预柱。

本发明方法进一步的，所述色谱步骤，eclipseplusphenyl-hexyl柱长度50mm、直径2.1mm。

本发明方法进一步的，所述色谱步骤，流动相a和流动相b均含0.1％甲酸。

本发明目的之二，提供检测人血浆中匹伐他汀的液相色谱-串联质谱方法在评价匹伐他汀生物等效性的应用，是以d4-匹伐他汀为分析检测匹伐他汀的内标物。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

①本发明以氘代匹伐他汀做内标物，确定匹伐他汀和内标的mrm离子选择通道，测定血液中匹伐他汀浓度的重现性、准确性均较好；

②预处理前采用统计匹伐他汀浓度rsd％考察，评估匹伐他汀和内酯间的相互转换，确保待测血浆样品匹伐他汀稳定进行检测，保证测定数据的准确性；

③对样品预处理、色谱分离和质谱检测，建立经济简便的匹伐他汀浓度检测方法，采用本发明条件的蛋白沉沉淀法，其内源性杂质峰的干扰作用小，无液液萃取后氮气吹干重新溶解的步骤，满足方法学的各项考证指标；

④本方法对血浆样品检测的专一性强，采用eclipseplusphenyl-hexyl柱，两者分离度好，色谱仅在2min内完成测定，本发明条件下的分离过程，内源性物质不干扰两者的测定；

⑤灵敏度高，血浆样品中匹伐他汀的最低限量可低至0.1ng/ml；

⑥检测快速，2min内完成血浆样品的一次测定，满足高通量大批量生物样品的检测；

⑦用量小，每次血浆样品测试仅需2.00μl即可准确测定出匹伐他汀浓度；

⑧采用本发明建立的lc-ms/ms方法测定匹伐他汀血药浓度，得到匹伐他汀的药动学参数，可用于评价匹伐他汀各剂型的生物等效性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是匹伐他汀化学结构式图；

图2是匹伐他汀q1扫描质谱图；

图3是d4-匹伐他汀q1扫描质谱图；

图4是匹伐他汀产物离子扫描质谱图及推测的断裂方式示意图；

图5是d4-匹伐他汀产物离子扫描质谱图及推测的断裂方式示意图；

图6是匹伐他汀(上)和d4-匹伐他汀(下)空白样品mrm色谱图；

图7是匹伐他汀(上)和d4-匹伐他汀(下)lloq样品mrm色谱图；

图8是空白样品(上)和空白样品中仅加内标物(下)的mrm色谱图；

图9是受试者口服匹伐他汀钙片后样品匹伐他汀(上)和d4-匹伐他汀(下)的mrm色谱图；

图10是34名健康受试者单次口服2mg受试制剂或参比制剂平均药物浓度-时间曲线图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立检测方法。

[预处理]

首先融化血浆，加入内标d4-匹伐他汀，加入乙腈沉淀蛋白，涡流及离心后取上清液为待测样品。由于他汀类药物的不稳定性已经被广泛报道，本发明将内酯形代谢物配制于血浆中，并放置于不同的温度及条件下，如室温、冰水浴、-70℃，考察其稳定性，试验表明，冰水浴进行血浆的融化操作，有利于控制反应条件、提高分析通量。

可取50.0μl融化后血浆，分别加入50.0μl内标d4-匹伐他汀溶液和200μl乙腈，涡流及离心后取上清液为待测样品，所述涡流及离心条件为，涡流1min，14000rpm离心5min。待测样品置于自动进样器内，进行lc-ms/ms分析，进样体积为2.00μl。该方法简单、快捷、血浆用量少，并以d4-ptv为内标物，提高了检测方法的重现性和准确性。该预处理方法适合匹伐他汀钙片临床生物等效性样品高通量检测。

[质谱]

采用电喷雾电离源离子源，正离子多反应监测(+mrm)扫描，喷雾电压5000v，内源气体1(n2)60psi，气体2(n2)70psi，气帘气体(n2)40psi，离子源温度500℃，匹伐他汀反应监测离子m/z422→m/z290，ce37ev，d4-匹伐他汀反应监测离子m/z426→m/z294，ce37ev。主要碎片离子m/z分别为290和294，将其分别作为定量分析ptv和d4-ptv时监测的离子，如图2和图3所示，图2是匹伐他汀q1扫描质谱图，图3是d4-匹伐他汀q1扫描质谱图。推测的断裂方式分别见图4和图5，图4是匹伐他汀质谱断裂方式示意图，图5是d4-匹伐他汀质谱断裂方式示意图。

[色谱]

将血浆样品液相色谱分离，采用eclipseplusphenyl-hexyl柱，等度洗脱，流动相a:流动相b体积比为65:35，流速0.5μl/min，柱温40℃，进样量2.0μl，流动相a为2mm醋酸铵水溶液，流动相b为乙腈。将待测样品置于自动进样器内，进行lc-ms/ms分析，进样体积为2.00μl，进样器温度4℃，并且，在泵和进样器之间设置预柱。eclipseplusphenyl-hexyl柱长度50mm、直径2.1mm。流动相a和流动相b均含0.1％甲酸。

ptv结构中由多个苯环结构，eclipseplusphenyl-hexyl色谱柱的苯基官能团，相对于c8色谱柱或c18色谱柱能提供额外的分离机制，分离效果更好，本发明所采用的eclipseplusphenyl-hexy熔融核色谱技术超快速色谱分离，具有高柱效、高通量和低背压的特点。在方法开发过程中出现了轻微的色谱峰拖尾现象，通过在水相中添加0.1％甲酸的方法可以减轻拖尾，同时增强[m+h]⁺峰稳定性，提高化合物质谱响应，从而提高峰高和峰对称性。由于在未知样品中含有匹伐他汀内酯，甲醇不利于内酯的稳定，选择乙腈为流动相，试验中采用等度洗脱方式，它的重现性优于梯度洗脱。色谱运行时间仅为2.0min，缩短了生物样品色谱分析时间。

实施例：

缩写说明

1材料

1.1仪器

色谱仪：lc-30ad快速液相色谱系统，日本岛津公司。

质谱仪：6500型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(turboionspray)加拿大sciex公司。

数据处理采用软件：analyst(version1.6.3)，加拿大sciex公司。

离心机：herμlez2326k型台式离心机，德国贺默公司。

分析天平：cd225d型分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。

1.2对照品和试剂

匹伐他汀钙(纯度，88.2％)由深圳信立泰药业股份有限公司提供，d4-匹伐他汀钙(纯度，98.6％)购自加拿大torontoresearchchemicals公司。甲醇、乙腈、醋酸铵(hplc级)购自美国sigma公司。去离子水(18.2mω,toc≤50ppb)由法国milli-q超纯水系统制备。

2方法

2.1溶液及样品的配制

标准系列样品：精密称取匹伐他汀钙对照品适量，以甲醇分别溶解并定容，配制成匹伐他汀浓度约为1.00mg/ml的贮备液。精密吸取贮备液适量，以人空白血浆逐级稀释得到标准系列样品，匹伐他汀浓度范围为0.100～80.0ng/ml。

质控样品：采用与标准系列样品相似方法配制匹伐他汀四个浓度水平混合质控样品。lloq浓度为0.100ng/ml，lqc浓度为0.300ng/ml，mqc浓度为8.00ng/ml，hqc浓度为64.0ng/ml。

内标溶液：精密称取d4-匹伐他汀钙以甲醇溶解并定容制得1.00mg/ml的内标贮备液，吸取所述内标贮备液适量，加入稀释液得浓度5.00ng/ml的d4-匹伐他汀内标溶液，所述稀释液为乙腈和水混合液，乙腈:水的体积比为50:50。

2.2血浆样品处理

取50.0μl血浆，分别加入50.0μl内标溶液和200μl乙腈。涡流1min，离心5min(14000rpm)后，置于自动进样器内，进行lc-ms/ms分析，进样体积为2.00μl。

2.3色谱及质谱条件

色谱条件

色谱柱：eclipseplusphenyl-hexyl柱，50×2.1mmi.d.，安捷伦公司。

预柱：krudkatcherultra，美国菲罗门公司。

流动相a：2mm醋酸铵水溶液，含1％甲酸。

流动相b：乙腈，含1％甲酸。

等度洗脱，流动相a:流动相b＝65:35，v/v。

柱温：40℃。

流速：0.5μl/min。

进样量：2.0μl。

自动进样器温度：4℃。

质谱条件

电喷雾电离源离子源，正离子多反应监测(+mrm)扫描，喷雾电压5000v，内源气体1(n2)60psi，气体2(n2)70psi，气帘气体(n2)40psi，离子源温度500℃，匹伐他汀反应监测离子m/z422→m/z290，ce37ev，d4-匹伐他汀反应监测离子m/z426→m/z294，ce37ev。

2.4方法学验证

按照美国fda指导原则对本方法进行了方法学验证，内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率基质效应。

选择性

取六个不同来源的空白血浆、一个溶血血浆和一个餐后空白血浆及各自配制的lloq样品处理后进样分析。色谱共流出空白血浆中待测物保留时间处色谱峰面积不高于lloq色谱峰面积的20％，空白血浆中内标保留时间处色谱峰面积不高于内标色谱峰面积的5％。

标准曲线

以待测物理论浓度为横坐标(x)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y)，进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子w＝1/x²)。即本发明以匹伐他汀浓度为横坐标，匹伐他汀与内标d4-匹伐他汀的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算匹伐他汀的血药浓度。方法验证每一分析批对标准曲线样品双样本分析。lloq样品测得值与理论值相对偏差在±20％之内，其它浓度样品在±15％之内。至少75％标准曲线样品应满足上述条件，且标准曲线的lloq和定量上限双样本样品中须至少保证一样本满足上述条件。标准曲线的相关系数的平方值(r²)>0.99。

精密度和准确度

方法验证每一分析批测定四浓度质控样本各六样本。lloq日内、日间精密度以rsd计算小于20％方可接受，准确度以re在±20％之间方可接受。其余各浓度水平的qc样品各成分日内、日间精密度需小于15％方可接受，准确度在±15％之间方可接受。

稳定性

考察匹伐他汀在血浆样品中的稳定性时，将lqc和hqc质控样品置于不同温度及环境中，放置结束后进行六样本分析。共考察五种放置条件，分别为：

①冰水浴放置24h；

②提取后进样器内放置72h，经历5次冷冻-解冻循环(从-75±10℃到冰水浴)；

③-75±5℃放置62天；

④-20±5℃放置7天；

⑤全血样品冰水浴放置2h稳定性。

回收率

取低、中、高三个浓度质控血浆样品，其中匹伐他汀血浆浓度分别为0.30、8.00和64.00ng/ml。每一浓度进行六样本分析。取空白血浆按照“2.2血浆样品预处理”操作(以乙腈-水替代内标，1:1，v/v)，平行制备多份，将获得空白上清液合并后配制低、中、高三浓度回收率样品(匹伐他汀血浆浓度分别为0.300、8.00和64.0ng/ml，内标血浆浓度为5.00ng/ml)，每浓度进行六样本分析。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算回收率。内标回收率以两种处理方法下所有样品的内标峰面积比值计算。

基质效应

分别取6个不同来源空腹空白血浆、1份餐后采集的空白血浆和1份溶血空白血浆，按照“2.2血浆样品预处理”操作(以乙腈-水(1:1，v/v)替代内标)，平行制备多份，将获得空白上清液合并后配制低、高两浓度基质样品(匹伐他汀血浆浓度分别为0.300和64.0ng/ml，内标血浆浓度为5.00ng/ml)。每一来源每一浓度水平进行三样本分析；同时用水代替空白血浆，同法操作后进行三样本分析。分别计算两种处理方式下待测物和内标各自基质因子，并以此计算内标归一化后的基质因子。以归一化基质因子的变异程度评价分析方法的基质效应，基质因子小于15％方可接受。

2.5匹伐他汀和匹伐他汀内酯结构相互转化评估

据文献报道，匹伐他汀在室温/冰水浴/-20℃/-70℃条件下稳定，但温度、ph值会影响匹伐他汀内酯的稳定性，为此，本实验预先考察了匹伐他汀内酯的稳定性。方法：配制匹伐他汀和匹伐他汀内酯三个浓度的血浆样品，放置于室温4h/冰水浴4h/-70℃4h三种温度条件下比较匹伐他汀内酯与匹伐他汀浓度的变化。

2.6生物等效性研究

应用建立的定量分析方法测定血浆中匹伐他汀的浓度，用于评价匹伐他汀钙片人体生物等效性。34名健康受试者随机分成两组，分别给予2mg匹伐他汀钙片的参比制剂和受试制剂。7天清洗期后将参比制剂组与受试制剂组交换。于给药前(0h)、给药后0.167h、0.333h、0.500h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12h、16h、24h、36h和48h，静脉取血2～3μl，置肝素抗凝离心管中，离心(2000g，4℃)10min后分离血清，75±10℃保存。

3结果与讨论

3.1方法学验证

方法的选择性

如图6、同样7、图8和图9所示，匹伐他汀保留时间分别为0.78min，保留时间附近未见共流出干扰峰。

标准曲线

计算，以匹伐他汀浓度为横坐标，匹伐他汀与内标d4-匹伐他汀的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算匹伐他汀的血药浓度。测定人血浆中匹伐他汀线性范围为0.100～80.0ng/ml；待测物标准曲线直线平均回归方程(n＝3)分别为：

ptv:y＝(0.242±0.011)x+(0.00124±0.00077)(r＝0.9993±0.0003)。

方法的精密度与准确度

匹伐他汀lloq日间精密度均小于5.1％，日内精密度均小于10.4％，准确度在-9.0～2.9％范围内，如表2所示。匹伐他汀其余浓度(lqc\mqc\hqc)qc样品日内精密度均不大于3.2％，日间精密度均不大于3.2％，准确度在-5.8～-0.7％范围内，同样如表1所示。

表1测定人血浆中匹伐他汀精密度和准确度

处理回收率

lqc、mqc和hqc浓度水平：ptv的提取回收率为93.3％、94.6％和95.3％；d4-ptv、97.3％。

基质效应

lqc、hqc浓度水平下ptv的基质因子分别为99.7％和98.1％，rsd均为1.3％。以上结果表明，基质不干扰待测物定量分析。

血浆稳定性考察

血浆稳定性试验结果见表2、表3、表4、表5、表6。

ptv血浆样品五次冷冻解冻，-70℃冷冻，冰水浴解冻稳定性样品测定浓度的rsd均小于1.8％，re为-1.8～1.2％之间；

自动进样器(4℃)放置72h后测定浓度的rsd均小于2.6％，re为-3.4～-2.5％之间；

冰水浴放置24h后测定浓度的rsd均小于2.1％，re为-2.6～2.3％之间；

-20℃冷冻放置7天测定浓度的rsd均小于2.0％，re为-0.4～0.6％之间；

-70℃冷冻放置62天测定浓度的rsd均小于5.9％，re为4.0～6.1％之间。

上述结果表明在上述条件下ptv均稳定。

表2五次冷冻解冻，-70℃冷冻，冰水浴解冻的血浆稳定性考察

表3动进样器(4℃)放置72h的血浆稳定性考察

表4冰水浴放置24h的血浆稳定性考察

表5-20℃冷冻放置7天的血浆稳定性考察

表6-70℃冷冻放置62天的血浆稳定性考察

全血稳定性考察

全血稳定性试验结果见表8。ptv全血样品冰水浴放置2h测定浓度的rsd均小于2.5％，低高稳定性分别为103和102％。结果表明在冰水浴中放置2h条件下ptv稳定。

表7全血样品冰水浴放置2h的稳定性考察

3.2匹伐他汀和匹伐他汀内酯结构相互转化考察

实验结果证明，冰水浴4h/-70℃4h两种条件下，匹伐他汀与匹伐他汀内酯的浓度无明显变化，室温条件下，匹伐他汀内酯放置4h后浓度降低了40％，匹伐他汀浓度升高20％，室温条件下进行血浆预处理会造成内酯向匹伐他汀的转化，采用冰水浴的方法能控制温度，防止内酯向匹伐他汀转化，本实验在血浆样品预处理时确定采取冰水浴的方式防止匹伐他汀与匹伐他汀内酯的相互转化作用。

4人体生物等效性研究

本发明提供检测人血浆中匹伐他汀的液相色谱-串联质谱方法在评价匹伐他汀生物等效性的应用，是以d4-匹伐他汀为分析检测匹伐他汀的内标物。将验证后的方法用于定量检测血浆中匹伐他汀，以评价匹伐他汀钙片的生物等效性。34名健康受试者单次口服受试制剂匹伐他汀钙或者参比制剂。平均血浆药物浓度-时间曲线见图10，t为口服受试制剂匹伐他汀钙样本，r为参比制剂。采用winnonlin软件(美国pharsight公司)非房室模型计算的主要药动学参数cmax、auc(0–t)、auc(0–∞)、tmax和t1/2。在90％置信区间内，cmax和auc(0–∞)比值在0.80～1.25范围内，表明两种药物生物等效(数据未给出)。