一种水貂阿留申病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的制作方法
本发明属于病毒检测技术领域，特别涉及一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒。
背景技术：
水貂阿留申病(aleutianminkdisease，amd)是由水貂阿留申病毒(aleutianminkdiseasevirus，amdv)引起的水貂慢性传染性疾病，主要侵害水貂的免疫系统，以浆细胞弥漫性增生和持续性病毒血症为特征。该病在欧洲、美洲、亚洲等国家均有发生，我国的东北地区以及山东、新疆、内蒙古等地普遍流行，阳性率在20％～30％，个别可达71％。amd不仅能引起一定程度的死亡，还可导致水貂的繁殖力和毛皮质量严重下降，造成不可弥补的经济损失，是危害水貂养殖业健康发展的重要疫病之一。
水貂阿留申病毒(aleutianminkdiseasevirus，amdv)属于细小病毒科(parvoviridae)、细小病毒亚科(parvovirinae)、阿留申貂病毒属(amdovirus)。该病毒粒子分为结构蛋白和非结构蛋白两类，其中结构蛋白vp2是amdv的主要免疫原性抗原，与致病性密切相关，vp2基因也已成为研究amdv毒力、致病性、抗原性和建立检测方法的首选基因。由于amd特殊的致病机理，至今尚无有效预防该病的常规疫苗，也无有效治疗该病的特异性药物。目前防控该病的主要手段是通过检疫淘汰策略净化种群，因此建立一种快速有效的诊断方法对amd的控制和清除具有重要意义。
申请公布号为cn105242042a的发明专利公开了一种水貂阿留申病毒抗体快速检测试剂盒，可以通过间接elisa法对水貂amdv病毒抗体进行检测，其特异性较传统的对流免疫电泳法(ciep)更高，但是间接elisa法和ciep法的检测靶标是抗体，需要对貂群进行频繁采血，而对貂采血难度较大、对貂的应激也较大，因此适用范围有限。而双抗体夹心elisa(das-elisa)的灵敏性和特异性均较高，更重要的是，该方法只需采集貂粪即可进行检测，适用于兽医临床样品的大规模检测。因此，对于amdv检测的das-elisa方法进行探索和优化，以提供最佳的检测条件和方法，成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体、酶标抗体以及显色液，其中：
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒vp2蛋白单克隆抗体，包被浓度为5～20μg/ml；所述单克隆抗体由adv-1g5杂交瘤细胞株分泌产生，所述adv-1g5杂交瘤细胞株的保藏编号为cgmccno.13829；
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗体，浓度为4～40μg/ml；
所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg。
所述捕捉抗体由经4次免疫的balb/c小鼠脾细胞和sp2/0细胞融合形成的adv-1g5杂交瘤细胞产生，所述检测抗体由经3次免疫的兔脾细胞产生，均具有良好的特异性，适于应用；经与对照组比较，捕捉抗体和检测抗体在上述范围内时具有较好的检测效果。
进一步地，所述捕捉抗体的包被浓度为10μg/ml，所述检测抗体的浓度为8μg/ml。
实验例表明，上述浓度分别为捕捉抗体和检测抗体的最佳工作浓度。
进一步地，所述酶标板的包被方法如下：用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液对所述捕捉抗体进行稀释，包被温度为4～37℃，包被时间为1～12h。
通过上述方法进行包被，可显著提高包被的稳定性、降低包被浓度，节约捕捉抗体的用量。
进一步地，所述酶标板的包被温度为4℃，包被时间为12h。
实施例表明，上述条件为酶标板的最佳包被条件。
进一步地，所述酶标抗体的使用方法如下：将酶标抗体用1％的脱脂奶粉稀释2000～8000倍，在37℃下作用30～90min。
在上述条件下，酶标抗体具有较好的灵敏性，与检测抗体的结合率较高、牢固程度较好。
进一步地，所述试剂盒还包括封闭液、洗涤缓冲液、显色液以及终止液中的至少一种。
进一步地，所述封闭液为5％脱脂奶粉、5％胎牛血清、5％马血清、3％bsa或5％bsa中的一种。
进一步地，所述封闭液为5％的脱脂奶粉。
封闭液的作用是将酶标板中未被吸附的位点进行封闭，以降低非特异性吸附，避免吸附杂质对实验结果造成干扰，降低假阳性结果发生的概率。
进一步地，封闭条件为37℃下1～3h。
该条件下封闭液可以起到较好的封闭效果，降低本底干扰。
进一步地，所述显色液为tmb显色液，显色时间为5～20min。
显色时间在该范围内时，可以使显色充分、提高实验结果的准确性和显色效率。
本发明的有益效果如下：本发明提供了一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，利用amdv-vp2蛋白分别免疫小鼠和家兔，制成鼠抗amdv单克隆抗体和兔抗amdv多克隆抗体，分别作为捕捉抗体和检测抗体，对病毒抗原进行双向夹持，通过对酶标二抗与检测抗体结合的检测，实现了对amdv抗原的检测；通过对实验方法进行优化，确定了最佳反应条件。本研究建立的das-elisa检测方法具有敏感、特异、稳定、简便等优点，适用于一线检疫人员进行大规模病原检测。
附图说明
图1为实验例1中vp2重组表达蛋白sds-page电泳图；
图2为实验例1中vp2重组表达蛋白westernblotting分析结果；
图3为实验例2中pab和mab的ifa检测结果；
其中：a:pab感染crfk细胞的ifa检测结果；b:pab产生细胞的ifa检测结果；c：mab感染crfk细胞的ifa检测结果；d：mab产生细胞的ifa检测结果；
图4为实验例3中阳性样品组的棋盘法实验结果；
图5为实验例3中阴性样品组的棋盘法实验结果；
图6为实验例6中特异性实验的结果；
图7为实验例7中敏感性实验的结果；
图8为实验例8中das-elisa和pcr实验结果比较。
具体实施方式
下面结合附图和以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体，其中：
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒vp2蛋白单克隆抗体，包被浓度为5μg/ml；
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗体，浓度为4μg/ml；
所述酶标抗体为山羊抗兔igg-hrp。
实施例2
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体，其中：
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒vp2蛋白单克隆抗体，包被浓度为20μg/ml；
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗体，浓度为40μg/ml；
所述酶标抗体为山羊抗兔igg-hrp。
实施例3
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体，其中：
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒vp2蛋白单克隆抗体，用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将捕捉抗体稀释为10μg/ml，包被条件为37℃、1h；
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗体，浓度为8μg/ml；
所述酶标抗体为山羊抗兔igg-hrp，用1％的脱脂奶粉稀释2000倍。
实施例4
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体，其中：
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒vp2蛋白单克隆抗体，用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将捕捉抗体稀释为10μg/ml，包被条件为37℃、2h；
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗体，浓度为8μg/ml；
所述酶标抗体为山羊抗兔igg-hrp，用1％的脱脂奶粉稀释8000倍。
实施例5
一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，包括包被有捕捉抗体的酶标板、检测抗体以及酶标抗体，其中：
所述捕捉抗体为鼠抗阿留申病毒vp2蛋白单克隆抗体，用0.05mol/l的碳酸盐缓冲液将捕捉抗体稀释为10μg/ml，包被条件为4℃、12h；
所述检测抗体为兔抗阿留申病毒vp2蛋白多克隆抗体，浓度为8μg/ml；
所述酶标抗体为山羊抗兔igg-hrp，用1％的脱脂奶粉稀释5000倍。
实施例6
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为5％脱脂奶粉。
实施例7
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为5％胎牛血清。
实施例8
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为5％马血清。
实施例9
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为3％bsa。
实施例10
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为5％bsa。
实施例11
如实施例6所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括tmb显色液。
对照例1
如实施例3所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，其中所述捕捉抗体的包被条件为37℃、0.5h。
对照例2
如实施例3所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，其中所述捕捉抗体的包被条件为4℃、14h。
对照例3
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为1％bsa。
对照例4
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为8％bsa。
对照例5
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，还包括封闭液，所述封闭液为3％胎牛血清。
对照例6
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，其中所述酶标抗体用1％的脱脂奶粉稀释1000倍。
对照例7
如实施例5所述的一种水貂阿留申病毒双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒，其中所述酶标抗体用1％的脱脂奶粉稀释10000倍。
实验例1
阿留申病毒vp2抗原的制备与鉴定
(1)选取vp2基因600～1755nt区域进行合成并连接pet-30a(+)载体，阳性质粒转化bl21感受态细胞，挑取单克隆，进行摇瓶培养，提取质粒后进行测序；
(2)选取测序结果为阳性的菌于37℃摇床培养过夜，摇起的菌液以1﹕100接种量转入kanamycinlb液体培养基，37℃培养至od600nm值为0.4～0.6时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，37℃继续培养4h；
(3)收集诱导的菌体，1×pbs洗涤1次后重悬，利用超声波细胞破碎仪破碎菌体后离心，分别取上清和沉淀进行sds-page分析，确定目的蛋白表达情况；
(4)将表达的带组氨酸标签的vp2蛋白利用ni-ntaagarose进行纯化后，对包涵体蛋白进行复性，以amdv阳性血清作为一抗进行westernblotting分析，超滤浓缩后-80℃保存备用。
sds-page结果如图1所示，重组菌经iptg诱导获得高效表达，包涵体中出现55kda左右的目的蛋白条带，与预期结果相符；westernblotting结果如图2所示，显示目的蛋白与amdv阳性血清呈特异性反应，说明重组表达的vp2蛋白具有良好的免疫原性。
实验例2
抗体的制备与鉴定
1.捕捉抗体的制备与鉴定
(1)将阿留申病毒vp2抗原与fca等体积混合，按照60ug/只的剂量，对10只6周龄spf级雌性balb/c小鼠进行皮下注射免疫；
(2)此后每隔14d免疫一次，剂量为30ug/只，以ifca为佐剂；
(3)于第4次免疫后的第7d进行眼眶取血，用间接elisa法检测血清抗体效价，并用50ug抗原对免疫血清效价最高的小鼠进行腹腔冲击；
(4)腹腔冲击3d后，取免疫后小鼠脾细胞，采用peg法将其与sp2/0细胞进行融合，融合细胞采用hat半固体培养基筛选培养，得到adv-1g5杂交瘤细胞；
(5)以阿留申病毒为包被抗原建立间接elisa方法，对杂交瘤细胞上清进行检测；阳性杂交瘤细胞株鉴定亚类后扩大培养，以此制备腹水；
腹水采用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化，通过间接elisa测定mab效价，并用ifa法鉴定mab的特异性。
2.鉴定抗体的制备与鉴定
(1)将阿留申病毒vp2抗原与fca等体积混合，按照1mg/只的剂量，对若干只新西兰大白兔进行皮下多点注射免疫；
(2)14d后进行第二次免疫，剂量为1mg/只，以ifca为佐剂；
(3)再次间隔14d后进行第三次免疫，剂量为1mg/只，无佐剂；
(4)于第三次免疫后的第7d进行耳缘静脉采血，收获兔血清，通过间接elisa检测pab的效价，并用间接免疫荧光(ifa)检测pab反应活性。
实验结果显示，以纯化的vp2蛋白作为包被抗原，间接elisa方法检测pab和mab的效价分别为1﹕12800和1﹕204800。经southernbiotech亚类鉴定试剂盒鉴定，mab为igg2aκ亚型。ifa检测结果如图3所示，pab和mab均能与感染amdv的crfk细胞反应，出现绿色荧光，与未感染的crfk细胞则无反应，表明得到的pab和mab均具有较好的特异性。
实验例3
das-elisa实验方法的建立
1.捕捉抗体和检测抗体最佳工作浓度的确定
通过棋盘滴定法确定两者的最佳工作浓度。将mab按倍比稀释为40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml包被酶标板，将pab倍比稀释为4000μg/ml、800μg/ml、400μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、8μg/ml、4μg/ml和0μg/ml，加入1:5000稀释的山羊抗兔igg-hrp，进行das-elisa试验检测纯化amdv抗原，同步设立crfk细胞抗原为阴性对照。选择od450nm值接近1，p/n值最大孔所对应的mab和pab浓度作为最佳工作浓度。
实验结果如图4和图5所示，最佳工作浓度为：mab的包被浓度为10μg/ml，pab的浓度为8μg/ml
2.包被条件的确定
用ph9.6、0.05mol/l碳酸盐缓冲液稀释mab，分别按照实施例3～5和对照例1～2提供的包被条件对酶标板进行包被。在捕捉抗体和检测抗体的最佳工作浓度条件下，确定mab的最佳包被条件。
结果显示，实施例1～3提供的条件较对照例1～2提供的条件更佳，其中最佳包被条件为实施例5提供的4℃、12h。
3.封闭液和封闭时间的确定
捕捉抗体和检测抗体为最佳工作浓度，包被条件最佳，分别采用实施例6～10和对照例3～5中提供的封闭液，于37℃下分别作用0.5h、1h、2h、3h、4h、5h，测定od450nm的值，确定最佳封闭液和封闭时间。
结果显示，最佳封闭液为实施例6提供的5％脱脂奶粉，最佳封闭时间为1h。
4.抗原最佳作用时间的确定
在已确定的最佳反应条件下，包被、封闭后，采用实施例6所述的试剂盒，加入纯化的amdv，37℃分别反应15min、30min、60min、90min、120min、150min，进行das-elisa试验，确定待检抗原的最佳作用时间。
结果显示，抗原的最佳作用时间为60min。
5.酶标抗体稀释度和作用时间的确定
在上述确定的最佳试验条件下，将山羊抗兔igg-hrp分别按照实施例3～5和对照例6～7中提供的方法进行稀释，于37℃下分别作用15min、30min、60min、90min、120min，测定od450nm的值，确定酶标抗体的最佳稀释度和作用时间。
结果显示，酶标抗体的最佳稀释倍数为实施例5提供的1:5000，最佳作用时间为30min。
6.显色时间的确定
在上述优化的最佳反应条件下，每孔加入100μl的实施例11提供的tmb显色液，室温条件下分别避光显色1min、3min、5min、10min、15min、20min、30min后，每孔加入100μl浓度为2mol/l的h2so4终止反应，分别检测od450nm，确定最佳显色时间。
结果显示，最佳显色时间为5min。
实验例5
判定标准的确定
采用上述经优化的das-elisa方法检测30份经pcr确定为阴性的样品，计算od450nm的平均值
根据实验结果，cut-offvalue＝0.134+3*0.025＝0.21，即当od450nm＞0.21时，则判定样品为amdv阳性。
实验例6
特异性试验
以优化的最佳检测条件同步检测cpv、cdv、mev3种病毒，同时设立amdv阴、阳性对照和crfk细胞培养物的空白对照，检验该方法的特异性。
实验结果如图6所示，只有amdv的检测结果为阳性，其他3种病毒及crfk细胞培养物的检测结果均为阴性，说明该方法特异性良好，不易产生假阳性结果。
实验例7
敏感性试验
将纯化的amdv用pbs稀释至64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml，采用建立的das-elisa方法对其进行检测，以amdv的稀释度为横坐标，读取的od450nm值为纵坐标，绘制标准曲线，分析该方法的敏感性。
实验结果如图7所示，当amdv浓度为2μg/ml时结果仍为阳性，而当浓度为1μg/ml时结果则为阴性，说明该方法的最低检出量可以达到2μg/ml，敏感性较好。
实验例8
符合率试验
取102份临床肛拭子样品，利用建立的das-elisa与pcr方法同时对其进行检测，比较两者的检测结果，确定符合率。
实验结果如图8所示，其中阴性样品的符合率100％，阳性样品的符合率93.75％，总符合率96.875％，批间和批内变异系数均小于10％。表明该方法重复性较好，适宜用于对大批量样品进行分析。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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