一种生物膜成膜过程在线监控系统及监控方法与流程

本发明涉及微生物电化学技术领域，特别涉及一种生物膜成膜过程在线监控系统及监控方法。

背景技术：

生物膜是构成细胞所有膜的总称，包括围在细胞质外围的质膜和细胞器的内膜系统。生物膜包裹着细菌，具有保护细菌、提供多种酶的结合位点、提供细胞识别位点、参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构等功能。监控微生物成膜过程，研究自然或人为环境中生物膜内部微生物之间的相互作用，不仅对于理解自然或人为生物膜的形成和演替过程具有重要意义，而且也可以为生物膜在环境质量提升、微生物多样性维持等方面提供理论指导。

微生物成膜过程在线监控系统是由完全匹配的电化学系统单元与现有的光学显微成像单元构成，从而实现高稳定性，实时在线监控，宽广的操作空间和良好的拓展性能。微生物成膜过程在线监控系统需要用可视电化学反应池为微生物生存环境，导电玻璃为工作电极，以电流或电势为电化学监测信号，光学显微镜(包括宽视场光学显微镜、共聚焦显微镜、荧光显微镜等)用来实时图像输出、记录。

传统的微生物监测系统包括生物膜监测仪监控、利用光学显微镜的仪器监测。但由于实现生物膜成膜过程的在线监控需要配套运行复杂的电化学系统来提供稳定的生存环境用以实现实时的原位监控，而传统的电化学反应器密闭性差、尺寸相较载物台过大、结构不透光或不能形成光通路，而不适用于现有的监测仪器，无法实现电化学系统和光学系统的配套运行，无法实现微生物在电化学系统内成膜过程的在线、原位、实时观察、记录。在生物膜成膜过程在线监控时，传统电化学反应池不能同时匹配于电化学系统和光学显微镜成像系统，造成生物膜成膜过程在线实时监控不能实现，造成信息流失和不准确、不完整性。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述存在问题，提供一种微生物成膜过程在线监控系统及监控方法。该发明应用于微生物成膜过程在线监控时，可在厌氧或好氧条件下稳定运行的同时实时监控电极表面微生物的成膜情况并实时记录、输出图形数据和电化学信号，不受光学显微镜对待观察样品尺寸、规格的限制，精准的形成光反射通路，是一种全新的高效、稳定、宽适用范围的微生物成膜过程在线监控系统。

本发明的技术方案：

一种微生物成膜过程在线监控系统，所述微生物成膜过程在线监控系统主要包括电化学系统单元与光学显微成像单元，所述电化学系统单元包括电化学反应池、电化学工作站和进样系统(包括注射泵、注射器、进水)；所述的电化学反应池主体由下盖、上盖和池体构成，所述池体底部及下盖中央为中空设计，池体底部上设置有插槽，插槽内为导电玻碳或表面修饰的导电玻璃工作电极，该工作电极与池体上的工作电极接线柱连接，所述上盖上分别通过电极穿孔设置有ag/agcl或饱和甘汞参比电极和铂盘或铂丝对电极。所述电化学反应池为容积5-50ml的聚四氟乙烯材料的容器，所述池体上还设置有进液口和排液口，上盖上同时设有注液口，注液口上设有气孔塞。工作电极的面积为1-20cm²。对电极的表面积为1cm²。

生物膜成膜过程在线监控方法的步骤如下：

1)向上述电化学反应池池体底部的电极插槽位置放置1-20cm²的导电玻璃8工作电极，通过上盖上的电极穿孔向池体内插入ag/agcl或饱和甘汞参比电极1、1cm²的铂盘或铂丝对电极2(参见图1)，然后向池体中加入厌氧处理的纯菌、生活污水、厌氧污泥、河底海底沉积物或者经长期驯化生物相稳定的微生物燃料电池的出水，以浓度为0.5-2g/l的乙酸钠或葡萄糖作为底物，使用恒电位仪计时电流法或时间-电流法进行微生物的连续流或间歇流培养；

2)运行时刻开始，启动光学显微镜，实时记录或使用时间序列记录微生物成膜过程，实时输出图片、图形信息，针对任意培养时间的成膜情况和规律，向输出图像计算机输出三维/二维的明场、金相及荧光图像信息。实现电化学系统单元和光学显微成像技术的联合运行。

一种微生物成膜过程在线监控系统的应用，用于实时、原位、精准、稳定的监控和记录微生物成膜过程的电化学信号和生物膜形貌的表观或微观图像信息。该监控系统在厌氧、好氧，连续流、间歇流，各种不透光的对电极材料(如铂电极)存在的环境下，保证监控结果的真实、有效性。该体系在外接直流、交流电源等情况下，监测数据、图像仍可以直观、准确的反应生物膜的真实情况。

具体应用方法如下：

1)用75％的乙醇将电化学反应池超声清洗后，用蒸馏水洗净烘干；

2)向电化学反应池中加入通过厌氧处理的分离提纯的纯菌、初沉池污水或者经长期驯化生物相稳定的微生物燃料电池的出水，以浓度为0.5-2g/l乙酸钠或葡萄糖作为底物，使用恒电位仪计时电流法或时间-电流法进行微生物的培养，连接光学显微镜实时输出形貌图像。

本发明以精密的(可精准控制工作电极与对电极的距离及精准的光反射通路)电化学反应池(可同时匹配电化学系统及光学显微成像技术)为稳定的微生物膜培养环境，用恒电位仪和光学显微镜在线原位监控生物成膜过程。

本发明的有益效果是：该微生物成膜过程在线监控系统克服了传统生物膜监测技术无法实现电化学信号与光学图像同时监控的瓶颈，本发明的微生物成膜过程在线监控系统运行稳定、精准，适用范围广，拓展性能优异。

附图说明

图1为电化学反应池的结构示意图。

图2为电化学反应池的俯视结构图。

图3为微生物成膜过程在线监控系统。

图4为荧光显微镜和共聚焦显微镜图像。其中，a宽场显微镜图像，b荧光显微镜荧光图像，c激光共聚焦显微镜明场图像，d激光共聚焦显微镜荧光图像。图中，1参比电极，2盘状铂丝电极，3气孔塞，4工作电极接线柱，5上盖，6池体，7下盖，8导电玻璃，9排液口，10进液口，11进样系统(包括注射泵、注射器、进水)，12电化学反应池，13光学显微镜，14电化学工作站，15输出图像计算机。

具体实施方式

实施例1：

一、微生物成膜过程在线监控系统

如图3所示，微生物成膜过程在线监控系统给主要包括电化学系统单元与光学显微成像单元，所述电化学系统单元包括电化学反应池12、电化学工作站14和进样系统11(包括注射泵、注射器和进水)。本发明的电化学反应池12不仅可以连接于电化学工作站14，还可以连接于光学显微镜13，从而实现以前无法进行的微生物成膜过程在线监控。

所述的电化学反应池如图1和图2所示，电化学反应池主体由下盖7、上盖5和池体6构成，彼此之间可以通过螺纹连接；电化学反应池主体采用直径35mm，高35mm的聚四氟乙烯材料的容器构成，池体6底部及下盖7中央为中空设计，孔洞直径为20mm，池体6底部并设计为插槽样式，插槽内为工作电极，工作电极为1cm²的刻蚀图形导电玻璃8(实际工作面积为0.25cm²)，导电玻璃8(工作电极)与池体6侧壁上的工作电极接线柱4连接；同时通过上盖5上的电极穿孔向容器内插入参比电极1(为4mag/agcl电极)和对电极为1cm²的盘状铂丝电极2，电化学反应池的上盖5上同时设有注液口，以便注液和换气，注液口上设有气孔塞3，池体上设有进液口10和排液口9。

电化学反应池12放置在光学显微镜13的载物台上，通过光学显微镜宽场、荧光通道的切换直接进行目镜观察，也可通过输出图像计算机15进行实时观察和记录。电化学工作站14可直接连接电化学反应池12的参比电极1，盘状铂丝电极2和导电玻璃8，对电化学反应池12施加恒定输出电位等，并通过输出图像计算机15记录数据图像。进样系统(包括注射泵、注射器、进水)11连接于电化学反应池12的进液口10，流速可通过进样系统调节。

二、微生物成膜过程在线监控方法

向反应池中加入曝氮气10min厌氧处理的经长期驯化生物相稳定的微生物燃料电池的出水，以1g/l乙酸钠为底物，用注射泵恒定进液流速为0.2ml/h，使用恒电位仪计时电流法进行微生物的培养，用宽视场光学显微镜时间序列记录实时生物膜形貌，监控结果如图4所示，其中，a宽场显微镜图像，b荧光显微镜荧光图像，c激光共聚焦显微镜明场图像，d激光共聚焦显微镜荧光图像。

实施例2：

一、微生物成膜过程在线监控系统

具体结构同实施例1，其中的电化学反应池采用直径70mm，高50mm的聚四氟乙烯材料的容器构成，池体底部为中空设计，孔洞为直径32mm，并设计为插槽样式，工作电极为10cm²的导电玻璃，向容器内插入参比电极为4mag/agcl电极和对电极为1cm²的铂丝电极，电化学反应池顶端设置有注液口，便于注液和换气，池体设有进出液口，所有电极均可精准条件相对距离。

二、微生物成膜过程在线监控方法

向反应池中加入在严格厌氧条件下驯化提纯的geobactersulfurreducens菌液1ml，以1g/l乙酸钠为底物，用注射泵恒定进液流速为1ml/h，使用恒电位仪计时电流法进行微生物的培养，用荧光显微镜进行录像操作，实时记录生物膜形貌。

实施例3：

一、微生物成膜过程在线监控系统

具体结构同实施例1，其中的电化学反应池采用直径70mm，高30mm的聚四氟乙烯材料的容器构成，池体底部为中空设计，孔洞为直径32mm，并设计为插槽样式，工作电极为5cm²的导电玻璃，向容器内插入参比电极为4mag/agcl电极和对电极为1cm²的铂丝电极，电化学反应池顶端设有注液口，便于注液和换气，池体设有进出液口，所有电极均可精准条件相对距离。

二、微生物成膜过程在线监控方法

向反应池中加入曝氮气30min厌氧处理的初沉池市政污水，以2g/l乙酸钠为底物，关闭进出液口，使用恒电位仪计时电流法进行微生物的培养，用荧光显微镜进行实时拍照(明场、荧光图像)记录操作，实时记录生物膜形貌。