本发明属于生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种总胆汁酸测定试剂盒及其测定方法。
背景技术：
胆汁酸(3α-羟类固醇)是胆汁的重要组成成分，主要包括甘氨胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸和石胆酸等存在形式，这些胆酸合起来称为总胆汁酸(tba)。血清中的胆汁酸水平是反映肝实质损伤的重要证据，尤其在急性肝炎，慢性活动性肝炎、乙醇肝损伤和肝硬化时有较灵敏的变化。肝细胞发生病变时，血液中胆汁酸的含量升高。现有研究认为血清中胆汁酸的测定，对肝胆疾病的诊断其敏感性高达70％以上，特异性高达90％以上，在肝硬化等慢性肝病发生时，胆汁酸升高的出现比白蛋白、胆固醇和胆固醇酯等的改变来得更早，因此对慢性肝病的诊断有重要意义。tba的测定方法包括色谱法、酶联免疫法和酶学法等，酶学法由于检测快速渐变，应用广泛。目前酶学法主要采用五代循环酶法胆汁酸测试试剂盒，均采用游离的酶以及辅酶，酶和辅酶的用量较大，稳定性较差。胆汁酸被3α-羟类固醇脱氢酶(3α-hsd)及β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(thio-nad)特异性地氧化，生成3-酮类固醇，同时β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(thio-nad)被还原成β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(thio-nadh)，新生成的3-酮类固醇在3α-羟类固醇脱氢酶(3α-hsd)及β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(nadh)存在下，还原成胆汁酸，同时β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(nadh)氧化为β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(nad)。通过上述原理，血清中微量的胆汁酸在多次酶循环的过程中被放大，同时使生成的β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型(thio-nad)扩增。通过405nm处测定β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型(thio-nadh)吸光度的变化率，可求得样本中胆汁酸的含量。中国专利申请cn1632578公开了一种胆汁酸测定试剂，包括试剂1和试剂2，试剂1包括甘氨酸、thio-nad、tritonx-100和丙酮酸钠等；试剂2包括3αhsd、nadh、苯基或烷基二醇、tritonx-100和硼氢化物等；加入硼氢化物和苯基或烷基二醇作为nadh的稳定剂。中国专利申请cn102539791公开了一种测定总胆汁酸含量的试剂，由试剂1和试剂2两部分组成，试剂1中含有氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、缓冲剂、表面活性剂、稳定剂和防腐剂，所述试剂2中含有还原型辅酶ⅰ、羟类固醇脱氢酶、缓冲剂、表面活性剂、稳定剂以及防腐剂；试剂1和试剂2中均含有稳定剂和表面活性剂，稳定剂选自海藻糖、甘露醇、聚乙二醇、edta等的一种或几种，表面活性剂选自：吐温-20、曲拉通x-100、brij35等的一种或几种。现有的试剂盒使用的稳定剂种类较多，虽然可以提高稳定性，但抗干扰能力往往不够理想。因此，提供一种稳定性好且抗干扰能力好的胆汁酸测定试剂盒具有重要意义。技术实现要素：为解决现有技术中存在的问题(抗干扰能力不够理想)，本发明提供一种总胆汁酸测定试剂盒，通过添加一定浓度的聚乙二醇1200和甜菜碱，在提高试剂盒稳定性的同时显著增强了抗干扰能力，可显著降低胆红素、血红蛋白和甘油三酯等的干扰，用于总胆汁酸的测定准确性好。本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。一种总胆汁酸测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10～20g/l、6nhcl16～25g/l、硫代氧化型辅酶i0.6～2g/l、kcl6～15g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10～20g/l、6nhcl16～25g/l、还原型辅酶i4～8g/l、3a-羟类固醇脱氢酶6～15ku/l、聚乙二醇80～130g/l、甜菜碱溶液0.4～1.1ml/l。优选地，所述的总胆汁酸测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10～15g/l、6nhcl18～22g/l、硫代氧化型辅酶i0.8～1.5g/l、kcl8～12g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10～15g/l、6nhcl18～22g/l、还原型辅酶i4～6g/l、3a-羟类固醇脱氢酶8～12ku/l、聚乙二醇80～120g/l、甜菜碱溶液0.4～1.0ml/l。更优选地，所述的总胆汁酸测定试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、硫代氧化型辅酶i1g/l、kcl10g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、还原型辅酶i5g/l、3a-羟类固醇脱氢酶10ku/l、聚乙二醇100g/l、甜菜碱溶液1ml/l。6nhcl即6mol/lhcl。优选地，所述试剂r1还包括如下组分及其浓度：nan30.8～1.2g/l；所述试剂r2还包括如下组分及其浓度：nan30.8～1.2g/l。更优选地，所述试剂r1还包括如下组分及其浓度：nan31g/l；所述试剂r2还包括如下组分及其浓度：nan31g/l。优选地，所述聚乙二醇为聚乙二醇1200。优选地，所述甜菜碱溶液的浓度为1～5mol/l。更优选地，所述甜菜碱溶液的浓度为2mol/l。此外，本发明还提供总胆汁酸测定试剂盒的测定方法，包括如下步骤：分离血清样品，向血清样品中加入试剂r1，混匀，孵育3～5min后，加入试剂r2，混匀，孵育1～2min后，在405nm处测定β-硫烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原型吸光度的变化率，测得总胆汁酸浓度。反应分二步进行，先加入试剂r1孵育，然后加入试剂r2，血清中微量的胆汁酸在多次酶循环的过程中被放大，检测灵敏度高。与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过在总胆汁酸测定试剂中添加一定浓度的聚乙二醇1200，可显著增强测定试剂r2中3a-羟类固醇脱氢酶的酶活稳定性，测定试剂盒于2～8度条件的保质期长达12个月以上。进一步的，通过干扰物试验，发现使用聚乙二醇1200作为稳定剂的同时不添加抗干扰剂或添加现有的抗干扰剂，抗干扰能力不够理想，而添加少量甜菜碱则可显著增强抗干扰能力，用于总胆汁酸的测定准确性好。附图说明图1配方一的反应曲线图。图2配方二的反应曲线图。图3配方六的反应曲线图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。本发明中，所涉及的组分均为常规市售产品，或可通过本领域的常规技术手段获得。实施例一总胆汁酸测定试剂盒(配方二)总胆汁酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、硫代氧化型辅酶i1g/l、kcl10g/l、nan31g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、还原型辅酶i5g/l、3a-羟类固醇脱氢酶10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、甜菜碱溶液1ml/l、nan31g/l。甜菜碱溶液的浓度为2mol/l。实施例二总胆汁酸测定试剂盒总胆汁酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷15g/l、6nhcl20g/l、硫代氧化型辅酶i1.2g/l、kcl8g/l、nan31g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷15g/l、6nhcl20g/l、还原型辅酶i6g/l、3a-羟类固醇脱氢酶12ku/l、聚乙二醇120080g/l、甜菜碱溶液0.8ml/l、nan31g/l。甜菜碱溶液的浓度为2mol/l。实施例三总胆汁酸测定试剂盒总胆汁酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10g/l、6nhcl18g/l、硫代氧化型辅酶i1g/l、kcl10g/l、nan31g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷10g/l、6nhcl18g/l、还原型辅酶i5g/l、3a-羟类固醇脱氢酶10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、甜菜碱溶液0.8ml/l、nan31g/l。甜菜碱溶液的浓度为2mol/l。对比例1总胆汁酸测定试剂盒(配方一)总胆汁酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、硫代氧化型辅酶i1g/l、kcl10g/l、nan31g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、还原型辅酶i5g/l、3a-羟类固醇脱氢酶10ku/l、nan31g/l。配方一与配方二的区别在于：不含聚乙二醇1200和甜菜碱。对比例2总胆汁酸测定试剂盒总胆汁酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、硫代氧化型辅酶i1g/l、kcl10g/l、nan31g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、还原型辅酶i5g/l、3a-羟类固醇脱氢酶10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、nan31g/l。对比例2与实施例一的区别在于：不含甜菜碱。对比例3总胆汁酸测定试剂盒总胆汁酸测定试剂盒包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、硫代氧化型辅酶i1g/l、kcl10g/l、nan31g/l；所述试剂r2包括如下组分及其浓度：三羟甲基氨基甲烷12g/l、6nhcl20g/l、还原型辅酶i5g/l、3a-羟类固醇脱氢酶10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、nan31g/l、草氨酸钠溶液1ml/l。草氨酸钠溶液的浓度为2mol/l。对比例3与实施例一的区别在于：不含甜菜碱，含草氨酸钠。试验例一不同测定试剂盒的样品检测对比实验试剂：上述配方一和配方二，以及广州科方生物技术有限公司生产的tba测定试剂盒(包括试剂r1和r2，但成分与本发明不同，以下简称为市售组)。分别将上述实验试剂用于总胆汁酸的检测，用au400生化分析仪同时定标同时测定40例血清样品，结果如表1所示。表1不同试剂盒测定40例血清样品的结果(单位：μmol/l)经统计，市售组测定结果与配方一测定结果的相关系数r＝0.9995、市售组测定结果与配方二测定结果相关系数r＝0.9997、配方一测定结果与配方二测定结果相关系数r＝0.9998，说明相关性良好，试剂r2中加入一定量的聚乙二醇1200和甜菜碱不会对检测结果造成干扰，配方一和配方二与经国家食品药品监督管理局批准上市的产品无明显差异，结果准确可靠。试验例二不同测定试剂盒的加速稳定性考察对配方一和配方二分别进行37度加速破坏性实验，以考察其组分的稳定性，结果如表2所示。37度加速破坏性实验：指把试剂装在瓶子里并密封保存，放在37度水浴箱里面，进行加速破坏性实验，37度破坏性实验1周的时间相当于一般储存温度(2～8度)保存1年。表2配方一和配方二经加速破坏性实验1周后的样品检测结果(单位：μmol/l)从表2可知，未加速时，配方一的40例样品检测结果平均值为44.9，配方二的检测结果平均值为44.7，与配方一基本相当；经37度加速破坏性实验1周后，配方一的检测结果平均值为22.8，配方二的检测结果平均值为43.6。配方一经破坏性实验1周后的样品检测结果均显著下降，平均下降幅度达到了49.2％，而配方二由于含量一定量的聚乙二醇1200和甜菜碱，经破坏性实验1周后的样品检测结果并未发生明显变化，平均下降幅度仅为2.5％，属于合理范围。平均下降幅度＝(未加速时的均值－加速1周的均值)/未加速时的均值。为考察配方一经37度加速1周后的检测结果显著下降的具体原因，进行以下实验：分别在配方一经过37度加速1周后的r1和r2中分别补加其主要组分thio-nad或3α-hsd，加入量分别为相应初始浓度的50％，然后分别检测试剂1至试剂4的结果如表3所示。试剂1：r1和r2都未经加速；试剂2：r1和r2均经37度加速1周；试剂3：r1和r2均37度加速1周，并在r1中补加入thio-nad0.5g/l；试剂4：r1和r2均37度加速1周，并在r2中补加入3α-hsd5ku/l。表3试剂1至试剂4的样品检测结果(单位：μmol/l)样品序号12345678910试剂15.816.10.536.486.225.962.1116.275.555.9试剂22.78.80.212.643.012.942.052.932.622.6试剂32.68.60.212.742.812.743.652.433.022.1试剂45.515.60.53685.825.660.311675.355.8样品序号11121314151617181920试剂115.862.835.55.70.526.095.546.155.8106.4试剂28.742.412.92.50.212.542.822.923.852.7试剂38.836.712.82.90.313.143.322.722.953.0试剂415.456.135.25.50.525.695.345.955.7106.2样品序号21222324252627282930试剂145.86.515.762.9105.776.125.70.546.296.1试剂222.72.97.944.552.832.612.70.322.642.8试剂322.82.97.738.452.732.612.90.222.842.5试剂445.56.415.461.2105.675.525.40.545.995.9样品序号31323334353637383940试剂135.516.45.956.196.485.825.8116.475.558.3试剂215.88.62.822.642.942.712.662.732.937.2试剂315.77.62.722.742.342.912.961.833.141.7试剂435.316.25.855.995.585.525.6115.775.357.9从表3可知：1.试剂2(不补加thio-nad和3α-hsd)经加速实验后测值与试剂1有明显差异；2.试剂3(单独补加入thio-nad)经加速实验后测值与试剂1有明显差异，与试剂2测值基本一致，说明试剂r1中thio-nad没有失活；3.试剂4(单独补加入3α-hsd)经加速实验后测值与试剂1无明显差异，与试剂2的测值相比有明显增加，说明试剂r2中3α-hsd有明显失活。进一步，通过活性测定法分别检测配方一的r2试剂和配方二的r2试剂在未加速和37度加速1周时的3α-hsd的活力，各检测20次，结果如表4和表5所示。表4配方一的r2试剂检测的3α-hsd活力(单位：ku/l)表5配方二的r2试剂检测的3α-hsd活力(单位：ku/l)从表4和表5可以看出，配方一经加速1周，3α-hsd失活严重，失活比例达到了49.0％，而配方二由于加入一定量的聚乙二醇1200和甜菜碱，3α-hsd失活仅为3.4％，说明聚乙二醇1200和甜菜碱对3α-hsd有较好的保护作用。试验例三聚乙二醇1200和甜菜碱在试剂r2中的用量考察配方一如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l。配方二如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、甜菜碱1ml/l。配方三如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇120060g/l、甜菜碱0.6ml/l。配方四如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇120080g/l、甜菜碱0.8ml/l。配方五如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200120g/l、甜菜碱1.2ml/l。配方六如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200140g/l、甜菜碱1.4ml/l。配方七如下：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l、r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200100g/l。为考察聚乙二醇1200和甜菜碱在试剂r2中的用量，通过活性测定法分别检测配方一至配方七在未加速和37度加速1周时3α-hsd的活力，结果如表6所示。表6配方一至配方七在未加速和37度加速1周时3α-hsd的活力(单位：ku/l)从表6可以看出，配方一的3α-hsd失活严重，失活比例达到了48.9％，加入一定量的聚乙二醇1200和甜菜碱后的配方二至配方七失活比例分别为：1.9％，29.7％，20.8％，8.3％，12.7％，3.5％。说明聚乙二醇1200在试剂r2中的加样量80～140g/l且甜菜碱的加样量0.8～1.4ml/l时均能起到较好的保护作用。此外，分别对配方一至配方七的配方反应曲线进行检测，配方一至配方五以及配方七反应迅速，而配方六反应较慢，配方一的反应曲线如图1所示，配方二的反应曲线如图2所示，配方六的反应曲线如图3所示。说明聚乙二醇1200在试剂r2中的加样量达到140g/l且甜菜碱的加样量达到1.4ml/l时会对配方中成分产生一定的抑制，导致反应不能迅速进行。因此，配方二(聚乙二醇1200的加入量为100g/l、甜菜碱的加样量为1ml/l)的综合效果最佳。试验例四测定试剂盒的抗干扰能力测试人血清成分复杂，其中的胆红素和血红蛋白等可引起试剂盒测定的干扰，造成检测结果的差异。检测临床样品胆红素、血红蛋白浓度，筛选合适浓度样品。取一份无溶血血清样品，分成10份，依次加入不同浓度的干扰物(胆红素或血红蛋白)，分别使用配方一、配方二、对比例2以及对比3的试剂盒对添加胆红素或血红蛋白的血清样品进行检测总胆汁酸，剩余2份未加干扰物，进行抗干扰能力测试。相对偏差(％)＝(加入干扰物质-未加)/未加。配方一：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l；r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l。配方二：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l；r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、甜菜碱1ml/l。对比例2：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l；r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200100g/l。对比例3：r1:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、thio-nad1g/l、kcl10g/l；r2:tris12g/l、6nhcl20g/l、nan31g/l、nadh5g/l、3α-hsd10ku/l、聚乙二醇1200100g/l、草氨酸钠1ml/l。检测结果如表7和表8所示。表7试剂盒的抗胆红素干扰能力测试结果注：胆红素0指胆红素的浓度为0μmol/l，胆红素140指胆红素的浓度为140μmol/l。表8试剂盒的抗血红蛋白干扰能力测试结果注：血红蛋白0指血红蛋白的浓度为0g/l，血红蛋白2.2指血红蛋白的浓度为2.2g/l。由表7和表8可知，随着血清中含有的干扰物胆红素或血红蛋白浓度增大，检测结果的相对偏差上升。其中，以配方二的相对偏差最小，干扰物胆红素的浓度为340μmol/l时的相对偏差为7.7％，远低于配方一、对比例2和对比例3的相对偏差，配方一、对比例2和对比例3的相对偏差均超过10％；干扰物血红蛋白的浓度为4.2g/l时的相对偏差为4.7％，远低于配方一、对比例2和对比例3的相对偏差。可见，本发明提供的配方二可显著降低胆红素和血红蛋白的干扰，抗干扰能力较强。综上所述，本发明提供给的总胆汁酸测定试剂盒在提高稳定性的同时，显著增强了抗干扰能力，反应速度快，检测准确性好。以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。当前第1页12