对癌症的代理功能性诊断测试的制作方法

本申请是中国发明专利申请(申请日：2013年5月10日；申请号：201380036422.8(国际申请号：pct/us2013/040585)；发明名称：对癌症的代理功能性诊断测试)的分案申请。

优先权

本专利申请要求包含在美国专利临时申请号61/645,253(于2012年5月10日提出申请)和美国专利临时申请号61/780,252(于2013年3月13日提出申请)中的所有利益权利。上述两项美国专利申请书在此通过引用以其整体纳入本文。

本发明涉及对人体标本取样评价鉴定肿瘤有用的方法。

背景技术：

利用预测和预知性生物标记物与定靶癌症疗法相结合可能会是减少药物发展时间，提高药效以及指引作出临床决定的一把钥匙。虽然癌症治疗有进展，大部分化学疗法仍然是低效率及无效果的。化学疗法的总体低表现之一原因经常是所选择的治疗法和具体患者的病症没有密切对症好。精确的诊断法和治疗法相结合的个体化的医学途径可能缓解这个问题。

迄今为止只有屈指可数的生物标记物对临床肿瘤学实践有价值。部分原因是因为人们所感觉的生物标记物间是相互关联的，但是对药的机理是没有因果关系的。即便当“生物标记物”生物学与相伴的治疗法的药理学相搭配一致时，要想预测一种药是如何在患者体内工作仍然有重要的挑战。除此之外，临床发展道路要求医生们-科学家们的参与，由他们能看到生物标记物的测试的价值以及相信这能给患者带来益处。

bh3分布测试分析法(bh3profiling)测量癌细胞对化疗反应的决定性因果因素的功能性。具体地说,bh3分布测试分析法测量控制凋亡的线粒体(mitochondria)表面上的蛋白质的功能性。许多化疗依赖凋亡才能有效。测试的读数提供线粒体仅对促凋亡bh3蛋白质的bh3区域的反应。虽然已知bh3分布测试法提供一般意义上的化疗的化学敏感度或化学反应度，这个测试法迄今为止缺发支持医生对化疗试剂和癌种类作出决定的欲知能力。

本发明的总结

依照上述，一方面本发明提供对癌症患者选择某种治疗癌证方法的选择方法。此方法如下构成:对患者的肿瘤或癌细胞标本取样确定bh3分布数据或分布谱(bh3profile)；确定患者的一种或几种临床因素，以及为患者对一种或几种癌治疗有临床反应的可能性作出级别分类；从中选择一种或多种临床因素，以提高bh3分布谱和临床反应相关性的专属性和敏感性。

在一些具体化实施例中和象在此所展示，各种不同临床因素，即便那些和凋亡不相关的或未知有相关的因素，提高bh3分布测试分析法的预测能力，从而把此测试法转化成一个不仅仅是预后的，而且是预测的测试方法。

在一些具体化实施例中，在此所描述的方法提供一个诊断测试法，其可预测与细胞基因分布或状态相对配的血癌患者和/或与一定年龄相对配的血癌患者对阿糖胞苷(cytarabine)或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷(azacytidine)的反应。在一些实施例中，本发明的诊断测试法包括bh3分布测试分析，包括测量bim引起的线粒体膜电势变化。

另一方面，本发明为一个癌症患者的癌治疗定位提供一个方法，其组成如下：将患者的可渗透化的癌细胞和一个或多个bh3区域多肽相接触，由此定位其活化程度；通过免疫组织化学法和/或荧光原位杂化法(fish)，为患者的癌细胞的一个或多个临床因素的存在与否定位；为患者对一种或几种癌治疗有反应的可能性作出级别分类。

再一方面，本发明为确定一个aml患者对阿糖胞苷和/或阿扎胞苷的反应提供一个方法。此方法如下组成:确定患者的aml癌细胞取样作bh3分布；确定患者的一种或几种临床因素，其中从年龄分布和/或细胞基因状态中选出一种或多种临床因素；为患者对一种或几种癌证治疗有临床反应的可能性作出级别分类。

本发明的细节在下面附随的详细说明中阐述。虽然相似或相同于在此描述的方法和材料能用于本发明的实践或测试，现在表述用作说明性的方法和材料。本发明的其他特点和物体以及优点是从本发明说明书和权利要求书中是明了的。专利规格详述书和附加权利要求书中，单件表达方式也包括复数除非文本内清楚地另加说明另外意思。除非另外定义，本文应用的所有科技词语具有与本发明所属的技术领域内一般技能者的普通理解相同。

附图的简单说明

图1显示代表性的bh3分布测试分析(bh3profiling)数据。此图显示出高度预处理活化的细胞系和低度预处理活化的细胞系的模式差别。相对于mrl-11，mrl-14是为bim0.3,puma0.3和noxa而高度预处理活化的(经mta检测，与治疗用抑制剂活性相关联)。

图2显示代表性的治疗用抑制剂活性对传统生长抑制性ec50mts检测数据。

图3显示8种贴壁细胞系的bh3分布数据。有限标准差是对每个肽x细胞系4-6重复数据的。

图4显示9种悬浮细胞系的bh3分布数据。有限标准差是对每个肽x细胞系4-6重复数据的。

图5显示悬浮细胞系的bh3分布测试数据。bim和bim_puma模型和cdki活性有区别。

图6显示贴壁细胞系的bh3分布测试数据。bim,puma和noxa模型和cdki活性有区别。

图7显示mcl1-抑制剂ec50对活化百分比，悬浮细胞系,个别肽的关系。

图8显示mcl1-抑制剂ec50对活化百分比，悬浮细胞系，多肽-衍生的演算法。

图9显示mcl1-抑制剂ec50对活化百分比，贴壁细胞系，个别肽的关系。

图10显示mcl1-抑制剂对ec50对活化百分比，贴壁细胞系，多肽-衍生的演算法。

图11显示纺锤体驱动蛋白抑制剂(kspinh),mm,血癌细胞系。

图12a至12d显示bh3分布测试代表性患者数据。

图13a至13b显示阿糖胞苷-治疗过的aml患者点曲线和roc-曲线图示bim患者的反应区别。

图14显示阿糖胞苷-治疗过的aml患者的bh3分布测试，bh3肽在aml中无反应(nr)和完全反应(cr)患者。

图15显示阿糖胞苷-治疗过的aml患者的多变量分析roc-曲线。

图16a至16h显示bh3肽反应预测，其由细胞基因状态分层。

图17a至17e显示阿糖胞苷-治疗过的aml患者-bim(0.1)活化和bim(bcl2l11)蛋白水平和反应预测的相关性。

图18显示总生存率(os)和无变故生存率(efs，无病生存)对比三组bim(0.1)百分比活化的aml患者子组。

图19显示bh3分布测试矩阵的分区分析，个别bh3肽模型。

图20显示bh3分布测试矩阵的分区分析，加和bh3肽模型(二肽)。

图21显示bh3分布测试矩阵的分区分析，加和bh3肽模型(三/四肽)。

图22显示bh3分布测试矩阵的连续变量分析，个别bh3肽模型。

图23显示bh3分布测试矩阵的连续变量分析，加和bh3肽模型(二肽)。

图24显示bh3分布测试矩阵的连续变量分析，加和bh3肽模型(三/四肽)。

图25显示代表性的阿扎胞苷-治疗过的aml患者群的bh3分布测试表明使用了全面治疗规模的活化值。

图26显示bim+noxa在aml患者对阿扎胞苷的反应上是优越于单独的bim或noxa的差别。

图27显示收集的治疗用抑制剂反应和细胞系bh3分布测试。

图28显示支持数据总结-mcl1抑制剂。

图29显示阿糖胞苷-治疗过的aml患者的临床病理变量患者群。

图30显示阿糖胞苷-治疗过的aml患者。检验的bh3分布测试用生物标记物和区别反应的显著性。

图31显示阿扎胞苷在细胞系，分区，及连续变量模型中的药效之总结。

发明的详细说明

本发明一部分是建立在发现bh3分布测试分析法能够显著提高其在一定临床因素意义上所测量的敏感性和/或专一性。在此描述的诊断途径使一套bh3反应和临床指示物，包括那些对凋亡没有直接关系的，预测对人类恶性肿瘤的治疗效果。举例说，本发明者发现了，通过对患者根据bh3分布测试分析年龄分布及细胞基因状态作出级别分类，能够预测白血病患者对阿糖胞苷化疗和阿扎胞苷化疗的反应。

一方面本发明提供对癌症患者确定治疗癌症的方法，包含对患者的肿瘤或癌细胞取样作bh3分布定位；对患者的一种或几种临床因素定位；以及为患者对一种或几种癌治疗有临床反应的可能性作出级别分类；从中选择一种或多种临床因素，以提高bh3分布和临床反应相关性的专属性和敏感性。

另一方面，本发明为一个癌症患者的癌治疗定位提供一个方法，包含将患者的可渗透化的癌细胞和一个或多个bh3区域多肽相接触，由此定位事先处理活化程度；通过免疫历史化学法和/或荧光法原位杂化法(fish)，为患者的癌细胞的一个或多个临床因素的存在与否定位；为患者对一种或几种癌治疗有反应的可能性作出级别分类。

再一方面，本发明为确定一个aml患者对阿糖胞苷和/或阿扎胞苷的反应提供一个方法，包含:对患者的aml癌细胞取样作bh3分布定位；对患者的一种或几种临床因素定位，由此从年龄分布和/或细胞基因状态中选出一种或多种临床因素；为患者对一种或几种癌治疗有临床反应的可能性作出级别分类。

在以上方面的一些具体实施例中，所涉及的癌是血液癌，例如包括急性骨髓细胞白血病(aml)，多发性恶性骨髓肿瘤,滤泡性淋巴瘤,急性淋巴细胞白血病(all),慢性淋巴细胞白血病,和非霍奇金淋巴瘤(例如，套细胞淋巴瘤和弥漫性大b细胞淋巴瘤)。在一些具体实施例中，所涉及的癌是固体肿瘤例如包括非小细胞肺癌,卵巢癌和黑素瘤。

在一些具体实施例中，本发明预测癌症治疗效果包括一种或多种抗癌药，化疗，手术，辅助治疗(例如手术前)，以及新辅助治疗(例如手术后)。在另一具体实施例中，癌症治疗包含一种或多种bh3模拟物，表观基因修改剂，拓扑异构酶抑制剂，周期素依赖性激酶抑制剂，驱动蛋白纺锤体蛋白稳定剂。再一具体实施例中，癌症治疗包含蛋白酶体抑制剂；和/或细胞周期调控调节器(通过非限制的例子，周期素依赖性激酶抑制剂)；和/或细胞表观遗传机理调节器(通过非限制的例子，一个或多个组蛋白去乙酰化酶(hdac)(例如一个或多个伏立诺他(vorinostat)或恩替诺特(entinostat)),阿扎胞苷(azacytidine),地西他滨(decitabine)；一个或多个蒽环类药物(anthracycline),蒽醌类药物(anthracenedione)(通过非限制的例子，一个或多个表柔比星(epirubicin),阿霉素(doxorubicine),米托蒽醌(mitoxantrone),柔红霉素(daunorubicin),伊达比星(idarubicin)；和/或基于铂而来的治疗(通过非限制的例子，一个或多个卡铂，顺铂，奥沙利铂)；阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗；bh3模拟物(通过非限制的例子，一个或多个bcl2,bclxl,或mcl1)；和mcl1抑制剂。

在一些实施例中，本bh3分布测试分析法包含将患者的癌细胞可渗透化，将可渗透化的癌细胞和一个或多个bh3区域多肽相接触，然后确定或定量线粒体膜的电势变化。这些测量和在此所描述的临床因素一起，帮助辨别患者对多种治疗的反应。

在这些和其它实施例中，本bh3分布测试分析法包含应用一种肽,即bim,bim2a,bad,bid,hrk,puma,noxa,bmf,bik,和puma2a之一个或多个。在其一实施例中，所涉及的肽是以其溶液来应用的，浓度为0.1m到200m范围内多种浓度。在一实施例中，本bh3分布测试分析法包括使取样可渗透化，允许进入线粒体内。在这些和其它实施例中，本bh3分布测试分析法包括确定bh3分布谱，包含将患者的癌细胞取样和一个或多个bim相接触。

在一实施例中，取样是从冷冻肿瘤组织标本，培养的细胞，循环肿瘤细胞，和福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织标本(例如为基于抗体的bh3分布测试)中选出的活检取样。在另一实施例中，抽样样品是人的肿瘤衍生细胞系。在另一实施例中，抽样样品是癌干细胞。在另一实施例中，抽样样品是从固体肿瘤衍生来的(通过非限制的例子，一个或多个之结直肠肿瘤，乳腺肿瘤，前列腺肿瘤，肺肿瘤，胰腺肿瘤，肾肿瘤，或卵巢原发癌)。在另一实施例中，样品是来源于表皮膜的，包括例如表皮样品富集选自于有抗表皮细胞粘附分子(epcam)或其它固定在固体载体或粒珠上的表皮细胞粘附抗体的活检样品。在另一实施例中，样品是来源于间叶细胞的，包括例如间叶细胞样品富集选自于有神经细胞粘附分子(n-cam)或神经纤毛蛋白或其它固定在固体载体或粒珠上的间叶细胞粘附抗体的活检样品。在另一实施例中，样品是从非固体肿瘤活检衍生来的。在另一实施例中，样品是来源于如下患者活检:多发性骨髓瘤，急性骨髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病,套细胞淋巴瘤，和弥漫性大b细胞淋巴瘤，和非霍奇金淋巴瘤。在另一实施例中，样品是来源于多发性骨髓瘤细胞，其富集选自于有固定在固体载体或粒珠上的抗-cd138抗体的活检样品。在另一实施例中，癌细胞是急性髓细胞性白血病，其通过cd45-引导的抗体结合而富集。还有一实施例中，癌细胞是慢性淋巴细胞白血病或弥漫性大b细胞淋巴瘤，其通过非b细胞耗竭而富集。在另一实施例中，样品是取自于循环肿瘤细胞。

在各种实施例中，临床因素是年龄，细胞基因状态，患者表现，组织学类，性别，疾病阶段之一个或多个。在另一实施例中，本方法进而包含测量额外的生物标记物，其可选自于突变状态，单核苷酸多态性，稳态蛋白水平和动态蛋白水平。这样可进一步增加本测试法的专一性和敏感性。在另一实施例中，本方法进而包含预测患者的临床反应。在另一实施例中，临床反应至少是大约一年，大约二年，大约三年，或大约五年进步/无事件生存。

在一定实施例中，预处理活化是由以下方程定义：

其中auc包括曲线下的面积或信号强度；dmso(二甲基亚砜)包括基线阴性对照；和cccp(羰基氰化物间氯苯腙)包含蛋白合成有效因子，其作为在线粒体内质子梯度解偶联剂作用，质子梯度是在电子运输链中电子载体的正常活动中建立起来的。这作为基线阳性对照。在一些实施例中，曲线下面积是由均相时间分辨过的荧光(htrf)确立的。在一些实施例中，出现从约0到约300分钟至约0到约30分钟之间的时间窗口。在一些实施例中，曲线下面积是由荧光激活细胞分选(facs)确立。在一些实施例中，信号强度是约5到约300分钟内的单一次测量。

在另一实施例中，本方法包含实施bh3分布测试分析法和一个或多个细胞表面标记物cd33,细胞表面标记物cd34,flt3突变状态,p53突变状态，mek-1激酶的磷酸化状态，以及bcl-2的70位丝氨酸磷酸化；和找出aml患者对阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷治疗效果的相关性。

在另一实施例中，本方法包含实施bh3分布测试分析法和一个或多个细胞表面标记物cd33,细胞表面标记物cd34,flt3突变状态,p53突变状态，mek-1激酶的磷酸化状态，以及bcl-2的70位丝氨酸磷酸化；和mm患者对化疗效果相关性。

在一些实施例中，癌是aml和/或mm和临床因素是年龄段谱和/或细胞基因状态；或者癌是aml和/或mm和癌治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷治；或者癌治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷治和临床因素是年龄段谱和/或细胞基因状态；或者癌治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷治；或者癌是aml和/或mm；或者临床因素是年龄分布和/或细胞基因状态。

示范性的临床决策例子

在一些实施例中，在此描述的方法是有用于评估患者，例如评估诊断，预后，及对治疗的反应。从多方面看，本发明包含评估肿瘤或血液方面的癌。在多方面实施例中，评估可从诊断，预后，和对治疗的反应中选择。

诊断指的是决策或识别疾病或失调例如癌症的尝试过程。预后指的是预测疾病或失调例如癌症的可能的结局。一个完全的预后经常包括预料的期间，功能，和对疾病过程的描述，诸如逐渐下降，间歇性的危机，或突然无法预测的危机。对治疗的反应可以是，通过非限制的例子，病理上的完全反应，生存率，和无肿瘤进展生存率，肿瘤进展时间，复发的概率。

在各种实施例中，本发明方法指导关于一个患者是否应得到一具体的治疗作出临床决策。在一个实施例中，本方法对新辅助化疗和/或辅助化疗的阳性反应或无反应具有预测性。在一个实施例中，本方法对促凋亡剂或通过凋亡操作的试剂和/或不通过凋亡操作的试剂的阳性反应，或者对凋亡有效因子和/或不通过凋亡操作的试剂的无反应具有预测性。在各种实施例中，本发明指导对一个癌症患者的治疗，包括例如应执行哪种治疗或不应执行哪种治疗。

在一实施例中,本发明方法指导关于一个患者受到首要的，主要的或最初的包括不受局限的单一辅助化疗之后，是否应得到辅助化疗的临床决策。辅助疗法也叫辅助治疗服务是首要的，主要的或最初的治疗之后的补充治疗服务。通过非限制的例子，辅助化疗法可以是手术除去所有可测到的疾病(肿瘤)之后通常给予的补充治疗，因为手术之后仍然有统计上的隐匿性疾病复发的危险。

在一些实施例中,本方法指导一个患者的治疗计入辅助化疗。例如一患者对一种具体治疗打分会有反应，就可以得到此治疗为辅助治疗。进而本方法也许指导辅助化疗法身份，通过非限制的例子，作为一个引发和/或促凋亡方式或反之的治疗法。在一实施例中,本方法可能表明一个患者对一种具体治疗将会没有反应或少发应，那么这种患者可以不接受此种治疗作为辅助治疗。相应地，在一些实施例中,本方法根据患者的可能的反应提供或不用辅助治疗。以这样方式，提高患者的生活质量和护理成本。

在各种实施例中，本方法指导关于一个患者是否应得到新辅助治疗法，即手术前使肿瘤缩小和/或降级的疗法，作出临床决策。在一些实施例中，新辅助治疗意指手术前对癌患者执行的化疗。在一些实施例中，新辅助治疗意指手术前对癌患者施用的包括在此文描述的药剂。一般认为可施用新辅助治疗法的癌种类包括例如乳腺癌，结直肠癌，卵巢癌，子宫颈癌，膀胱癌，和肺癌。

在一些实施例中,本方法指导一个患者的治疗计入新辅助治疗法。例如一患者对一种具体治疗打分会有反应，就可以得到此治疗为新辅助治疗。进而本方法也许指导新辅助化疗法身份，通过非限制的例子，作为一个引发和/或促凋亡方式或反之的治疗法。在一实施例中,本方法可能表明一个患者对一种具体治疗将会没有反应或少发应，那么这种患者可以不接受此种治疗作为新辅助治疗。相应地，在一些实施例中,本方法根据患者的可能的反应提供或不用新辅助治疗。以这样方式，提高患者的生活质量和护理成本。

在一些实施例中，本方法指导关于一个患者是否应得到一种具体的治疗作出临床决策。相应地，在一个实施例中，本方法是治疗患者的指导性测试法。

在一些实施例中，本方法为一患者对某一个别治疗的可能的反应提供情报。在一些实施例中，本方法提供患者反应的高可能性，也许可指导治疗包括侵略性治疗。在一些实施例中，本方法提供患者反应的低可能性，也许可指导中断治疗包括侵略性的治疗，以及改用姑息治疗法，以避免无效化疗引起的不必要的毒性，以为更好的生活质量。

在一个示范性的实施例中，本方法将预示对某一个具体治疗的反映的可能性。例如，在一些实施例中，本方法预示对促凋亡剂，和/或通过凋亡运作的试剂，和/或通过直接的蛋白调控驱动的凋亡而运作的试剂反应的高或低可能性。在各种实施例中，典范性的促凋亡剂，和/或通过凋亡运作的试剂，和/或通过直接的蛋白调控驱动的凋亡而运作的试剂包括abt-263(navitoclax),obatoclax,web,bortezomib(硼替佐米),和carfilzomib。在一些实施例中，本方法预示对不通过凋亡运作的试剂，和/或不通过直接的蛋白调控驱动的凋亡而运作的试剂反应的高或低可能性。在各种实施例中，典型的不通过凋亡运作的试剂包括驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，三氧化二砷(trisenox)，mek抑制剂，pomolidomide,阿扎胞苷,decitibine,伏立诺他,恩替诺特,dinaciclib,吉姆单抗,btk抑制剂,pi3激酶δ抑制剂,来拉度胺(lenolidimide),蒽环类药物(anthracyclines),阿糖胞苷(cytarabine),美法仑(melphalam),aky抑制剂,mtor抑制剂。

在一个示范性的实施例中，本方法将预示一个患者是否应得到一种促凋亡剂或通过凋亡运作的试剂作为癌治疗。在另一个示范性的实施例中，本方法将预示一个患者是否应得到一种不通过凋亡运作的试剂作为癌治疗。

在一具体实施例中，本方法有用于预测一个癌患者对在此描述的任何一个治疗法(包括试剂)的反应。在一个示范性的实施例中，本方明预示一个aml患者对阿糖胞苷和阿扎胞苷治疗的反应的可能性，包含评价对患者的bh3分布谱，年龄分布和细胞基因因素。

在各种实施例中，一种癌治疗方法施用或扣留不用是基于在此描述的方法。示范性的治疗包括手术切除术，放射疗法(包括结合使用在此描述的化合物，或作放射敏感剂结合使用)，化疗，药效动力学疗法，靶向疗法，免疫疗法，扶持性疗法(例如，止痛剂，医利尿剂，抗利尿剂，抗病毒药物，抗生素，营养补充剂，贫血的治疗，血液凝固疗法，骨疗法，以及精神病治疗学和心理疗法。

示范性的治疗例子

在示范实施例中，本发明选择一个治疗法。治疗法的举例包括，但不局限于，一种或多种抗癌药，化疗，手术，辅助疗法，和新辅助疗法。在一实施例中，癌症治疗是个种或多个bh3模拟物，表观基因修改剂，拓扑异构酶抑制剂，周期素依赖性激酶抑制剂，驱动蛋白纺锤体蛋白稳定剂。再一实施例中，癌症治疗是蛋白酶体抑制剂；和/或细胞周期调控调节器(通过非限制的例子，周期素依赖性激酶抑制剂)；和/或细胞表观遗传机理调节器(通过非限制的例子，一个或多个组蛋白去乙酰化酶(hdac)(例如一个或多个伏立诺他或恩替诺特),阿扎胞苷,地西他滨；和/或一个或多个蒽环类药物,蒽醌类药物(通过非限制的例子，一个或多个表柔比星，阿霉素，米托蒽醌，柔红霉素，伊达比星；和/或基于铂的治疗(通过非限制的例子，一个或多个卡铂，顺铂，奥沙利铂)；阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗；bh3模拟物(通过非限制的例子，一个或多个bcl2,bclxl,或mcl1)；和mcl1抑制剂。

在多方面的实施例中，本发明无限制地适用于癌症治疗,包括美国专利公报号us2012-0225851和国际专利公报号wo2012/122370中的内容,其内容在此通过引用均以其整体纳入本文。

在各种实施例中,本发明无限制地适用于癌症治疗,包括一种或多种烷化剂，诸如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(cytoxancyclosphosphamide)；烷基磺酸盐(alkylsulfonates)诸如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan),哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷类(aziridines)诸如苯佐替派(benzodopa),卡波醌(carboquone),关妥替哌(meturedopa),乌瑞替哌(uredopa)；乙基亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide),三亚乙基硫代磷(triethiylenethiophosphoramide),三曱基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins),诸如bullatacin,bullatacinone；喜树碱(camptothecin)包括其合成类似物托泊替康(topotecan)；苔藓虫素(bryostatin)；callystatin；cc-1065包括阿多来新(adozelesin),卡折来新(carzelesin),比折来新(bizelesin)合成类似物；缩酚肽类(cryptophycins),如cryptophycin1和cryptophycin8；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)包括合成类似物kw-2189和cb1-tm1；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；asarcodictyin；spongistatin；氮芥类(nitrogenmustards)诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil),萘氮芥(chlornaphazine),环磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),异环磷酰胺(ifosfamide),二氯甲基二乙胺(mechlorethamine),氧化盐酸氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride),美法仑(melphalan),(novembichine),苯芥胆甾醇(phenesterine),松龙苯芥(prednimustine),氯乙环磷酰胺(trofosfamide),尿嘧啶氮芥(uracilmstard)；亚硝基脲(nitrosureas)例如卡莫司汀(carmustine),chlorozotocin,福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),和ranimnustine；抗生素例如烯二炔类抗生素(enediyneantibiotics),卡奇霉素(calicheamicin),(尤其是calicheamicingammall和calicheamicinomegall，见,例如,agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186(1994))；dynemicin,dynemicina；双膦酸盐(bisphosphonates),例如氯膦酸盐(clodronate)；esperamicin；新制癌菌素发色(neocarzinostatinchromophore)和(相关的chromoproteinenediyneantiobioticchromophores),aclacinomysins,放线菌素(actinomycin),authramycin,重氮丝氨酸到(azaserine),博来霉素(bleomycins),cactinomycin,carabicin,caminomycin,carzinophilin,chromomycinis,放线菌素d(dactinomycin),柔红霉素(daunorubicin),detorubicin,6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-l-norleucine),阿霉素(adriamycin)多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代多柔比星(morpholino-doxorubicin),cyanomorpholino-doxorubicin,2-pyrrolino-doxorubicin和脱氧阿霉素(deoxydoxorubicin),表柔比星(epirubicin),esorubicin,伊达比星(idarubicin),marcellomycin,丝裂霉素(mitomycins)诸如丝裂霉素c(mitomycinc),霉酚酸(mycophenolicacid),nogalamycin,olivomycins,peplomycin,potfiromycin,嘌呤霉素(puromycin),quelamycin,rodorubicin,链黑菌素(streptonigrin),链脲佐菌素(streptozocin),结核菌素(tubercidin),乌苯美司(ubenimex),zinostatin,zorubicin；抗代谢物(anti-metabolites)诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil(5-fu))；叶酸类似物(folicacidanalogues)例如denopterin,甲氨蝶呤(methotrexate),呤(pteropterin),三甲(trimetrexate)；嘌呤类似物(purineanalogs)诸如氟达拉滨(fludarabine),6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine),thiamiprine,硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物(pyrimidineanalogs)诸如安西他滨(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-azauridine,卡莫(carmofur),阿糖胞苷(cytarabine),dideoxyuridine,去氧氟尿苷(doxifluridine),依诺他滨(enocitabine),氟尿苷(floxuridine)；雄激素(androgens)诸如calusterone,dromostanolonepropionate,环硫雄醇(epitiostanol),mepitiostane,睾内酯(testolactone)；抗肾上腺(anti-adrenals)诸如米托坦(minoglutethimide,mitotane),曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂(folicacidreplenisher)例如frolinicacid；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；蒽双咪腙(bisantrene)；edatraxate；demecolcine；diaziquone；elformithine；elliptiniumacetate；埃博霉素(epothilone)；etoglucid；硝酸镓(galliumnitrate)；羟基脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；lonidainine；美登素(maytansinoids)例如美登素(maytansine)和ansamitocins；mitoguazone；米托蒽醌(mitoxantrone)；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；phenamet；吡柔比星(pirarubicin)；洛索(losoxantrone)；podophyllinicacid；2-ethylhydrazide；甲基苄肼(procarbazine)；psk多糖复合物(jhsnaturalproducts,eugene,oreg.)(psk多糖复合物)；razoxane；根瘤菌素(rhizoxin)；sizofuran；螺环锗(spirogermanium)；tenuazonicacid；triaziquone；2,2',2"-trichlorotriethylamine；单端孢(trichothecenes)(e.g.,t-2毒素(t-2toxin),verracurina,roridina和anguidine)；乌拉坦(urethane)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；mitobronitol；mitolactol；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“ara-c”)(arabinoside)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷类(toxoids),紫杉醇(taxol)paclitaxel(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.),abraxanecremophor-free,白蛋白工程(albumin-engineered)纳米颗粒制剂(nanoparticleformulation)ofpaclitaxel(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,111.),和taxoteredoxetaxel(rhone-poulencrorer,antony,france)；chloranbucil；吉西他滨gemzar(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物(platinumanalogs)诸如顺铂(cisplatin),奥沙利铂(oxaliplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂金(platinum)；依托泊苷(vp-16)(etoposide)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；诺维(navelbine).长春瑞滨(vinorelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸钠(ibandronate)；伊立替康(irinotecan(camptosar,cpt-11))(includingthetreatmentregimenofirinotecanwith5-fuand亚叶酸钙(leucovorin))；拓扑异构酶抑制剂(topoisomeraseinhibitor)rfs2000；二氟(difluoromethylornithine)(dmfo)；维甲酸(retinoids)诸如维甲酸(retinoicacid)；卡培他滨(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；亚叶酸钙(leucovorin)(lv)；奥沙利铂(oxaliplatin),包括奥沙利铂(oxaliplatin)治疗方案(folfox)；拉帕替尼(lapatinib)(tykerb)；pkc-α,raf,h-ras,egfr的抑制剂(例如.,厄洛替尼(erlotinib)(tarceva))和降低细胞再生vegf-a,dacogen,万珂(velcade),和药学上可接受的盐，以及上述任何酸或其衍生物。

典型的检测方法

在各种实施例中，本方法包含评价一蛋白和/或核酸的存在与否或水平。在各种实施例中，本方法包含评价一蛋白和/或核酸的存在与否或水平，因其能增强bh3分布测试分析法的专一性和灵敏度。在一些实施例中，针对患者反应的标记物作出评价。在一些实施例中，本方法包含测量用一个或多个免疫组织化学染色法，western蛋白质印迹法；细胞内western,免疫荧光染色法，elisa,和荧光激活细胞分选法(facs),或在任何此描述的其它方法或在本领域已知的方法。本发明方法也许包含＝括接触一抗体和肿瘤标本(例如活检或组织或体液)以确定其组织或体液所特有的而且表明是癌症状态的抗原决定基。

总体上有两种策略用于检测体液或组织里的抗原决定基，直接方法和间接方法。直接方法是一步染色法，可能涉及标记了的抗体(例如fitc偶连的抗血清)与体液或组织样本里的抗原直接反应。间接方法包含没有标记的初级抗体与体液或组织抗原反应，标记了的二级抗体与初级抗体反应。标记物可以包括放射标记物，荧光标记物，半抗原标记物例如生物素，或酶例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。这些分析的操作方法在已知的技术领域里是众所周知的。请见如harlow等著(antobodies,coldspringharborlaboratory,ny,1988),harlow等著(usingantobodies,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,ny,1999),virella著(medicalimmunology,6thedition,informahealthcare,newyork,2007),和diamandis等著(immunoassays,academicpress,inc.,newyork,1996)。操作这些分析的成套检测试剂盒能从例如美国加州clontechlaboratories，llc公司购得。

在各种实施例中，抗体包括整个抗体和/或任何与抗原结合的片段(例如抗原结合的部分)和/或这些抗体的单一链(例如至少由两个重(h)链和两个轻(l)链由二硫键互联而组成的抗体,fab片段,由vl,vh,cl,和ch1区域组成的单价片段；f(ab)2片段,包括两个fab片段由二硫桥联结其铰链区的二价片段；fd片段由vh和ch1区域组成；fv片段由抗体单臂的vl和vh区域组成；和类似的)。在各种实施例中，多克隆抗体和单克隆抗体是有用的，就象分离的人类抗体或人源化抗体，或其功能性片段。

评估抗体向其各种物种目标结合能力的标准分析法在已知的技术领域里是众所周知的，包括例如elisas,western蛋白质印迹法和iras。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也能用已知的领域里的标准分析法评定，例如biacore分析法。

在另一实施例中，测量包含评估核酸的存在与否，或水平。在本领域里技术熟练人将鉴别能用于检测或定量适当生物标记物的dna/rna水平的几种分析法。

基因表达能用例如低到中等复杂的技术测量，包括但不限制于报告基因检测，northern印迹法,荧光原位杂交(fish),和逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)。基因表达还能用例如更高等复杂的技术测量，包括但不限制于基因表达系列分析(sage),dna微阵列，平铺阵列，rna序列/全转录组鸟枪法测序(wtss),高通量测序,多重pcr,多重连接探针扩增(mlpa),dna测序结扎,luminex/xmap技术。在本领域里技术熟练人将鉴别能用于检测或定量样品内的生物标记物rna产品水平的几种分析法，包括阵列，诸如微阵列，rt-pcr(包括定量pcr)，核酸酶保护试验，northern印迹分析。

典型的癌和患者

在一些实施例中，本发明提供决策癌治疗的一个方法和/或包含患者的肿瘤或癌细胞标本。癌或肿瘤是指细胞无控制生长，和/或异常提高的细胞存活率，和/或抑制凋亡而干扰身体器官或系统的正常功能。有癌或肿瘤的对象是其身体内存在具有客观可测量的癌细胞的对象。本发明中包含的有是良性和恶性癌，以及潜伏的肿瘤或微转移。从原发位置转移且种植于重要器官的癌终究会因其受感染器官的功能衰歇导致死亡。

在各种实施例中，本发明应用于转移前癌，或转移性癌。转移是指癌从原发部位扩散到身体内的其它地方。癌细胞能从原发肿瘤突破而出，穿透进入到淋巴管内和血管里，随血流循环，然后生长在体内远地中心点其它正常组织(即转移metastasize)。转移可以是当地域或远地点。转移是一个顺次过程，依肿瘤细胞情况而定，从原发肿瘤脱离，随血流移动，然后在远地点停下。在新地点，癌细胞建立血液供应，然后能生长到威胁生命的大物质块。肿瘤细胞内的刺激性分子途径和抑制性分子途径调控这个行为，而且肿瘤细胞和远地点宿主细胞间的互相影响也是重要的。癌转移检测是除了通过追踪监测特别的症状以外，经常是还通过单一或公用磁共振成像(mri)扫描，计算机断层扫描(ct)，血细胞计数和血小板计数，肝功能研究，胸x-光,骨扫描而作到的。

在此描述的方法是针对癌症的欲知，癌症的诊断，癌症的治疗，和/或恶性肿瘤的诊断，欲知，治疗，预防或改善其生长，发展，和/或转移,和与提高的细胞存活或凋亡抑制相关的增生性疾病。在一些实施例中，癌是血液癌，包括但无限制的急性骨髓细胞白血病(aml)，多发性恶性骨髓肿瘤,滤泡性淋巴瘤,急性淋巴细胞白血病(all),慢性淋巴细胞白血病,和非霍奇金淋巴瘤包括但无限制的套细胞淋巴瘤和弥漫性大b细胞淋巴瘤。在一些实施例中，癌是固体肿瘤包括但无限制的非小细胞肺癌,卵巢癌和黑素瘤。

在一些实施例中,本发明与一个或多个以下癌相关的：急性淋巴细胞白血病(all),急性骨髓细胞白血病(aml)，肾上腺皮质癌，aids-相关癌，肛门癌，阑尾肿瘤，星形细胞瘤(例如儿童小脑和大脑的),基底细胞癌,胆管癌,膀胱癌,骨肿瘤(例如骨肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤),脑干胶质瘤,脑癌,脑肿瘤(例如小脑星形细胞瘤,脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤,室管膜瘤,髓母细胞瘤,幕上原始神经外胚层肿瘤,视觉通路和下丘脑胶质瘤),乳腺癌，支气管腺瘤/类癌,伯基特淋巴瘤(burkitt'slymphoma),类癌瘤,中枢神经系统淋巴瘤,小脑星形细胞瘤,子宫颈癌,慢性淋巴细胞性白血病(cll),慢性粒细胞白血病(cml),慢性骨髓增殖性疾病,结肠癌,皮肤t细胞淋巴瘤,促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤,子宫内膜癌,室管膜瘤,食管癌,尤因氏肉瘤(ewing'ssarcoma),颅外恶性生殖细胞肿瘤,性腺外生殖细胞肿瘤,肝外胆管癌,眼部肿瘤,胆囊癌,胃癌,胃肠道间质瘤(gist),生殖细胞肿瘤(例如颅外的,性腺外的,卵巢的),妊娠滋养细胞肿瘤,胶质瘤(例如脑干,脑星形细胞瘤,视觉通路和下丘脑),胃类癌,头颈部癌症,心脏癌,肝细胞癌,下咽癌,下丘脑和视神经胶质瘤,眼内黑色素瘤,胰岛细胞癌(内分泌胰腺),肾癌(肾细胞癌),喉癌,白血病(例如急性淋巴细胞白血病,急性骨髓细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病,慢性骨髓白血病,毛细胞),唇口腔癌,脂肪肉瘤,肝癌,肺癌(例如非小细胞,小细胞),淋巴瘤(例如aids-相关的，伯基特burkitt,皮肤t细胞霍奇金,非霍奇金,原发性中枢神经系统),髓母细胞瘤,黑色素瘤,默克尔细胞癌(merkelcellcarcinoma),间皮瘤,转移性鳞状宫颈癌,口腔癌,多发性内分泌肿瘤综合征,多发性骨髓瘤,蕈样肉芽肿,骨髓增生异常综合征,骨髓增生异常/骨髓增生性疾病,髓细胞白血病,类髓细胞白血病,骨髓增生性疾病,慢性的，鼻腔的和副鼻窦癌,鼻咽癌,神经母细胞瘤,非霍奇金淋巴瘤,非小细胞肺癌，口腔癌，口咽癌,骨肉瘤,卵巢癌,胰腺癌,鼻窦和鼻腔癌,甲状旁腺癌,阴茎癌,咽癌,嗜铬细胞瘤,松果体瘤,和/或生殖细胞瘤,松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤,垂体腺瘤,浆细胞瘤/多发性骨髓瘤,胸膜肺母细胞瘤,原发性中枢神经系统淋巴瘤,前列腺癌,直肠癌,肾细胞癌(肾癌),肾盂和输尿管,视网膜母细胞瘤,横纹肌肉瘤,唾液腺癌,恶性毒瘤(例如尤文家族的ewingfamily,卡波西氏的kaposi,软组织的,子宫的),塞扎里综合征sezarysyndrome,皮肤癌(例如非黑色素瘤,黑色素瘤,默克尔细胞),小细胞肺癌,小肠癌,软组织肉瘤,鳞状细胞癌,鳞状宫颈癌,胃癌,幕上原始神经外胚层肿瘤,t细胞淋巴瘤,睾丸癌,喉癌,胸腺瘤和胸腺癌,甲状腺癌,滋养细胞肿瘤,肾盂输尿管癌,尿道癌,子宫癌,子宫肉瘤,阴道癌,视觉通路和下丘脑胶质瘤,外阴癌,waldensrom巨球蛋白血症,和肾母细胞瘤。

在一实施例中,癌是aml。aml是第二最常见的血癌，在美国每年诊断出大约13,000新病例，大约9,000人死亡。虽然存在被认可的治疗，许多血癌患者的预后是低劣的，成功治疗的可能性是低的。现行的aml标准治疗是诱发阿糖胞苷(ara-c)与蒽环类抗生素(例如柔红霉素(daunarubicin),去甲氧基柔红霉素(idarubicin),或米托蒽醌(mitoxantrone))的联合治疗。这个治疗方案之后通常后续施用高剂量阿糖胞苷(cytarabine)和/或干细胞移植。这些治疗提高了年轻患者的结果。在治疗急性早幼粒细胞白血病方面也取得了进步，用全反式维甲酸(atra)或砒霜靶向治疗取得了优异的生存率。但是代表大多数aml病例的60岁以上患者人群仍然是难以理解的。虽然65-85％的患者开始对现行的治疗有反应,65％反应者经历复发，许多患者还是无奈死亡。就因为至少这个原因和前述的治疗法也许有严重的副作用，有创造力的预测性测试能指导治疗法的应用以减轻这些诉讼。在一些实施例中,本发明通过应对的患者和应对的治疗相匹配，提高成功治疗的可能性。况且当前没有能预测aml患者对治疗反应的测试。

在此引用的术语实验材料或实验主题(subject),除非另外定义,是指哺乳动物，例如人类，老鼠，大老鼠，仓鼠，豚鼠，狗，猫，马，牛，羊，山羊，猪，或非人类灵长类动物诸如猴，黑猩猩，狒狒。两术语实验主题(subject)和患者(patient)是互换使用的。

典型的标本样品

在一些实施例中，本发明包括测量肿瘤标本，包括活检或手术标本样品。在一些实施例中，标本是从冷冻肿瘤组织标本，培养的细胞，循环肿瘤细胞，和福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织标本(例如为进行基于抗体的bh3分布测试分析)选择。在一些实施例中，活检是人的活检。在各种实施例中,活检是冻肿瘤组织标本，培养的细胞，循环肿瘤细胞，和福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织标本(例如为进行基于抗体的bh3分布测试分析)中的任何一个。

在一些实施例中，肿瘤标本可以是以活检样品，例如冷冻肿瘤组织(冰冻切片)标本。如已知于本领域，冰冻切片可利用低温恒温器，即装有显微镜用薄片切片机的冰箱。手术标本样品放置于一金属组织圆盘上，然后用卡盘夹紧，然后速冻至约-20℃至-30℃。标本是包埋于例如由聚乙二醇和聚乙烯醇组成的象凝胶的媒介。冷冻组织是用低温恒温器中的冰冻切片机在冷冻状态下切片，然后切片随意地捡起放在玻璃片上染色。

在一些实施例中，肿瘤标本是活检样品例如培养的细胞。这些细胞可用本领域已知的通常细胞培养技术处理。这些细胞可以是循环肿瘤细胞。

在一些实施例中，肿瘤标本是活检样品例如福尔马林固定的石蜡包埋的(ffpe)肿瘤组织标本。如本领域已知，活检样品可放在福尔马林或其它液体中以防腐保存。组织样品可放进热石蜡模子里。石蜡冷却成固体块保护组织。这个包埋组织的石蜡块放在切片机上切成很薄的组织切片。

在某些实施例中,肿瘤标本(或活检)含有少于100mg的组织，或在某些实施例中,含有大约50mg的组织或更少。肿瘤标本(或活检)可含有大约20mg到大约50mg的组织，例如大约35mg的组织。

组织可以例如以一次或多此(例如1,2,3,4,或5次)针取的活检(例如用14-号针或其他适当尺寸针)获取。在某些实施例中,活检是细针抽吸(穿刺)活检，即把一细长针插入被怀疑区域，用针筒吸出流体和细胞作分析用。在某些实施例中,活检是针芯活检，即用具有可切割用尖头的大针从被怀疑区域吸出一束组织。在某些实施例中,活检是真空负压细针穿刺活检，即真空负压装置提高用针抽取的流体和细胞含量。在某些实施例中,活检是影像引导活检,即针吸活检与成像程序结合，诸如x-光，计算机操控断层扫描(ct)，磁共振成像(mri)或超声。在其它实施例中,样品可以获取通过一装置例如mammotome活检系统即激光引导的真空负压细针穿刺活检系统获取乳腺活检。

在某些实施例中,标本是人类肿瘤衍生来的细胞系。在某些实施例中，标本是癌干细胞。在其它实施例中,标本是从固体肿瘤活检衍生而来的，例如大肠的，乳腺的，前列腺的，肺的，胰腺的，肾的，或卵巢原发肿瘤。

在某些实施例中,标本是来源于表皮膜的。在有些实施例中,表皮样品是富集选自于含有抗表皮细胞粘附分子(epcam)或其它固定在固体载体或粒珠上的能与表皮细胞结合的抗体的活检样品。

在某些实施例中,标本是来源于间叶细胞的。在有些实施例中,间充质标本是富集选自于含有神经细胞粘附分子(n-cam)或神经纤毛蛋白或其它固定在固体载体或粒珠上的能与间叶细胞结合的抗体的活检样品。

在某些实施例中,标本是从非固体肿瘤活检衍生来的,例如在此描述的任何一个癌。在具体实施例中,标本是来源于如下患者的活检:多发性骨髓瘤，急性骨髓细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病,套细胞淋巴瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤，和非霍奇金淋巴瘤。在一具体实施例中，标本是多发性骨髓瘤细胞，其富集选自于含有固定在固体载体或粒珠上的抗-cd138抗体的活检。在一具体实施例中，标本是急性髓细胞性白血病癌细胞，其通过与cd45-引导的抗体结合而富集。在一具体实施例中，标本是慢性淋巴细胞白血病或弥漫性大b细胞淋巴癌细胞，其通过非b细胞耗竭而富集。

在一些实施例中，标本是衍生于一循环肿瘤细胞。

bh3分布测试分析法

在各种实施例中,本发明包含bh3分布测试分析法。在各种实施例中,本发明包含bh3分布测试分析法，即至少对二个，或三个，或四个，或五个，或六个，或七个，或八个，或九个，或十个肽同时评价。在一些实施例中,相反于对单一个肽的评价，本方法包含多肽分析。在一些实施例中,针对一个患者标本作一套bh3肽的面板进行筛选分析。

在一些实施例中,bh3分布测试分析包含应用bim,bim2a,bad,bid,hrk,puma,noxa,bmf,bik,和puma2a中的一个肽。在一些实施例中,bh3分布测试分析包含应用一个抗体对抗如下之一个或多个蛋白体：bim,bim2a,bad,bid,hrk,puma,noxa,bmf,bik,和puma2a以及由两个bcl-2蛋白形成的天然异源二聚体；例如第一个bcl-2蛋白(例如bim,bid,bad,puma,noxa,bak,hrk,bax,或mule)和第二个bcl-2蛋白(例如mcl-1,bcl-2,bcl-xl,bfl-1，或bcl-w),其如描述于美国专利号8,168,755,其内容通过引用均以其整体纳入本文。在一些实施例中,bh3分布测试分析包含应用一个装订肽(例如一个通过合成增强3d-α-螺旋蛋白分段碳氢键而生成的肽，使得蛋白更刚硬和能够穿透细胞膜)，例如象verdine等描述于"装订肽作为细胞内的药靶"(verdine,etal.“stapledpeptidesforintracellulardrugtargets”methodsinenzymology,volume503(chap.1),其内容以引用文献均以其整体纳入本文。

在一实施例中,所用肽的浓度是大约0.1到大约200μm。在一些实施例中,所用肽浓度是大约0.1到大约150，或大约0.1到大约100，或大约0.1到大约50，或大约0.1到大约10，或大约0.1到大约5，大约1到大约150，或大约1到大约100，或大约1到大约50，或大约1到大约10，或大约1到大约5μm，或大约10到大约100μm。在一些实施例中,所用肽浓度是大约0.1，或大约0.5，或大约1.0，或大约5，或大约10，或大约50，或大约100，或大约150，或大约200μm。在一实施例中,bh3分布测试分析包含渗透化处理标本样品。

bh3分布测试分析法和应用于这样的方法的试剂描述于美国专利号7,868,133；8,221,966；和8,168,755和美国专利公告号2011/0130309,其内容在此通过引用均以其整体纳入本文。

不希望受理论约束地简单地说，作为异常的表型结果，癌细胞作为异常的表型结果在其凋亡通路发展阻塞障碍。这种阻塞障碍使癌细胞既对有的治疗有抵抗力，又意外地使有些癌细胞对其他治疗敏感。“癌基因依赖成瘾”概念描述癌细胞对特殊的蛋白获得依赖性或者依赖成瘾才生存的现象。bh3分布测试分析法确定在指定的癌细胞中是否发生对一定的凋亡调控蛋白的这样的依赖性，进而辨别这样的依赖蛋白。癌细胞能够但不总是预先决定要经历凋亡，这取决于这些细胞对某一个或所有的抗凋亡bcl-2族蛋白的依赖性才能意外的生存，反之不能生存。这为癌细胞对治疗有反应的可能性提供洞察力。

不希望受理论约束地说，癌细胞呈现反常现象，诸如dna损伤，基因不稳定性，不正常的生长因子信号转导，异常或丢失的基质的相互作用，任何一个通常都应该引起内在(线粒体)的细胞凋亡通路的凋亡。但是，癌细胞与其响应这些凋亡信号反而生存。通常这样做的结果，这些细胞变得高度依赖于选定的慢性凋亡信号阻塞物。这个适应性的改变为癌细胞提供生存机制；但是这些适应也能使癌细胞易受到特殊引发凋亡的治疗。致使癌细胞死于内在凋亡的一关键事变是使线粒体外膜渗透化(momp)，从而释放激活效应半胱天冬酶的分子。在很多情况下，线粒体外膜渗透化(momp)是内在凋亡途径的不归路。bcl-2族蛋白是关键调控因子，其活性与淋巴结癌和多个固态肿瘤癌的开始发病有联系，还被认为在许多癌中是关键化疗抗药的调解因子。

bcl-2族蛋白是通过促存活(抗凋亡)和促凋亡成员间的明确的蛋白质-蛋白质相互作用而调节的。这些相互作用主要通过bh3(bcl-2同源结构域-3)调解的结合而发生的。细胞凋亡的启动信号转导大多发生在线粒体的上游，引起短的，bh3-仅有的，bcl-2族成员的易位迁移到线粒体内，在那里它们激活或者敏化momp。bh3-仅有激活者蛋白bim和bid，结合到而且直接激活效应感受器即促凋亡蛋白bax和bak，还结合到而且抑制抗凋亡bcl-2族蛋白，bcl-2,mcl-1,bfl-1,bcl-wandbcl-xl。敏化者bh3蛋白bad,bik,noxa,hrk,bmf和puma,只结合到抗凋亡bcl-2族蛋白，bcl-2,mcl-1,bfl-1,bcl-w和bcl-xl,阻止其抗凋亡功能。不希望受理论约束地说，每个敏化者蛋白都具有其独特的特异性轮廓。例如noxa(a和b)与mcl-1高亲和力结合,bad与bcl-xl及bcl-2结合，但与mcl-1仅弱结合，puma与其所有三个目标好结合。这些蛋白的抗凋亡功能是隔绝激活者bh3蛋白bim和bid。用敏化者肽取代这些激活者蛋白导致bax/bak-调节的凋亡义务。这些相互作用可有多种结局，非限制地包括动态静止，细胞死亡，敏化凋亡，和封锁凋亡。

凋亡信号传导受阻的凋亡癌细胞的定义性特征是bh3-仅有的激活者蛋白在线粒体的表面积累，这是这些蛋白质被抗凋亡蛋白隔离的结果。这种积累及其接近它们的效应感受靶蛋白是“bh3活化”了的状态的bcl-2族蛋白的拮抗作用敏感性增加的原因。

在一些实施例中,一种细胞对noxa(a和b)产生一个高的凋亡反应是mcl-1活化的，而对bad肽产生一个高的凋亡反应表明bcl-xl或bcl-2提供凋亡阻止。在一些实施例中,puma反映pan-bcl-2族活化。以这种方式，依赖于mcl-1或bcl-xl或两者或几个bcl-2族成员的细胞是很容易区分开的，从而可以相应地特别定制适当的治疗。线粒体对这些肽反应的区别，指导如下治疗方法的应用：即那些已知是通过集中到mcl-1或bcl-xl影响的内在信号传导通路而工作的治疗方法。应用抑制bcl-2或抑制mcl-1的化合物可能表明这种情况。在一些实施例中,本发明的方法也表明或禁忌把mcl-1或bcl-xl上游的实体作为攻击目标的治疗法。

bh3分布测试分析法辨认癌细胞是何时在活化状态，在何种组态下发生活化的，以及这具有预测价值。

典型的临床因素和额外的生物标记物

在一些实施例中，本发明包含评估临床因素。在一些实施例中，本发明包含评估bh3分布测试分析法和/或临床因素以评估病人的反应。在一些实施例中，一个结合bh3分布研究提供患者反应信息的临床因素，可能与凋亡没关系。在一些实施例中，一个临床因素是不影响凋亡的。

在一实施例中，临床因素是显示在图29。

在一实施例中,临床因素是年龄，细胞基因状态，患者表现，组织学子类，性别，和疾病阶段之一个或多个。

在一实施例中,临床因素是年龄。在一个实施例中，患者的年龄分布分级为约10以上，或20以上，或30以上，或40以上，或50以上，或60以上，或70以上，或约80岁以上。

在一实施例中,临床因素是细胞基因状态。在一些癌中，如肾母细胞瘤和视网膜母细胞瘤，基因缺失或失活是造成引发癌症进展的原因，就像与肿瘤抑制基因相关的染色体区域普遍缺失或突变。例如缺失，倒置和易位通常在神经胶质瘤，非小细胞肺癌，白血病，黑色素瘤中的染色体9p21区域检测到。不希望受理论约束地说，这些染色体的变化可能灭活肿瘤抑制者，即细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2a。随着这些特异性基因的缺失，染色体的很大一部分也会丢失。例如染色体1p，16q在固体肿瘤细胞中普遍缺失。基因复制和基因拷贝数的增加也有助于有助于促成癌，这可以通过转录分析或拷贝数变异检测阵列检测到。例如染色体区域12q13-q14是在许多肉瘤中扩增。该染色体区域存有mdm2结合蛋白的编码，此蛋白已知与一个肿瘤抑制基因p53结合。当mdm2扩增时，它可以防止p53调节细胞生长，这可以导致肿瘤的形成。此外，某些乳腺癌和erbb2基因的过表达和拷贝数的增加有关，它编码人表皮生长因子受体2。同时，在染色体数量的增加，如染色体1q,3q，也与增加的癌症风险有关。

细胞遗传学状态可以以各种在本领域已知的方式测量。例如可以使用fish,传统的染色体核型分析，虚拟染色体核型分析(例如，比较基因组杂交阵列(cgh),和单核苷酸多态性阵列)。例如可以使用fish评估在特定位点的染色体重排，这些现象是与疾病风险状态相关的。在一些实施例中，细胞基因状态是有利，中间，或不利的。

在一个实施例中，临床因素是患者表现。患者的表现成绩状态可以量化。使用任何系统和方法对病人的表现成绩状态进行评分在所属领域已知。测量通常是用来确定病人是否可以接受化疗，剂量调整，并确定姑息治疗的强度。有各种不同的评分系统，包括karnofsky卡氏评分，zubrod评分。平行评分系统包括全面功能评估(gaf)评分，这已被纳入作为精神病学的诊断与统计手册(dsm)的第五轴。高表现成绩状态(例如采用karnofsky评分系统，至少80％或至少70％)可能表明治疗以预防疾病状态的发展，提高病人的接受化疗和/或放射治疗的能力。例如，在这些实施例中,病人可以走动和能够自我保健。在其它实施例中，评价是表示一个低表现状态的患者(例如采用karnofsky评分系统，小于50％，小于30％，或小于20％)，从而允许常规放疗和/或化疗可容忍的。在这些实施例中，病人大部份局限在床上或椅子，甚至无能力自我照顾。

卡氏评分从100到0，其中100是“完美”的健康和0是死亡。分数可间隔10，其中：100％是正常的，没有抱怨，没有疾病的迹象；90％是能够正常活动，很少疾病症状或体征，80％是有些困难的正常活动，有些症状或体征；70％是能自理，但不能正常活动或工作；60％是需要一些帮助，可以照顾多数本人的要求；50％需要经常帮助，需要频繁的医疗保健；40％是失去能力的，需要特殊的照顾和帮助；30％是严重残疾，显示需要住院治疗；但没有死亡的风险；20％是病得很重，迫切需要住院，需要支持的措施或治疗；和10％是垂死的，快速恶化的致命疾病过程。

评估患者表现成绩的zubrod评分系统包括：0，充分活跃，能够不受没有限制地进行所有疾病前的表现；1，费力的身体活动受限制，但能够走动和进行轻度或坐着干的工作，例如轻度家庭工作，办公室工作；2，能够走动和全部自理但无法进行任何工作活动，能够站起大约超过50％醒着的时间；3，只能够有限自理，卧病在床或椅子超过50％醒着的时间；4，完全失去能力，不能进行任何自理，完全限制在床上或椅子；5，死亡。

在一个实施例中，临床因素是组织学子类。在一些实施例中，肿瘤的组织学样本依据“埃尔斯顿和埃利斯著，组织病理学，1991，19:403-10(elston&ellis,histopathology,1991,19:403-10)”分等级，其内容通过引用均以其整体纳入本文。

在一个实施例中，临床因素是性别。在一个实施例中，性别是男性。在另一实施例中，性别是女的。

在一个实施例中，临床因素是疾病的阶段。通过非限制性的例子，把整个阶段分组，第一阶段(i期)癌局限于身体的一个局部分；第二阶段(ii期)的癌症和第三阶段(iii期)的癌症是局部癌症晚期。癌症是否指定为ii期或iii期取决于具体癌症类型。在一个非限制性的例子，霍奇金氏病的第二阶段表明感染的淋巴结只在隔膜的一方，而第三阶段表明感染的淋巴结在隔膜的上方和下方。因此第二和第三阶段的具体标准根据诊断而不同。第四阶段(ⅳ期)癌经常发生转移，即转移到其他器官或整个身体。

在一些实施例中，临床因素是法国–美国–英国(fab)对血液疾病分类系统(例如表示不良骨髓组织生成的存在和原始粒细胞和红细胞的定量分析)。在一个实施例中，fab为急性淋巴细胞白血病分类是l1-l3，为急性髓细胞白血病分类是m0-m7。

在另一实施例中，本发明方法进一步包含测量选自突变状态，单核苷酸多态性，稳态蛋白水平，动态蛋白水平的一个额外的生物标志物。在另一实施例中，该方法进一步包括在病人的临床反应的预测。在另一实施例中，该方法进一步包括预测病人的临床反应。在另一实施例中，临床反应是约为1，约为2，约为3，或约5年的无进展/无事件生存率。

各种临床因素已经被确认，如患者年龄和患者表现成绩。一些诊断静态测量也被利用，如细胞基因学和分子事件，没有限制地包括，在基因mll，aml/eto，flt3-itd，npm1(npmc+)，cebpα，idh1，idh2，runx1，ras，和wt1的基因突变，和在表观遗传修饰基因tet2和asxl的基因突变，以及信号传导蛋白分布的变化。

在一些实施例中，预防性方法包括对很可能遭受癌症折磨的病人以在此描述的方法作为指南给予治疗。在一些实施例中，如果一个实验主体(患者)具有以下由一个或一个以上的癌症高风险特征，即如癌遗传易感性倾向(如遗传危险因素)，以前的癌症事例(如癌症和/或复发)，癌症家族史，暴露于致癌剂(如环境剂)，和药物基因组学的信息(基因型对治疗法的药物代谢动力学，药效学或治疗效果分布的影响效果)，那么这个实验对象(患者)可能遭受癌症。

在一些实施例中，如果一个实验主体具有癌症高风险特征，那么这个实验主体可能遭受癌症。在一些实施例中，如果一个主体具有癌遗传易感性倾向特征，那么这个主体可能遭受癌症。在一些实施例中，一个癌症遗传倾向是一种遗传临床因素，如在本领域中已知的。这样的临床因素可能包括，举例来说，至少对结肠癌，子宫癌，小肠癌，胃癌，泌尿道癌来说，有hnpcc，mlh1，msh2，msh6，pms1，pms2。在一些实施例中，如果一个主体以前有癌症事例，那么这个主体可能遭受癌症。在一些实施例中，主体以前已经遭受过1，或2，或3，或4，或5，或6次癌症事例。在一些实施例中，如果一个主体有家族癌症史特征，那么这个主体可能遭受癌症。在一些实施例中，父母和/或祖父母和/或兄弟姊妹和/或阿姨叔叔姑姑和/或祖阿姨祖叔叔祖姑姑和/或堂兄弟姊妹表兄弟姊妹，曾经患过或现患有癌症。在一些实施例中，如果一个主体是暴露于致癌剂(如环境剂)，那么这个主体可能遭受癌症。例如，把皮肤暴露在强烈的日光下是皮肤癌的临床因素。举例来说，吸烟是肺癌，口癌，喉癌，膀胱癌，肾癌，和其他一些器官癌的临床因素。

此外，在一些实施例中，以下任何一个临床因素可能在这里描述的方法中是有用的：性别；遗传危险因素；家族病历史；个人病历史；种族和民族；某些组织特点；各种良性条件(如非增生性病变)；以前的胸部放射事例，暴露于致癌物等。

此外还有，在一些实施例中，以下任何一个临床因素可能在这里描述的方法中是有用的：一个或多个细胞表面标志物cd33，细胞表面标志物cd34，flt3突变状态，p53基因的突变状态，mek-1激酶磷酸化状态，和bcl-2的在位置70的丝氨酸的磷酸化。

在一些实施例中，临床因素是细胞因子的表达水平，无限制地包括，白细胞介素-6(il-6)。在一些实施例中，白细胞介素-6水平与mm患者的反应可能性互相关联，包括患者的良好预后或不好的预后。

在某些实施例中，反应可能性是通过评估百分数活化而确定。在某些实施例中，活化是由以下方程定义：

其中auc包括曲线下的面积或信号强度；dmso(二甲基亚砜)包括基线阴性对照；和cccp(羰基氰化物间氯苯腙)包含蛋白合成有效因子，其作为在线粒体内质子梯度解偶联剂作用，质子梯度是在电子运输链中电子载体的正常活动中建立起来的。这作为基线阳性对照。在一些实施例中，曲线下面积是由均相时间分辨过的荧光(htrf)确立的。在一些实施例中，出现从约0到约300分钟至约0到约30分钟之间的时间窗口。在一些实施例中，曲线下面积是由荧光激活的细胞分选(facs)确立的。在一些实施例中，信号强度是约5到约300分钟内的单一次测量的。

在另一实施例中，本方法包括测量bh3分布测试分析与一个或多个细胞表面标记物，细胞表面标记物cd34，flt3突变状态，p53基因的突变状态，mek-1激酶磷酸化状态，和bcl-2的在位置70的丝氨酸的磷酸化；并和阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗或阿扎胞苷治疗aml患者的疗效相联系。

在另一实施例中，本方法包括测量bh3分布测试分析与一个或多个细胞表面标记物，细胞表面标记物cd34，flt3突变状态，p53基因的突变状态，mek-1激酶磷酸化状态，和bcl-2的在位置70的丝氨酸的磷酸化；并和用化疗治疗的mm患者的疗效相联系。

在另一个实施例中，癌症是aml和/或mm和临床因素是年龄分布和/或细胞基因状态；或者是癌症是aml和/或mm和癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷，或癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷和临床因素是年龄分布和/或细胞基因状态，或癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷；癌症是aml和/或mm；和临床因素是年龄分布和/或细胞基因状态。

本发明还提供了可以简化评价肿瘤或癌细胞标本的试剂盒。本发明的一个典型的试剂盒包含各种试剂，包括例如一个或多个检测bh3肽的试剂。一个试剂盒还可以包含一个或多个可用于检测的试剂，包括那些有用于各种检测方法，例如抗体。该试剂盒可以进一步包括用于评价所需要的材料，包括井板注射器等。该试剂盒可进一步包括一个标签或印刷的说明书，说明描述的试剂的使用。该试剂盒还包括处理进行测试。

术语“大约”连同一个引用数字标记一起使用时，指的是所引用数字标记加或减到其10％。例如，所言“大约50”覆盖45至55的范围内。

本文所用的用词“包括或包含”和它的变体，意欲是指非限制性的，既如此，在一个列表中的列举的项目意思是不排除其它类似项目，即那些也可能是有用于该技术的材料，组成物，器件和方法。同样，术语“能”“可能”“可以”和“会”及其变体的目的是非限制性的，既如此，可以或可能包含某些元素或特征的列举的一个实施例子不排除那些不包含这些元素或特征的本发明技术的其它实施例子。尽管开放式的术语“包括”，作为术语如包括，包含，或有等的一个同义词，在这里用来描述和提出本发明的权利要求，但本技术或其实施形式，也可以用另外更具限制性的术语如“由。。。组成的”或“基本上由组成的”来描述列举的组成成分。

除非另加定义，本文中所有的技术和科学术语与在本发明所属领域一个普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。虽然类似或相当于在此所描述的任何方法和材料可用于实施或试验本发明，优选的方法和材料在此描述。所有在此引用的出版文献，专利和专利出版文献，均以其整体纳入本参考以适用于所有用途。

本发明是由以下的非限制性的例子进一步说明。

实施例

实施例1:基于细胞的在治疗发展的研究

方法学:为检验细胞，每个小井里放置7.5x10³个细胞悬浮在反应缓冲液里(300mm海藻糖，hepes-kohph7.4。80mmkcl,1mmegta,1mmedta,0.1％bsaand5mm琥珀酸)。细胞是用毛地黄皂苷渗透处理，然后放上阳离子染料jc-1和β-巯基乙醇。然后把细胞分装在384-井微量滴定板的小井里，和如下所列的bh3结构域肽之一个培育：bim,bid,bad,noxaa,bim2a,puma,bmf,hrk和bik。在本实验中使用的肽是合成的，用高效液相色谱法测定的其纯度大于95％。细胞是用毛地黄皂苷渗透处理，然后放上阳离子染料jc-1和β-巯基乙醇。然后把细胞分装在384-井微量滴定板的小井里，和如下所列的bh3结构域肽之一个培育：bim,bid,bad,noxaa,bim2a,puma,bmf,hrk和bik。在本实验中使用的肽是合成的，用高效液相色谱法测定的其纯度大于95％。肽的身份是用质谱分析确认的。dmso媒介作为阴性对照。完全的线粒体膜去极化是由1mmfccp(p-三氟甲氧基羰基氰苯基腙)处理细胞而测定，然后这个样品作为检测标准和阳性对照。肽(和fccp)的加入导致在适当活化的细胞中的膜电位的下降，膜电位的测量是靠tecangenios板阅读器上的jc-1荧光读数降低来确定，其荧光是545纳米光的激发和590纳米光的发射来产生。这一过程的动力学随每个肽而变化，其终点是从超过180分钟的时间过程的动力学踪迹获得记录的。每种肽引起的荧光减弱相对于fccp响应进行归一化，然后以膜电位的损失率％dym报告。对每个细胞系每种实验进行了三重复。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的发展：bh3分布测试分析与只受治疗抑制剂活性影响的细胞系的相关性表明，促凋亡肽的区分性已被利用于区别或判别细胞系对影响细胞周期的发育疗法的反应。从这些细胞系的代表性bh3分布测试分析数据如图1所示。所指细胞系的细胞周期调节剂疗效如图2所示。来自固体恶性肿瘤的一组8个附着细胞系完整的bh3分布谱显示于图3，而来自非固体肿瘤的悬浮细胞系进行所有的肽测试之后的bh3分布谱如图4所示。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂在贴壁细胞系和悬浮细胞系的治疗效果，以及定量的bh3分布测试分析矩阵总结列于图27。具体而言，低bim肽的反应百分比与在悬浮细胞系和贴壁细胞系的治疗活性有相关性(图5和图6)。对noxa肽和puma肽的响应百分数也有区别的趋势，特别是当结合bim时(即noxa+bim_贴壁；puma+bim_悬浮)。

细胞周期调节器是固有地设计用来破坏的细胞周期，因此主要作为细胞生长抑制剂服务。另一方面，bh3分布测试分析法是设计用来衡量一个细胞的倾向发生促凋亡的线索。因此相应地，在这个例子中描述的数据表明，除其他外，本bh3分布测试研究途径的意外诊断应用在于预测不能机械地与促凋亡线索联系的药物的疗效。

bh3类似物(mcl-1抑制剂的发展)：bh3分布测试分析与只受治疗抑制剂活性影响的细胞系的相关性表明，促凋亡肽既识别在悬浮细胞中的疗效(图7)也识别在贴壁细胞中的疗效(图9)。具体而言，对低bim,puma,noxa,bad和hrk肽的反应百分比，每个都与悬浮细胞系的治疗活性有相关性。与悬浮细胞系疗效相关的多个标记物的算法包括bim+puma，bim+noxa，puma+noxa，bim+puma+noxa，bim+puma+noxa+hrk，和bim+puma+noxa+hrk+bad(图8)。在来自固体肿瘤的贴壁细胞系中，bim,puma和noxa每个分别与mcl-1抑制剂的疗效相关，而表现出相关性的多个标记物的算法，是和先前提到的悬浮细胞系相关性的一样(bim+puma，bim+noxa，puma+noxa，bim+puma+noxa，bim+puma+noxa+hrk，andbim+puma+noxa+hrk+bad)(图10)。

该数据显示，除其他外，多个标记物的方法途径在预测治疗效果时，在各自分别的标记物的基础上可能增加额外信息。鉴于mcl-1主要是通过noxa专一性调控，和通过puma(也结合bcl2和bclxl)非专一性调控，这样的研究发现是意料之外的。在这样一种方法途径中，给多个标记物授予比单独个别的mcl-1抑制剂额外的意义比重，提供相关疗效的相关性。疗效和bh3分布测试分析个别的和多标记物算法的数据在图28中提供。

驱动蛋白纺锤体蛋白(ksp)抑制剂的发展：ksp抑制剂对8例多发性骨髓瘤/白血病来源的人类细胞系进行了抗增殖试验。bh3分布测试分析是同时对这些细胞进行的。数据产生很强的迹象显示bh3分布测试分析读数(相对于分别的puma和bad的％活化)与化合物的抗增殖性之间存在相关性(图11)。

ksp抑制剂活性的相关性可以通过mcl1蛋白水平调节。如果这是唯一的机制，可以预期，作为mcl1的调节器的noxa将是足够的疗效预测剂。事实上，获得了一个没有预期的结果是puma(调节mcl1，bcl2和bclxl)和bad(bcl2和bclxl的效应剂)能够独立地区别在这些细胞系的疗效。

驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂是通过与微管建筑结构的相互作用和重新建模微管建筑结构来调节抗癌活性。这种行动机制使它惊讶的是，这些药物的作用是通过线粒体反应和随后的凋亡信号传导可以预测的。

实施例2:应用基于肿瘤病人患者群的研究

aml(基于阿糖胞苷的治疗[护理标准])，方法论：aml患者群：在一九九九年九月至二00七年三月间诱导化疗施行³⁹期间之前，新诊断的aml患者样本中是外围抽血或骨髓穿刺(bm)收集获得的。标本是在常规诊断评估时遵照研究审查委员会批准的规程和程序条例(实验室01-473)操作获得的。知情同意书是遵照赫尔辛基宣言获得。ficoll纯化后，cd3/cd19细胞耗竭除去污染的t细胞和b细胞。个别等分的细胞离心分离，再悬浮在90％胎牛血清/10％二甲基亚砜，然后冷冻保存在液氮里。获得了病理分类，细胞遗传学分析，和突变状态；临床指标均显示在附表和附图上。

治疗患者：患者是以对每个标准的响应来分类。在62例患者中，48例用阿糖胞苷+蒽环类药物治疗，7例用阿糖胞苷+非蒽环类治疗，8例用阿糖胞苷+氟达拉滨治疗(一例病人用阿糖胞苷+非蒽环类治疗一周期，然后用阿糖胞苷+氟达拉滨在随后的周期治疗[在两个周期都没有反应])。cr＝正常骨髓形态学，中性粒细胞(白细胞)绝对计数大于1000，血小板计数＞100k和上升的血红蛋白。原发性难治性＝诱导化疗2个周期后(可以是相同或不同的化疗方案)的残留白血病。复发是指患者体内有>5％在骨髓原始细胞或在外周血原始细胞，而患者以前是cr状态。

细胞基因风险状况的测定：细胞基因风险由clia认证的细胞基因学实验室中测定的。简而言之，患者按照标准分组分类：良好的＝inv16,t(8:21),t(15；17)；中间＝二倍体；不足的中期转位期；，不利的＝所有其他人，-5，-7，+8，t(6；9)，11q，ph1+，杂项。

bh3分布测试分析法：ficoll纯化的，可行的冷冻的,预处理的aml标本被解冻，与fcr的阻断剂(miltenyi生物技术公司，美国加州)一起再悬浮在facs缓冲液(1％胎牛血清的细胞，2mmedta，pbs)中，冰上10分钟，然后再用抗体cd45-v450(bd生物科学公司，美国加州)，cd3-生物素(bd生物科学，美国加州)，和cd20-生物素(e生物科学公司，美国加州)染色，冰上20分钟。样品与二级抗体链霉亲和素-apc(bd生物科学公司，美国加州)一起，被重新悬浮在facs缓冲液里，冰上20分钟。染色后，aml标本用毛地黄皂苷(digitonin)(sigma-aldrich公司,美国密苏里州)渗透化，然后每管2x10⁵个细胞，在室温下，在newmeyer缓冲液里(80mmkcl,10mmhepes,40μmedta,40μmegta,5mm琥珀酸,300mm海藻糖,0.1％牛血清白蛋白,ph7.4)，与肽(bim100μm,bim0.1μm,puma100μm,puma10μm,noxa100μm,bad100μm,bmf100μm,hrk100μm,或puma2a100μm)，或二甲基亚砜(dmso[(1％])，或羰基氰化物间氯苯腙(cccp[10μm])孵育180分钟。除非可行的细胞不足的情况以外，样品一式两份重复作实验。作分析实验45分钟之前加入电位jc-1线粒体染料(enzo生命科学公司，美国纽约州)。

样品是应用bd流式细胞仪diva软件在流式细胞仪cantoll(bdbiosciences公司，美国加州)上进行分析。原始细胞群被辩认定为cd45暗淡，ssc低，cd3和cd20阴性。强烈染色的cd45细胞代表较成熟的淋巴细胞，如前所描述被排除在外。相对于解偶联剂为对照，可定量的一个促凋亡肽诱导线粒体去极化倾向性被指定为活化百分率。对原始细胞而言，这是用pe通道平均信号强度计算，其中dmso作为背景归一化(阴性对照)与cccp作为100％活化(阳性对照)。

统计分析：bh3分布测试用生物标记物的预测价值是通过检测生物标记物的状态(％活化)和患者是否被表征为一个反应者或无反应者之间的联系来研究。单因素比较采用mann-whitney测试法，所有报告的p-值都是双面的。统计分析计划是预先确定要具有p＜0.01意义临界值以限制假阳性结果的风险(p值在＞0.01和＜0.05被认为是边缘显着)。生物标记物的预测能力是用曲线下面积(auc)的统计评估。生存的终点用cox比例风险回归分析法分析。多因素分析采用逻辑回归分析法进行的，并使用了从患者的临床病理资料上按上述标准看是显著的调节变量。通过对趋势的对数秩检验法，检验了os和efs与活化百分率的显著相关性。分析工作是利用以下sas软件进行的，sas软件9.2版本(sasinstitute公司，美国北卡州)，r版本2.14.2(r核心团队；奥地利维也纳)，和/或graphpad棱镜5.04版本(lajolla，美国加州)。

r组患者的特证：aml患者是相对于临床病理变量，根据基于阿糖胞苷的治疗方案反应状况而分层的(图29)。mannwhitney分析被用于检验临床变量和化疗反应的非随机相关性。测试的变量中，只有患者的年龄分布和细胞基因风险分层显示出相对于反应的非随机相关性(分别是p＝0.008和p＝0.006)。这两个非随机变量随后被利用在多变量分析上，这在下面为bh3分布测试用生物标记物时描述。

患者标本的bh3分布测试分析：对可行地保存了的aml患者的62个标本，作为这项研究的一部分，进行了bh3分布测试分析，其中61个标本提供了能作分析的数据。统计分析之前被排除在考虑之外的那一个标本产生了一个分布数据，但是台盼蓝排斥法鉴别出其可行的细胞数不足以继续进行分析。62个患者标本中的61个标本能够进行bh3分布测试分析，表明98.4％的总体技术成功。此外，这个标本的失败涉及我们的技术故障显然是与妥协的冷冻处理一致的，因为解冻之后立即观察到很差的细胞存活率。

这些aml标本研究起始之前，所有的肽已经经验优化，以给出一个动态的百分活化值范围。最值得注意的是，对于大多数aml患者标本，100μmbim是饱和的(或接近饱和)。因此，除了100μmbim，bim也在0.1μm浓度测定，其已被确定为提供一个动态的百分活化值范围。代表性的两个nr患者和两个cr患者的数据如图12所示。值得注意的是，从个别患者的重复样本的总的变异系数(cv)一般是3-5％，表示这是一个技术上强有力的检测分析方法，而且只有有限的一次实验到另一次实验间的数据变化。

检测的生物标记物肽中，高bim(0.1)百分活化得分与反应具有高度统计学意义(p＝0.0000018)上的相关性(图13)。已检测的其他bh3分布测试用生物标记物的分析显示在图30。除了由bim(0.1)产生的统计意义，puma(10)展示出其与反应的明显的相关性(p＝0.0064)(图14)。

当个别患者的bim(0.1)活化得分分开为有反应者组和无反应者组时(图2)，出现了一个明显的趋势。对阿糖胞苷治疗可能表现出反应的aml患者，比起那些较不可能反应的患者(百分活化＝13.2±13.4[sd])，往往有较高的bh3分布活化度(百分活化＝36.8±21.2[sd])。在建立这种生物标记物的敏感性和特异性在正确识别可能的有反应者而在同时正确分开无反应者方面，接收器工作特征(roc)曲线描画表示auc值0.83[95％ci:0.73,0.94](图14)，这是生物标记物正确地区别个别样品能力的一个优秀的指标。有趣的是，在这些数字中，一个单一的生物标志物可能会达到识别89.7％的有反应者而同时识别59.1％的无反应者。如果想得到的灵敏度截止在92.3％是稍高，那么专一性仍然达到54.6％的可能的无反应者。

年龄因素和细胞基因因素在这个数据集也被显现出是aml的预后因素(图29)。为了确定bim(0.1)％活化标记物的添加是否提供超越年龄分布和细胞基因信息以外的更多的预后信息，年龄分布和细胞基因因素连续加入到bim(0.1)％活化多因素分析中。把患者的年龄分布加入到bim(0.1)引起auc从以前只有bim(0.1)时的auc＝0.83增加到0.89(图15)。此外，当把bim(0.1)针对患者的年龄分布和细胞基因风险而调整时，auc进一步增加到0.91。在这后者的调整中，灵敏度达到了＞90％的识别有反应者及同时分开>70％可能的无反应者(图15)。

患者以其细胞基因风险状态分组，然后这些子组采用mannwhitney进行分析是否在识别有反应者和无反应者方面有重要意义。在中度风险(n＝33)子组，bim(0.1)和进一步区别反应间极显著相关(p＝0.0017)，而在不利的组(n＝23)bim(0.1)仍然是显著相关(p＝0.023)(图16)。相对于联合组的bim(0.1)分析，这里的p值是稍微减弱。这通常是由于子分组的患者数量少而统计能力降低的一个现象。有趣的是，无论bad和hrk分析在与反应区别关系上都产生有趣的显著的p值(分别p＝0.0017和p＝0.0055)；然而，这只在中度风险组观察到(图16)。利用roc分析,对这些生物标记物的反应区别能力的灵敏性和特异性进行的评估给出，在中度组bim(0.1)的auc＝0.875，bad的auc＝0.875，和hrk的auc＝0.823；和在不利组bim(0.1)的auc＝0.790(图16)。应当指出的是，相对于在独立分组的子组的无反应者，这些曲线下面积(auc)可能会受益于有反应者子组的分组有点不平衡。(中度组8nr和25cr,不利组15nr和9cr)。因为良好子组只有5名患者的数据，这组的统计分析是不可能的。

bim(0.1)bh3分布测试分析百分比活化和bim(bcl2l11)蛋白水平的比较：为了评估bimbh3分布测试分析的预测能力是否仅仅是重新放弃bim蛋白水平，进行了在本研究范围内的aml患者标本中是否存在或缺乏相关性的评估。结果发现，bim蛋白水平和百分比活化之间不存在相关性(图17)，得出r2＝0.0396。

在这个子集里bim(0.1)的bh3分布测试分析保持一个显著的p-值(p＝0.0048)(图17)，而全部患者组的bh3分布和rfpa数据是存在的。注意在这里的分析能力相对较早的分析降低，因为样本规模从n＝62减少到n＝43，而且没有rppa数据的许多样品是在其中得分最高的bh3分布标本之列。这同一个子集标本对bcl2l11蛋白水平的反应区别的p值为p＝0.33(图17)。这些数据提供强有力的证据表明bh3分布分析是和整体蛋白质水平不相关，还表明bh3分布分析也许可以提供一个新的范式，用其可预测aml患者对阿糖胞苷反应。

实施例3:二级临床终点：总生存率和无事件生存率

bh3分布测试用生物标记物也对二级临床终点总生存率(os)和无事件生存率(efs)的相关性进行了分析。采用cox比例分析连续变量模型表明，bim(0.1)对efs(p＝0.14)或os(p＝0.057)不重要。cox比例风险分析noxa百分比活化和efs之间也无显著p＝0.089。所有其它测试的肽，无论是os和％活化之间还是efs和％活化之间，没有产生显著的相关性或趋势(所有p＞0.10)。此外，调整变量的多变量分析患者的年龄分布和细胞基因风险状况，未能产生bh3分布测试用生物标记物和临床终点os和efs之间显著的相关性。

有趣的是，在分区模型分析，当患者群根据bim百分比活化被分为三组(高活化组，中间活化组，和低活化组)，相应的总生存率(os)产生中位数分别为250.7周，168.2周和32.7周(p＝0.029，趋势的对数秩检验)(图18)。当这三组的相同的分析针对无事件生存率(efs)进行的结果，中位数efs分别为高活化组的26.1周，中间活化组的71.3周，和低活化组的160.7周(p＝0.044，趋势的对数秩检验)(图18)。

aml和阿扎胞苷：对十三个人类aml衍生的细胞系进行了bh3分布分析和对体外阿扎胞苷反应进行了相关性分析。应用bh3分布度量学，分区模型具有统计学意义地(p＜0.01)区别更敏感(ic50<2um)和不敏感(ic50>2um)aml细胞系之间对阿扎胞苷(又名氮杂胞苷)的反应，分别使用个别肽-衍生的模型(图19)，两个肽模型(图20)以及含有3个或更多的肽模型(图21)。应用连续变量分析，r2＞0.7为对个别肽衍生模型(图22)和结合bh3肽模型的计算法；与之相对地，当用puma(pan活化指示剂)时，[log]ic50s为对两个肽模型(图23)和三个或更多的肽模型(图24)的计算法。统计学意义p值主要随着模型而变，包括puma(p＜0.01)。结果总结在图31。

因为阿扎胞苷属于已知表观遗传修饰剂的抗癌药物类，其直接调节细胞凋亡及其对线粒体生物学影响效应是不大可能的。因此，令人惊讶的是，通过设计为干涉测试内在凋亡途径和线粒体生物学的度量法，有可能预测阿扎胞苷治疗疗效。例如见，vo等人(细胞。2012；151(2)：344-355)报告的阿扎胞苷疗效不是靠bh3衍生的度量法预测。

这些数据是令人注目的，值得继续进行原发性aml患者标本检查，以其目的用bh3分布测试分析法为阿扎胞苷的治疗结果建立模型。

来自阿扎胞苷治疗的aml患者的bh3阵列度量法衍生来的计算法的支持数据已产生。在一项包括全数n＝28例总和组群(13(9稳定的/cr；4折射的/nr)标本和15(全部的nr/折射的))的研究中，一例样本是无法评估，27例样本进行了相对于反应的分析(19nr，8r)。该组群的报告的分数范围如图25所示，说明分数范围提供一治疗窗，从其中，反应和其他临床终点如总生存率(os)和无事件生存率(efs)可以测量。

对个别标记物，只有bim和noxa产生了边缘显著的与反应相关性(分别p＝0.05和p＝0.02)。所有其他生物标志物的p值>0.1。然而，当bim和noxa在本文描述的方法中结合用时，与反应相关性是高度显著的(p＝0.001)。此外，灵敏度/专属性的roc是0.91。这只是单因素分析，当临床调整变量加权时这个也许会统计上更强(例如，年龄，细胞基因状态，等)(图26)。

本申请包括以下实施方式：

1.一种确定病人的治疗癌症的方法，包括：

为病人的肿瘤或癌细胞的标本确定一个bh3分布；

确定一个或一个以上的病人的临床因素，和

为病人对一个或多个肿瘤治疗的临床反应的可能性分类；

其中选择一个或多个临床因素以增加与临床反应有关系的bh3分布结构的特异性和/或敏感性。

2.实施方式1中的方法，其中，癌症是一种血液癌。

3.实施方式2中的方法，其中血液癌症选自急性髓细胞白血病(aml)，多发性骨髓瘤，滤泡性淋巴瘤，急性淋巴细胞白血病(all)，慢性淋巴细胞性白血病，和非霍奇金淋巴瘤。

4.实施方式3中的方法，其中非霍奇金淋巴瘤是选自套细胞淋巴瘤和弥漫性大b细胞淋巴瘤。

5.实施方式1中的方法，其中癌是实体肿瘤。

6.实施方式5中的方法，其中的固体肿瘤是选自非小细胞肺癌，卵巢癌，和黑色素瘤。

7.实施方式1中的方法，其中的癌症治疗是一个或一个以上的抗癌药物，化疗，手术，辅助治疗和新辅助治疗。

8.实施方式7中的方法，其中的癌症治疗是一个或多个bh3模拟物，表观遗传修饰剂，拓扑异构酶抑制剂，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，和驱动蛋白纺锤体蛋白稳定剂。

9.实施方式7中的方法，其中的癌症治疗是一种蛋白酶体抑制剂。

10.实施方式7中的方法，其中的癌症治疗是一个细胞周期调控的调制器。

11.实施方式10中的方法，其中细胞周期调控的调制器是一个细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。

12.实施方式7中的方法，其中癌症治疗是一个细胞的表观遗传机制的调制器。

13.实施方式12中的方法，其中表观遗传学机制调制器是组蛋白去乙酰化酶(hdac)抑制剂包含一个或多个伏立诺他或恩替诺特。

14.实施方式12中的方法，其中的表观遗传学机制调制器是阿托胞苷。

15.实施方式12中的方法，其中的表观遗传学机制调制器是地西他滨。

16.实施方式7中的方法，其中癌症治疗是蒽环类或蒽二酮。

17.实施方式16中的方法，其中蒽环类或蒽二酮是表柔比星，阿霉素，米托蒽醌，柔红霉素，伊达比星之一个或多个。

18.实施方式7中的方法，其中癌症治疗是基于铂类的治疗。

19.实施方式18中的方法，其中基于铂类的治疗是卡铂，顺铂，和奥沙利铂之一个或多个。

20.实施方式7中的方法，其中癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗。

21.实施方式7中的方法，其中癌症治疗是一个bh3模拟物。

22.实施方式21中的方法，其中bh3模拟物是bcl2，bclxl，和mcl1之一个或多个。

23.实施方式7中的方法，其中癌症治疗是mcl1抑制剂。

24.实施方式1中的方法，其中bh3分布结构分析包括：使病人的癌细胞渗透化，在渗透化细胞与一个或多个bh3结构域肽接触时测定线粒体膜电位的变化；和找出线粒体膜电位的损失与细胞对诱导凋亡药物的化疗敏感性的相关性。

25.实施方式1中的方法，其中bh3分布分析包括肽的应用，其中肽是如下之一个或多个：bim,bim2a,bad,bid,hrk,puma,noxa,bmf,bik,和puma2a。

26.实施方式24中的方法，其中的肽使用浓度为0.1μm至200μm。

27.实施方式1中的方法，其中样本选自一个冷冻的肿瘤组织标本活检，培养的细胞，循环肿瘤细胞，和福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织标本。

28.实施方式1中的方法，其中样品是人类肿瘤衍生的细胞系。

29.实施方式1中的方法，其中样品是肿瘤干细胞。

30.实施方式1中的方法，其中样品是来自一个固体肿瘤活检。

31.实施方式30中的方法，其中标本来自一个结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，胰腺癌，肾癌，或原发性卵巢肿瘤的活检。

32.实施方式1中的方法，其中标本是来源于上皮起源。

33.实施方式32中的方法，其中上皮标本是从活检样本用抗上皮细胞粘附分子(epcam)或其它固定到固体基质或珠粒上的与上皮细胞结合的抗体选择富集的。

34.实施方式1中的方法，其中标本是来源于间充质。

35.实施方式34中的方法，其中中间充质标本是从活检样本用神经细胞粘附分子(n-cam)或神经纤毛蛋白或其它固定到固体基质或珠粒上的与间充质细胞结合的抗体选择富集的。

36.实施方式1中的方法，其中标本来自一个非固体肿瘤活检。

37.实施方式36中的方法，其中标本来自一个如下癌症患者的活检：多发性骨髓瘤，急性髓细胞性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴性白血病，套细胞淋巴瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤。

38.实施方式37中的方法，当样品是多发性骨髓瘤细胞，其是从一活检样本用固定到固体基质或珠粒上的抗-cd138抗体选择富集的。

39.实施方式37中的方法，当癌细胞是一种急性髓细胞性白血病，其是通过与cd45-指向的抗体结合而富集的。

40.实施方式37中的方法，当癌细胞是一种慢性淋巴白血病或弥漫性大b细胞淋巴瘤，其是由非b细胞耗竭富集的。

41.实施方式1中的方法，其中标本来自一个循环肿瘤细胞。

42.实施方式1中的方法，其中临床因素是一个或多个年龄，细胞遗传学状态，患者表现，组织学子类，性别，和疾病的阶段。

43.实施方式1中的方法，进一步还包括一个额外的生物标志物的测量：其额外生物标志物选自突变状态，单核苷酸多态性，稳态蛋白水平，和动态的蛋白水平。

44.实施方式1中的方法，其中该方法进一步包括预测病人的临床反应。

45.实施方式44中的方法，其中临床反应是至少约1年，约2年，约3年，或约5年的进展/无事件生存率。

46.实施方式1中的方法，其中临床反应可能性是由以下方程定义：

其中：

auc包括曲线下的面积或信号强度；

dmso(二甲基亚砜)包括基线阴性对照；和

cccp(羰基氰化物间氯苯腙)包括蛋白质合成有效因子，其作为在线粒体内质子梯度解偶联剂作用，质子梯度是在电子运输链中电子载体的正常活动期间建立起来的。这作为基线阳性对照。

47.实施方式46中的方法，其中曲线下的面积是由均相时间分辨荧光法(htrf)建立。

48.实施方式46中的方法，其中出现从约0到约300分钟至约0到约30分钟之间的时间窗口。

49.实施方式46中的方法，其中曲线下面积是通过荧光激活细胞分选(facs)确立。

50.实施方式46中的方法，其中信号强度是约5到约300分钟内的一次性测量的。

51.实施方式1中的方法，包括确定bh3分布与一个或多个细胞表面标记物cd33，细胞表面标记物cd34，flt3突变状态，p53基因的突变状态，mek-1激酶磷酸化状态，和bcl-2的在位置70的丝氨酸的磷酸化；并与阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗或阿扎胞苷治疗aml患者的疗效相联系。

52.实施方式1中的方法，包括确定bh3分布与一个或多个细胞表面标记物cd33，细胞表面标记物cd34，flt3突变状态，p53基因的突变状态，mek-1激酶磷酸化状态，和bcl-2的在位置70的丝氨酸的磷酸化；并与用化疗治疗mm患者的疗效相联系。

53.实施方式1中的方法，其中癌症是aml和/或mm和临床因素是年龄分布和/或细胞遗传学状态。

54.实施方式1中的方法，其中癌症是aml和/或mm和癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷。

55.实施方式1中的方法，其中癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷，和临床因素是年龄分布和/或细胞遗传学状态。

56.实施方式1中的方法，其中癌症治疗是阿糖胞苷或基于阿糖胞苷的化疗和/或阿扎胞苷；癌症是aml和/或mm；和临床因素是年龄分布和/或细胞遗传学状态。

57.一种为病人的癌症治疗定位的方法，包括：

将患者的可渗透化的癌细胞和一个或多个bh3区域肽相接触；

通过免疫组织化学法和/或荧光原位杂化法(fish)，确定患者癌细胞的一个或多个临床因素存在与否；以及

为患者对一种或多种癌治疗有临床反应的可能性作出级别分类。

58.一种为确定aml病人对阿糖胞苷和/或阿扎胞苷的反应的方法，包括：

确定患者的aml癌细胞标本的bh3分布谱；

确定患者的一种或多种临床因素，和

其中从年龄分布和/或细胞基因状态中选出一种或多种临床因素；和

为患者对一种或几种癌证治疗有临床反应的可能性作出级别分类。

59.实施方式58中的方法，其中确定bh3分布包括把患者的aml癌细胞标本与和bim接触。

等价体

本领域技术人员会认识到，或可以弄清，使用不超过常规的实验，在此具体地描述了许多等同于具体实施方案的当量等价体。这种当量等价体是意指被包含在下列权利要求的范围。

通过引用纳入

本文引用的所有专利和出版物均通过引用以其整体纳入本文。

本文所讨论的出版物仅供披露其在本申请的申请日之前。本条规定并不被视为承认本发明不得早于这样的出版物就因为其以前的发明。