本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种细菌鞭毛染色方法。
背景技术：
鞭毛(flagellum)是细菌菌体表面的一种细长、并呈波浪状弯曲的特殊结构，是细菌的运动器官。它是细菌在进化过程中长期适应的结果，使细菌更好地适应环境，有利于细菌的生存。鞭毛的数量、形态及其在菌体的分布位置是鉴定细菌的重要指标，但由于鞭毛的直径非常纤细，只有12～30nm，远低于普通光学显微镜的分辨率，需用电子显微镜观察，或采用特殊的染色方法使鞭毛增粗后在普通光学显微镜下观察。
鞭毛染色的基本原理是：在染色前先用媒染剂(如单宁酸或明矾钾)处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色，比如碱性复红、硝酸银、结晶紫染色等。常用的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝b法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸。
尽管目前细菌鞭毛染色方法报告较多，但基本染色方法可概括为：leifson染色法、西萨-基尔染色法、银盐染色法、柯达卡溶液染色法及负染法(参考：李任峰，细菌鞭毛研究概况及进展[j].微生物学通报，2005，32(6)124-127)。现在教学中普遍采用的银染法，虽染色清晰、鞭毛染出率高，但是硝酸银溶液配制过程相对复杂，且加入氨水的量以及硝酸银回滴的程度不容易把握。而且存在试剂不稳定，易造成重金属环境污染等不足。
徐娜娜等人公开了一种改良的细菌鞭毛染色方法：细菌在双蒸水中舒展肿胀5min后，复红染色5min，再用碱性美兰复染5min，镜下菌体染成蓝色，鞭毛染成红色，鞭毛染色效果好(参考：《细菌鞭毛染色方法的改良》，实用医技杂志[j]，2017，24(2))。但是该方法鞭毛染色效果容易受细菌在双蒸水中舒展膨胀时间的影响，膨胀时间太长(比如超过10min)，菌体鞭毛膨胀太过，菌体洗脱太多，染色后融合成一片，不够清晰。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明提供一种细菌鞭毛染色方法。本发明提供的细菌鞭毛染色方法的染色效果不易受细菌膨胀时间影响，染色效果好，鞭毛染色成功率高，重复性好。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：
本发明提供一种细菌鞭毛染色方法，包括如下步骤：
1)菌种活化；
2)菌悬液制备，双蒸水舒展膨胀10～15min；
3)涂片，固定；
4)染色，包括碱性复红染色，碱性美兰复染。
步骤3)所述固定为30～60℃热固定或饿酸固定。
在一种实施方式中，步骤3)所述固定为40～50℃热固定，固定时间为5～10min。
在一种实施方式中，步骤3)所述固定为1～2％饿酸固定，固定时间为1～3min。
步骤4)所述碱性复红染色的染色时间为40～60sec，染色温度为40～50℃。
所述碱性复红染色的染料配方为：5％钾明矾水溶液，2％鞣酸水溶液，1％碱性复红乙醇溶液等量按顺序混合，所述乙醇为95％乙醇。
步骤4)所述碱性美兰复染的染色时间为1～5min，常温染色。
所述碱性美兰复染的染料配方为：美兰2g加95％乙醇100ml，蒸馏水100ml，10％naoh0.1ml混匀。
优选地，步骤1)所述菌种活化的的固体培养基培养时间为12～18小时。
优选地，步骤1)所述菌悬液用麦氏比浊法检测，细菌浓度为1.5×1012/l。
本发明提供一种细菌鞭毛染色方法，包括如下步骤：1)菌种活化；2)菌悬液制备，双蒸水舒展膨胀10～15min；3)涂片，固定；4)染色，包括碱性复红染色，碱性美兰复染。
任选地，本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明提供的细菌鞭毛染色方法的染色效果不易受细菌膨胀时间影响，染色效果好。
2、本发明提供的细菌鞭毛染色方法鞭毛染色成功率高，重复性好。
3、本发明提供的细菌鞭毛染色方法鞭毛染色时间有效缩短。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
为保证细菌鞭毛染色效果，试验用载玻片要处理干净，不能有污渍，尤其是油污，否则细菌游不开堆积在一起，无法染色观察。较好的玻片标准：当滴加一滴蒸馏水在玻片上，水滴能快速均匀的扩散开来，且迎着光观察，玻片表面无去污剂残留。载玻片的处理方法可以是：将载玻片提前一天置于重铬酸钾硫酸清洁液(重铬酸钾100g，浓硫酸800ml，水200ml)中浸泡一晚，取出后以清水洗干净，斜插于架上，自然晾干备用。载玻片的处理方法也可以是：将载玻片逐片放入1％清洁液中浸泡30min，热水冲洗数次，彻底清洗干净，斜插于架上，自然晾干备用。
菌悬液用麦氏比浊法检测，细菌浓度约为1.5×1012/l时，染色效果佳。
菌种活化的的固体培养基培养时间为12～18小时。参考：万滋衡等，leifson细菌鞭毛染色法的改良[j].中国卫生检验杂志，2010，04：792，930。
本发明所述的热固定，包括但不限于，任选地，可以在恒温培养箱中进行，也可以在点燃的酒精灯旁进行，也可以在温度可控的烘箱中进行。热固定可以使鞭毛蛋白高热变性凝固，不至于过于膨大。
本发明所述饿酸固定，优选1～2％饿酸固定。饿酸可以快速固定细胞但不改变其结构。如本领域技术人员所知，应用饿酸固定细胞的技术如下：在培养皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛细管，在毛细管中注入少量的1～2％饿酸溶液，同时在玻璃上再放置湿标本涂片的载玻片，然后把培养皿盖上，经过1～2min后把标本从培养皿中取出，并使之干燥。
本发明所述的碱性复红染色，包括但不限于，任选地，可以在恒温培养箱中进行，也可以在点燃的酒精灯旁进行，也可以在温度可控的烘箱中进行。
细菌鞭毛碱性复红法和副品红法染色：1926年由gray首创，其媒染液成分包括20％丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3％碱性复红乙醇(95％)溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色ziehl-neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：a为1.5％nacl水溶液，b为3％单宁酸水溶液，c为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95％乙醇溶液中。使用时把等体积a和b混合，然后再加2体积c与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。
本发明所述的碱性复红染色的染液配方任选地，可以为，5％钾明矾水溶液，2％鞣酸水溶液，1％碱性复红乙醇溶液等量按顺序混合，所述乙醇为95％乙醇。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原能力的活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对细菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
本发明利用碱性美兰进一步复染细菌菌体，使菌体和鞭毛呈现不同的颜色，细菌标本呈现一定颜色梯度，利于显微镜观察。
本发明所述的碱性美兰复染染液配方，任选地，可以为，美兰2g加95％乙醇100ml，蒸馏水100ml，10％naoh0.1ml混匀。
下面通过下述实施例再对本发明作进一步的描述，除非特殊说明，所用试剂均为市售试验用分析纯，所用试验细菌为变形杆菌，由徐州医科大学形态学实验教学中心提供，所用营养琼脂培养基购买自杭州天和微生物公司。
实施例1
鞭毛染色液(碱性复红染色染液)配方：
5％钾明矾水溶液
2％鞣酸水溶液
1％碱性复红乙醇(95％)溶液
上述三种溶液等量按顺序混合即得鞭毛染色液。
实施例2
鞭毛复染液(碱性美兰复染染料)配方：
美兰2g加95％乙醇100ml，
蒸馏水100ml
10％naoh0.1ml
上述三种溶液混匀即得鞭毛复染液。
实施例3
载玻片处理方法：
重铬酸钾硫酸清洁液：重铬酸钾100g，浓硫酸800ml，水200ml。
将载玻片提前一天置于重铬酸钾硫酸清洁液中浸泡一晚，取出后以清水洗干净，斜插于架上，自然晾干备用。
实施例4～实施例8、对比试验鞭毛染色液配方同实施例1、鞭毛复染液配方同实施例2，载玻片处理方法同实施例3。
实施例4
鞭毛染色方法：
1)菌种活化：将冰箱保存的变形杆菌接种于液体培养基中培养24h，连续转种3次，然后接种环转种至固体培养基平皿中培养12h；
2)菌悬液制备：将3～4ml无菌双蒸水加入接种好的固体培养皿中，轻轻旋转晃动平皿，稍微倾斜平皿静置备用；
3)涂片、固定：于菌悬液静置第10min，用接种环取一环菌悬液，放在载玻片一端，切勿研磨或振动，斜立载玻片，30℃烘箱热固定10min；
4)染色：确定载玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，40℃烘箱静置60sec后，流水冲洗；再加鞭毛复染液染色5min，水洗干燥后，油镜观察。
实施例5
鞭毛染色方法：
1)菌种活化：将冰箱保存的变形杆菌接种于液体培养基中培养24h，连续转种2次，然后接种环转种至固体培养基平皿中培养16h；
2)菌悬液制备：将3～4ml无菌双蒸水加入接种好的固体培养皿中，轻轻旋转晃动平皿，稍微倾斜平皿静置备用；
3)涂片、固定：于菌悬液静置第15min，用接种环取一环菌悬液，放在载玻片一端，切勿研磨或振动，斜立载玻片，60℃烘箱热固定5min；
4)染色：确定载玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，45℃恒温培养箱静置50sec后，流水冲洗；再加鞭毛复染液染色1min，水洗干燥后，油镜观察。
实施例6
鞭毛染色方法：
1)菌种活化：将冰箱保存的变形杆菌接种于液体培养基中培养18h，连续转种3次，然后接种环转种至固体培养基平皿中培养12h；
2)菌悬液制备：将3～4ml无菌双蒸水加入接种好的固体培养皿中，轻轻旋转晃动平皿，稍微倾斜平皿静置备用；
3)涂片、固定：于菌悬液静置第10min，用接种环取一环菌悬液，放在载玻片一端，切勿研磨或振动，1％饿酸固定，固定时间为3min；
4)染色：确定载玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，50℃烘箱静置40sec后，流水冲洗；再加鞭毛复染液染色3min，水洗干燥后，油镜观察。
实施例7
鞭毛染色方法：
1)菌种活化：将冰箱保存的变形杆菌接种于液体培养基中培养20h，连续转种3次，然后接种环转种至固体培养基平皿中培养18h小时；
2)菌悬液制备：将3～4ml无菌双蒸水加入接种好的固体培养皿中，轻轻旋转晃动平皿，稍微倾斜平皿静置备用；
3)涂片、固定：于菌悬液静置第12min，用接种环取一环菌悬液，放在载玻片一端，切勿研磨或振动，2％饿酸固定，固定时间为1min；
4)染色：确定载玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，40℃烘箱静置50sec后，流水冲洗；再加鞭毛复染液染色5min，水洗干燥后，油镜观察。
实施例8
鞭毛染色方法：
1)菌种活化：将冰箱保存的变形杆菌接种于液体培养基中培养22h，连续转种5次；
2)菌悬液制备：取第3待变形杆菌营养琼脂培养基培养物周边菌苔，放入1ml双蒸水中，细菌浓度约1.5×1012/l(麦氏比浊法)，轻轻摇匀，置37℃恒温培养箱中静置15min；
3)涂片、固定：于菌悬液静置第15min，用接种环取一环菌悬液，放在载玻片一端，切勿研磨或振动，斜立载玻片，45℃烘箱热固定8min；
4)染色：确定载玻片完全干燥后，在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液，40℃恒温培养箱静置50sec后，流水冲洗；再加鞭毛复染液染色4min，水洗干燥后，油镜观察。
对比试验：
1)菌种活化：将冰箱保存的变形杆菌接种于液体培养基中培养24h，连续转种3次，然后接种环转种至固体培养基平皿中培养18h小时；
2)菌悬液制备：将3～4ml无菌双蒸水加入接种好的固体培养皿中，轻轻旋转晃动平皿，稍微倾斜平皿静置备用；
3)涂片、染色：于菌悬液静置第15min，用接种环取一环菌悬液，放在载玻片一端，切勿研磨或振动，斜立载玻片，让其自然干燥，然后在干燥的菌膜上滴加鞭毛染色液5min后，流水冲洗，再加鞭毛复染液染色5min，水洗干燥后，油镜观察。
试验结果：通过普通光学显微镜直接油镜观察，实施例4～实施例8变形杆菌鞭毛均染色成功。实施例4～实施例8所得标本变形杆菌菌体着色蓝色，鞭毛着色红色，背景淡蓝，标本颜色层次分明，轮廓清晰，鞭毛粗细适合，染色效果好。对比试验变形杆菌鞭毛染色失败，菌体洗脱太多且菌体模糊，鞭毛染不清晰。
以上内容仅仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依照本发明的思路，在具体实施例方式及其应用范围上均会有所改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
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