本发明属于生物医药领域，具体涉及用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白rv2031c。
背景技术：
多个世纪以来，结核病持续在全球成为一个不容忽视的公共卫生问题。目前全球已有三分之一的人口携带结核分枝杆菌，仅2010年一年就新增结核病病例880万，死亡145万，平均不到22秒即有一人死于肺结核病，结核病高居传染病死亡人数之首。而我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者人数高居全球第二位，受感染人数超过5亿，仅2010年一年就有新发病例90～120万，占据了全球总新增病例的约12％，如不及时采取有效措施，在未来十年内可能有3000万人发病，将会导致严重的公共卫生问题和社会问题，所以从国家战略层面必需尽快实现对肺结核的有效控制。科学证明表明由于活动性肺结核的极易传播性，对活动性肺结核的诊断及尽快消除传染源，控制结核病流行有非常重大的意义。然而肺结核的根治目前还不能完全做到，据研究表明活动性结核病患者经不同的短程化疗治愈后，有1％-9％的患者将会复发，而在一些特殊人群中，高达20％(hongkongchestservice/britishmedicalresearchcouncil.amrevrespirdis,1991,143:700-706)，而且耐药性结核病进一步传播与复发未及时诊断的结核患者有很大的关系。所以关于结核治愈患者的活动性肺结核诊断对于防治结核的整体战略具有很大的意义。目前活动性判断应综合临床、x线表现和痰菌决定，而主要依据是痰菌和x线。痰涂片检查简便易行，准确性较高，是活动性肺结核确诊的金标准，但某些研究中其检出率甚至低于10％。基于核酸扩增的诊断方法，如实时定量pcr以及dna芯片的优点是灵敏度高且耗时短，其问题在于特异性较难保证，容易导致假阳性结果。而基于抗原抗体反应的血清学诊断，由于其简便性、快速性，日益成为重要的活动性肺结核临床辅助性诊断手段，并且能满足区分结核康复人群与活动性肺结核的要求。因此，从长远角度综合来看，应致力于发现敏感性和特异性均较好的结核标志物。理想的结核诊断标志物应符合以下条件：(1)敏感性高；(2)特异性高；(3)存在于体液，特别是血液中，易于检测。但是目前肺结核分支杆菌血清学诊断所针对的抗原如抗原5、38kd抗原、30/31kd抗原以及抗原60等，均存在阳性检出率低，与其它分支杆菌的交叉免疫性等问题，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于活动性肺结核的确诊。为了实现对活动性肺结核的高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的活动性肺结核生物标志物。技术实现要素：本发明的一个目的是提供rv2031c蛋白的用途。本发明提供rv2031c蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；所述rv2031c是如下a)或b)的蛋白：a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。rv2031c是已知的蛋白，根据个体差异，该蛋白可能有不同的序列，它们可能存在一个或几个氨基酸的差异，但是都在本发明的范围内，本发明的一个实施例中使用的蛋白的序列是序列2。上述rv2031c蛋白在制备检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染结核分枝杆菌的产品。本发明提供的产品，包括rv2031c蛋白。上述产品还包括阳性质控和阴性对照孔；所述阳性质控为植物血凝素pha；所述阴性对照孔为无抗原的细胞培养液。上述产品中，所述产品还包括记载如下内容的可读载体(可为说明书)：若检测结果满足如下条件：阴性对照孔斑点数为0-5,且rv2031c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6；或若阴性对照孔斑点数大于等于6,且(rv2031c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)；则待测样本候选感染结核分枝杆菌，为阳性样本；若检测结果满足如下所述条件，则待测样本候选未感染结核分枝杆菌；所述阴性对照孔为阴性对照所在孔，所述rv2031c检测孔为所述rv2031c蛋白所在孔。上述产品为试剂盒，上述试剂盒具体为t-spot试剂盒，也可以为elisa试剂盒。上述t-spot试剂盒还包括t-spot试剂盒中的微孔培养板、浓缩标记抗体、显色底物溶液。上述试剂盒为oxfordimmunotec(英国)的产品。本发明第三个目的是提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查结核分枝杆菌的标志物。本发明提供的标志物，为rv2031c蛋白。本发明的实验证明，本发明筛选了结核分枝杆菌来源的蛋白片段，提供了一种检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原rv2031c，通过该抗原来体外检测特异性t细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。部分试剂如下：lysisbuffer：20mmtris-hcl、500mm氯化钠、10％甘油、ph8.0washbuffer：20mmtris-hcl、20mm咪唑、500mm氯化钠、10％甘油、ph8.0elutionbuffer：20mmtris-hcl、250mm咪唑、500mm氯化钠、10％甘油、ph8.0层析缓冲液：取磷酸二氢钾13.609g(配制1000ml)，加0.1mol/l氢氧化钠溶液，调节ph至7.5，得到ph值为7.5的pbs缓冲液。固化ni+层析树脂novagen，ni-ntahis，(cat.no70691-5，北京华美；2-8度保存)；蛋白结合能力大于5mg/mlresin层析柱(玻璃或者聚丙烯)。superdex75：(ge)。下述实施例采用结核感染t细胞检测试剂盒是oxfordimmunotec(英国)的t-spot试剂盒，为esat-6和cfp10双抗原试剂盒。实施例1、原核表达目的蛋白rv2031c目的蛋白rv2031c的制备：将表达rv2031c蛋白编码基因的重组载体pet28a-rv2031c导入大肠杆菌bl21中，得到重组菌bl21/pet28a-rv2031c；再iptg诱导重组菌bl21/pet28a-rv2031c，收集上清液，即为目的蛋白rv2031c。具体如下：1、表达目的蛋白重组菌的构建rv2031c蛋白的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1。将序列1所示的rv2031c蛋白编码基因插入pet28a载体的ndei和ecori位点，得到重组载体pet28a-rv2031c；将重组载体导入大肠杆菌bl21中，得到重组菌bl21/pet28a-rv2031c。2、蛋白表达1)重组菌bl21/pet28a-rv2031c在37℃静置过夜(16h左右)。2)接种于5ml液体lb培养基(加入5ulkan)37℃200rpm，培养至od大于0.6-0.8(大约3h)。3)按接种量5ml接种于300mllb液体培养基中，37℃，200rpm培养至od600≈0.6-0.8(大约2h)。降温到16℃，加入终浓度0.4mmiptg；4)16℃，200rpm培养培养16h，4℃，4000rpm离心10min收集菌体。3、蛋白纯化1)菌体重悬：每1l培养基所收集的菌体用40ml左右lysisbuffer重悬(加入1％蛋白酶抑制剂pmsf，则终浓度为0.5-1mm)2)菌体破碎：超声6s/次、功率为38％，超声20min。(悬浊液透亮为标准，酌情调整超声工作总时间)。3)去除细菌碎片：4℃，12000g离心30分钟。4)ni柱处理：3mlni柱先用水处理8cv(8倍柱体积)，再用8cvlysisbuffer作为平衡液平衡，流速为30cm/h。5)上样：破菌离心上清以30cm/ml的流速进行上样，收集流穿峰。6)平衡：样品上样后用平衡液平衡5cv；7)洗涤：用washbuffer洗涤5cv；8)洗脱：用elutionbuffer洗脱，分管收集。用bradford试剂检测洗脱液，了解蛋白是否完全洗脱。如含有蛋白，则继续洗脱，直至完全，得到洗脱蛋白。9)透析：洗脱蛋白装入7kd的透析袋中放入装有100倍洗脱蛋白体积的离子交换缓冲液a(配方10mmpb、50mmnacl、ph7.5)的烧杯中进行透析过夜。离心取上清。10)分子筛层析a)层析柱：superdex75(根据样品的量来确定层析介质的体积)b)流速；30cm/hc)层析过程：先用水处理5cv，再用0.6mnaoh水溶液处理半小时，再用层析缓冲液(pbs、ph7.5)平衡层析，直至层析柱电导和ph流出液与层析缓冲液一致。将上述9)得到的上清上样，用层析缓冲液洗脱(流速30cm/h)，收集对应的洗脱峰，为目的蛋白rv2031c(大小为19.516kda)。实施例2、结核分枝杆菌标识物抗原rv2031c在检测结核分枝杆菌中的应用1、t-spot试剂盒检测具体方法如下，里面的一些溶液均来自oxfordimmunotec(英国)的t-spot试剂盒：1)使用肝素真空采血管对不同待测患者(表1所示35个均为结核病人例临床检测结核病的患者和表2所示的4例临床检测非结核病人，且知情)直接采外周静脉血，得到抗凝血样本；2)将抗凝血样本按体积1:1与rpmi1640培养液混匀；按3:1比例小心将血样加在ficoll淋巴细胞分离液上层(gehealthcare17-1440-02)(利用ficoll-paquetmplus按照操作说明分离pbmcs)；室温25℃，1000g离心22分钟；水平转子，缓升缓降；3)将单核细胞层(位于离心管中间层，为一层较薄的白膜状)从ficoll分离管中转移到已加10mlaim-v培养液(invitrogen12055091)的无菌15ml离心管，轻轻混匀，室温600g离心7min；4)小心去除上清，加入1mlaim-v培养液，轻缓重悬细胞，加入aim-v培养液至10ml,350g离心7min；5)小心弃上清，加入1mlaim-v培养液重悬细胞，得到细胞悬液(pbmcs)；6)取10μl细胞悬液加入40μl的1％trypanblue，用aim-v培养液稀释，得到细胞稀释工作液；7)将24孔pvdf膜板从铝封袋中取出，按顺序加入：50μl植物血凝素pha(sigma)至阳性对照孔、50μl制备获得的rv2031c蛋白溶液(初始浓度为60ug/ml，溶剂为aimv培养液)加入到检测孔、50μlaimv培养液至阴性对照孔；在上述3孔中分别加入已制备细胞稀释工作液100μl(每孔细胞数量2.5×105)，且样品孔中rv2031c蛋白溶液的终浓度为20ug/ml；8)将培养板放入37℃，5％co2培养箱孵育16小时；9)用无菌pbs按1:200制备新鲜酶标抗体工作液；从培养箱取出培养板，弃去孔内液体。以200μl/well无菌pbs洗涤4遍；10)加入50μl/well酶标抗体工作液，将培养板在2-8℃孵育1小时。用pbs洗涤4遍去除未结合酶标抗体；11)每孔加入室温平衡过的底物工作液50μl，室温反应7分钟。以蒸馏水冲洗终止反应，在37℃2-3hrs或室温过夜干燥培养板，得到含有反应产物的培养板。2、斑点记数1)从培养箱中取出含有反应产物的培养板弃去细胞培养液；2)每个反应孔加入200ulpbs缓冲液(ph7.5)；3)弃去pbs缓冲液；用新鲜的pbs缓冲液重复洗涤至少3遍；4)用pbs缓冲液200倍稀释试剂盒中的浓缩标记抗体试剂(碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人γ-干扰素单抗)；5)每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵育1小时；6)弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤；7)每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分钟；8)用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应；9)在通风处或37℃温箱干燥培养板；10)记数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。结果判断：若阴性对照孔斑点数为0-5,且rv2031c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6；或若阴性对照孔斑点数大于等于6,且(rv2031c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)；则待测样本候选感染结核分枝杆菌，为阳性样本；若不满足上述，则待测样本与rv2031c不产生免疫反应，待测样本候选未感染结核分枝杆菌。用上述方法检测表1中35个结核病人待测样本，结果如表1所示。用上述方法检测表2中4个健康人的待测样本，结果如表2所示。对比例：采用oxfordimmunotec(英国)的t-spot试剂盒检测表1所示的35个结核病人待测样本和表2中4个健康人的待测样本，方法与实施例1相同，唯一不同的是设置两个检测孔，且a检测孔为抗原a孔，加入是抗原esat-6，b检测孔为抗原b孔，加入是抗原cfp10。根据抗原a和抗原b孔的反应判断结果:若阴性对照孔斑点数为0-5,且(抗原a斑点数)–(阴性对照孔斑点数)≥6或(抗原b斑点数)–(阴性对照孔斑点数)≥6；或当阴性对照孔斑点数≥6,且(抗原a斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)或(抗原b斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)。则待测样本候选感染结核分枝杆菌，为阳性样本；若不满足上述，则待测样本与抗原a或抗原b不产生免疫反应，待测样本候选未感染结核分枝杆菌。表1为样本及其检测结果表中，-为阴性对照，+为阳性对照孔(加了pha的培养基)，x为rv2031c蛋白检测孔，a为抗原a检测孔，b为抗原b检测孔。表2为健康人样本及其检测结果序号-ab+x1134大于1000120006902302365623404107592表中，-为阴性对照(不加入任何抗原的培养基)，+为阳性对照孔(加了pha的培养基)，x为rv2031c蛋白检测孔。可以看出，rv2031c作为抗原检测，35个临床已经鉴定感染结核分枝杆菌的待测样本中29例为rv2031c蛋白检测感染结核分枝杆菌的样本，这与临床鉴定结果一致。但是其余6个样本没有检测出来，因此，本发明用rv2031c作为抗原检测是否感染结核分枝杆菌的检出率达83％。4个健康人样本中均未检出结核分枝杆菌，这与临床鉴定结果一致。对比例检测35个临床已经鉴定感染结核分枝杆菌的待测样本，其中27例为对比例检测感染结核分枝杆菌的样本，这与临床鉴定结果一致；但是其余8个样本没有检测出来。因此，对比例检测是否感染结核分枝杆菌的检出率仅为77％，远远低于rv2031c作为抗原检测。对比例中4个健康人样本中2例未检出结核分枝杆菌，这与临床鉴定结果不同。从上述实验可以看出，rv2031c蛋白可以检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌，具体如下：以rv2031c蛋白作为抗原，通过结核感染t细胞检测试剂盒检测，以细胞培养基作为阴性对照孔，若阴性对照孔斑点数为0-5,且rv2031c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥6；或若阴性对照孔斑点数大于等于6,且(rv2031c检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数)≥2×(阴性对照孔斑点数)；则待测样本候选感染结核分枝杆菌，为阳性样本；若不满足上述，则待测样本与rv2031c不产生免疫反应，待测样本候选未感染结核分枝杆菌。序列表<110>广东体必康生物科技有限公司<120>用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白rv2031c<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>432<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atggccaccacccttcccgttcagcgccacccgcggtccctcttccccgagttttctgag60ctgttcgcggccttcccgtcattcgccggactccggcccaccttcgacacccggttgatg120cggctggaagacgagatgaaagaggggcgctacgaggtacgcgcggagcttcccggggtc180gaccccgacaaggacgtcgacattatggtccgcgatggtcagctgaccatcaaggccgag240cgcaccgagcagaaggacttcgacggtcgctcggaattcgcgtacggttccttcgttcgc300acggtgtcgctgccggtaggtgctgacgaggacgacattaaggccacctacgacaagggc360attcttactgtgtcggtggcggtttcggaagggaagccaaccgaaaagcacattcagatc420cggtccaccaac432<210>2<211>144<212>prt<213>1<400>2metalathrthrleuprovalglnarghisproargserleuphepro151015gluphesergluleuphealaalapheproserphealaglyleuarg202530prothrpheaspthrargleumetargleugluaspglumetlysglu354045glyargtyrgluvalargalagluleuproglyvalaspproasplys505560aspvalaspilemetvalargaspglyglnleuthrilelysalaglu65707580argthrgluglnlysasppheaspglyargsergluphealatyrgly859095serphevalargthrvalserleuprovalglyalaaspgluaspasp100105110ilelysalathrtyrasplysglyileleuthrvalservalalaval115120125sergluglylysprothrglulyshisileglnileargserthrasn130135140当前第1页12