宽荧光光谱和MRI双影像功能微球示踪间充质干细胞及应用的制作方法

本发明涉及纳米荧光探针和干细胞技术领域，尤其涉及一种宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞及应用。

背景技术：

目前，骨质疏松症、骨质疏松性骨折等疾病已经受到广泛关注的全球性公共健康问题，早期准确的诊断、合理的治疗以及治疗效果监测对预防或降低骨质疏松导致的脆性骨折至关重要。骨质疏松症的发病机理尚不明确，一般认为是由于骨稳态平衡被打破，破骨细胞和成骨细胞数目和功能失衡，骨吸收大于骨形成，而最终引起骨质疏松。骨质疏松症常伴间充质干细胞增殖和成骨分化能力的下降，成骨细胞成骨能力降低。从而导致骨量减少，局部出现骨质疏松性骨缺损。

人脐带间充质干细胞(mscs)由新生儿脐带分离培养，来源丰富，取材方便。体外培养、体内植入均有多向分化潜能、增殖分化能力强、免疫原性低等特性，是骨组织工程中修复骨缺损的理想种子细胞。

近年来，寻求植入体内的人间充质干细胞标记和示踪方法，并且辨别受体中人间充质干细胞的生存情况，仍然是当今观察和评估干细胞应用于骨缺损修复的热点研究问题。大量研究表明将人间充质干细胞植入活体内，促进间充质干细胞成骨分化，改善骨质疏松部位的骨结构，有效修复疾病、创伤导致的骨或软骨缺损，在未来骨质疏松症的治疗中有着广泛的应用价值。

目前，具有优良光学特性并且运用于光学成像的纳米材料包括金纳米颗粒、量子点、多孔二氧化硅纳米颗粒、纳米碳管、聚合物荧光微球等，其中荧光微球示踪的优越性在于：稳定形态结构，粒径分布集中(50-300nm)；稳定而高效的发光效率；具有优良的生物降解性和生物相容性；小分子荧光素体内代谢率大大降低。因此，荧光微球示踪在分子影像技术领域得到广泛关注和高度重视。

荧光共振能量转移(fret)是指在供体(donor)基团受到激发后，偶极子介导的能量从供体转向受体(acceptor)，光子未曾介入该过程，因此这一过程是非辐射性的。在供体分子被激发后，如果受体分子与供体分子距离合适(小于10nm)，处于激发状态下的供体会将能量转移给受体，诱使受体激发，在这个转移过程中，不会涉及到光子的发射和重新吸收。常用的荧光素如香豆素、吖啶橙、罗丹明、藻红蛋白之间能依次发生fret效应，已被广泛应用于荧光探针等领域。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞及应用，本发明的微球能提供宽荧光光谱和mri双影像功能，减少动物体内应用时的自体背景荧光的干扰，将所制微球与间充质干细胞共培养，可对其进行示踪，并用于骨缺损、骨质疏松性骨缺损的修复和治疗。本申请中，荧光光谱即为公知的荧光发射光谱。

本发明提供了一种宽荧光发射光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞，间充质干细胞内吞有宽荧光发射光谱和mri双影像功能微球，宽荧光光谱和mri双影像功能微球包括以下质量分数的各组分：聚合物70-99.9％，荧光素0.05-20％，钆剂0.05-10％；聚合物为聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物或聚苯乙烯。微球的粒径为50-300nm。

上述微球中，聚合物作为荧光素和钆剂的载体。优选地，聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物的分子量为10000-100000g/mol，其中聚乙二醇的分子量为2000-5000g/mol，该材料生物相容性好，可降解。聚苯乙烯为交联的聚苯乙烯微球，其表面还可带有羧基或氨基。聚苯乙烯微球微球的粒径为50-200nm，粒径相对标准偏差<10％。

进一步地，微球表面还偶联有修饰化合物，修饰化合物为聚精氨酸、聚赖氨酸、聚酰亚胺或聚乙二胺。聚精氨酸的的重复单元为9。聚酰亚胺的分子量可选择25kg/mol。微球表面的修饰化合物可增加微球进入干细胞的比例，提高微球标记干细胞的荧光亮度。

进一步地，荧光素为香豆素、吖啶橙、罗丹明、藻红蛋白和吲哚菁绿中的两种或三种。优选地，荧光素为香豆素和吖啶橙的组合，吖啶橙、罗丹明和藻红蛋白的组合，藻红蛋白和吲哚菁绿的组合。荧光素之间能发生荧光共振能量转移效应(fret)。

进一步地，钆剂为钆-二乙三胺五乙酸(gd-dtpa)。钆剂具有mri成像功能。

进一步地，当聚合物为聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物时，宽荧光光谱和mri双影像功能微球的制备方法包括以下步骤：

(1)将聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物和荧光素溶解于有机溶剂，作为油相，将钆剂溶于水，作为内水相，将聚丙烯酸和聚乙烯醇溶于水，作为外水相；

(2)通过复乳法利用油相、内水相和外水相制备微球，除尽油相的有机溶剂，得到宽荧光光谱和mri双影像功能微球。

进一步地，在步骤(1)中，有机溶剂为氯仿、二氯甲烷和二氯乙烷中的一种或几种。在步骤(2)中，复乳法操作步骤如下：首先将油相、内水相制成初乳，将初乳加入外水相制得水/油/水的复乳，待油相的有机溶剂挥发除尽，即得到荧光和mri双影像功能微球。

进一步地，当聚合物为聚苯乙烯时，宽荧光光谱和mri双影像功能微球的制备方法包括以下步骤：

将荧光素和钆剂溶于有机溶剂中，向其中加入聚苯乙烯微球，聚苯乙烯纳米微球的粒径范围50-200nm，粒径相对标准偏差<10％；反应24h后除掉有机溶剂，洗涤后，得到宽荧光光谱和mri双影像功能微球。荧光素为吖啶橙、罗丹明、吲哚菁绿。有机溶剂为氯仿和异丙醇的混合物，二者体积比为1:3。洗涤时，采用酒精和水清洗微球直至上清液无明显颜色

进一步地，还包括以下步骤：通过氨酯化反应，将微球与修饰化合物的氨基偶联。

氨酯化反应，可以通过偶联剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)辅助进行。也可以通过戊二醛为交联剂，将修饰化合物的氨基与含氨基的聚苯乙烯微球偶联。

进一步地，宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：

将宽荧光光谱和mri双影像功能微球与细胞培养液混合均匀，得到微球溶液，并在4℃下孵育24h后，加入到已贴壁的间充质干细胞中，在37℃下培养1-4天，用纯培养基洗涤，除去未进入间充质细胞的微球，得到宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞。

进一步地，微球溶液的浓度为0.2-1.0mg/ml。

本发明还公开了上述宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞在制备骨缺损修复和/或骨质疏松疾病的示踪剂和/或治疗剂中的应用。在应用过程中，间充质干细胞具有荧光和mri双影像成像功能。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

荧光共振能量转移法(fret)作为1.0-10.0nm距离范围内的光学分子尺，具有高分辨率、高灵敏度、简单方便等优点。采用可发生fret效应的荧光素组合，微球的荧光发射光谱变宽，利用供体荧光素的最佳激发波长，通过fret效应使受体荧光素发出更强的荧光，因自体荧光波长距离激发光较近，基于fret效应设计的荧光素组合可发出波长更长的荧光，从而削弱自发荧光的影响，降低体内应用时的背景荧光干扰，使微球荧光信号的体内可分辨度提高。核磁共振(mri)已应用于全身各系统的影像诊断。效果最佳的是颅脑，及其脊髓、心脏大血管、关节骨骼和软组织等。mri进行定性及半定量的诊断，可作多个切面图，空间分辨率较高，优于其他x线影像、二维超声、核素及ct检查。本发明的微球同时结合了荧光和mri影像的优点。

本发明使用的间充质干细胞(mscs)，在含有微球的培养液(mscm)中孵育2-4天后，微球被mscs吞噬且在细胞内均匀分布，该细胞能够用于体内示踪。与荧光素和钆剂直接进行细胞标记相比，荧光素和钆剂被聚合物负载后，微球具备低细胞毒性、粒径分布均匀(160-220nm)、易吞噬、更加稳定而高效地在体内循环、良好的生物降解性和生物相容性、提高图像信号比等特性，同时，更有利于发挥宽荧光发射光谱素本身优良的荧光穿透特性，降低对生物组织的损伤。

本发明为宽荧光发射光谱素和钆剂在示踪mscs方面提供了一种直观简便、动态无创的方案，能进一步用于深入观察和证实骨质疏松的发病机制，以及评估mscs在骨质疏松性骨质缺损修复中的应用、骨质疏松的分子影像领域具有广泛的运用前景。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1图示了不同浓度微球溶液对细胞生存率的影响结果；

图2为使用含本发明微球的培养液培育间充质干细胞后，于单光子激光共聚焦显微镜下拍摄的荧光图片；

图3为实施例2中对照组于单光子激光共聚焦显微镜下拍摄的荧光图片；

图4图示了本发明微球示踪的间充质干细胞注入大鼠颅骨后的ct扫描结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明使用的间充质干细胞(mscs)为人脐带来源的间充质干细胞(hucmscs)，该细胞能够提供的强大自我更新能力和增值分化能力。

实施例1

本发明的宽荧光光谱和mri双影像功能微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)称量5mg吖啶橙、10mg罗丹明和25mg聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物(plga-peg)混合，用1ml氯仿/异丙醇(体积比为1:3)溶液溶解，得到油相。准备100μl100mg/ml的gd-dtpa造影剂水溶液作内水相。

(2)将步骤(1)得到的油相和内水相超声混合5次，每次2s，(100w，bilon92-ii)，得到初乳剂。

(3)向步骤(2)的产物加入4ml聚乙烯醇(pva)水溶液(5wt％)，超声混合5次(2s，100w)形成复乳剂。

(4)将步骤(3)的产物稀释到聚丙烯酸(paa)水溶液中(5wt％，40ml)，室温下过夜搅拌、避光挥发。

(5)用50ml高速离心管收集步骤(4)含微球溶液，先用无水乙醇清洗一次，高速离心(14500rpm，20min)，弃上清，超声均匀，再加入纯水清洗，高速离心(12000rpm，10min)，重复2-3次，最终所得沉淀即为宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞。

(6)将步骤(5)得到的微球溶于纯水，得到不同浓度的微球水溶液。

上述制备的微球中，包含以下含量的各组分：聚合物70％，荧光素20％，钆剂10％。

实施例2

(1)将hucmscs正常传代培养，在普通细胞培养皿皿底铺相应规格爬片。

(2)将微球(如实施例1制备的微球)与mscm培养基混合，配成微球培养液(0.2-1mg/ml)，置于培养箱中(37℃，5％co2)孵育24h。

(3)24h后，间充质干细胞贴壁，吸除培养液，加入相同体积的培养液(0.2-1mg/ml)，置于培养箱(37℃，5％co2)，继续培养2-4天，优选2天。

微球对mscs细胞的毒性影响如图1所示，对照组为纯聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物微球，在1.0mg/ml浓度以下，对照组和荧光和mri双功能微球组均未观察到明显毒性，浓度为2mg/ml时，两组细胞死亡率明显增加，因此使用时，微球浓度范围在1mg/ml以下为宜。

(4)2-4天后，去除培养液，pbs清洗2遍后，浸没在5％多聚甲醛中30min，再用pbs清洗两遍，将皿底爬片，制成玻片标本。

(5)利用nuance多光谱影像系统，紫外光激发，采集图片。

(6)单光子激光共聚焦显微镜下观察玻片标本，选择激发光波长488nm，放射波长接收范围500-545nm(绿色green)和550-580nm(红色red)，采集图片，结果如图2所示，图2表明，微球的荧光素间发生了荧光能量共振转移，采用488nm激光时，细胞具有极强的红色荧光。同时以负载吖啶橙的微球被间充质干细胞内吞后的干细胞组作为对照组，按上述方法拍摄荧光图片(图3)，其荧光亮度(红光)很弱，与对照组相比，本发明的干细胞的红色荧光强5-10倍。结合荧光照片数据，微球的浓度在0.2mg/ml以上为佳，可以观察到较明显的荧光信号。

因此，结合微球示踪mscs的荧光强度和毒性数据，使用时，微球的浓度为0.2-1mg/ml为宜。

(7)双光子激光共聚焦显微镜下观察玻片标本，激发波长880nm，观察摄片。

(8)取适量微球溶液注入玻璃细管中(直径2mm，长度10cm，液高2-3cm)，进行mri扫描，对比信号强度。

(9)若步骤(7)(8)得到的荧光强度和信号强度达到示踪标准，将宽荧光光谱和mri双影像功能微球标记的hucmscs(5×10⁵-5×10⁶⁾注入大鼠局部骨缺损区域(颅骨)，双光子共聚焦显微镜连续动态观察，比较荧光/信号强弱和分布，mri扫描评估局部骨缺损修复状况。结果如图4，与对照组(control)相比，本发明的间充质干细胞骨缺损愈合更好，修复效果更佳。

实施例3

本发明的宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)称量0.1mg吖啶橙、0.1mg罗丹明和25mg聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物混合，用1ml氯仿/异丙醇(体积比为1:3)溶液溶解，得到油相。准备10μl1mg/ml的gd-dtpa造影剂水溶液作内水相。

(2)将步骤(1)得到的油相和内水相超声混合5次，每次2s(100w，bilon92-ii)，得到初乳剂。

(3)向步骤(2)的产物加入4mlpva水溶液(5wt％)，超声混合5次(2s，100w)形成复乳剂。

(4)将步骤(3)的产物稀释到paa水溶液中(5wt％，40ml)，室温下过夜搅拌、避光挥发。

(5)用50ml高速离心管收集步骤(4)含微球溶液，先用无水乙醇清洗一次，高速离心(14500rpm，20min)，弃上清，超声均匀，再加入纯水清洗，高速离心(12000rpm，10min)，重复2-3次，最终所得沉淀即为宽荧光发射光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞。

(6)将步骤(5)得到的微球溶于纯水，得到不同浓度的微球水溶液。

上述制备的微球中，包含以下含量的各组分：聚合物99.9％，荧光素0.05％，钆剂0.05％。

实施例4

羧基化聚苯乙烯微球由bangslab公司提供，粒径100nm，相对标准偏差(cv)约为5％；向氯仿/异丙醇(1/3)的溶液中加入聚苯乙烯，氯仿/异丙醇溶液中含有2-4mg/ml吖啶橙、2-4mg/ml罗丹明、2-4mg/ml吲哚菁绿和1-10mg/mlgd-dtpa，反应24h并同时挥发溶剂，待溶剂完全挥发后，用酒精和水清洗微球直至上清液无明显颜色，得到宽荧光发射光谱和mri双影像功能微球。

上述制备的微球中，包含以下含量的各组分：聚合物97.5％，荧光素2％，钆剂0.5％。

同样荧光素用量条件下，可以明显观察到聚苯乙烯微球的荧光亮度更高，因聚苯乙烯对荧光素有更强的吸附作用。同样的，以聚苯乙烯制备的微球对mscs的毒性和以plga类聚合物制备的微球的毒性接近，而以聚苯乙烯制备的微球示踪的mscs荧光信号提高1-2倍，但mri信号要弱20-50％。

实施例5

本发明的宽荧光发射光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)称量2mg吖啶橙、2mg罗丹明、2mg吲哚菁绿，与25mg聚乙丙交酯混合，再用1ml氯仿溶解，得到油相。准备100μlgd-dtpa造影剂作内水相。

(2)将步骤(1)得到的油相和内水相超声混合5次(2s，100w，bilon92-ii)，得到初乳剂。

(3)向步骤(2)的产物加入4mlpva水溶液(5wt％)，超声混合5次(2s，100w)形成复乳剂。

(4)将步骤(3)的产物稀释到paa水溶液中(5wt％，40ml)，室温下过夜搅拌、避光挥发。

(5)用50ml高速离心管收集步骤(4)含微球溶液，先用无水乙醇清洗一次，高速离心(14500rpm，20min)，弃上清，超声均匀，再加入纯水清洗，高速离心(12000rpm，10min)，重复2-3次，最终所得微球沉淀溶于1ml纯水。

(6)均匀抽取10μl步骤(5)溶液，烘干后称量，计算得到步骤(5)微球溶液浓度，以聚乙丙交酯制备的宽荧光发射光谱和mri双影像功能微球的浓度为1-2mg/ml。

(7)抽取100μl所制备的微球溶液，用纯水稀释成2ml，在纳米粒度及zeta电位分析仪(zetasizernanozs90)测得微球粒径，所制微球粒径分布范围为200-300nm。

实施例6

本发明不同浓度的微球对细胞生存率的影响情况的测试方法如下：

(1)96孔板每空接种5000个细胞。

(2)将实施例1所制得微球，用培养液稀释成浓度分别为0.2、0.4、0.8、1、2mg/ml微球溶液，锡箔纸包裹，4℃冰箱过夜孵育。

(3)在不同浓度实验组和空白对照组中分别相应的微球培养液和培养液，分别培养24h、48h。

(4)用多功能酶标仪(synergy2)测得od值，与空白对照相比，统计分析各组细胞存活率，结果显示2mg/ml微球溶液细胞生存率低于空白对照组。

图1为不同浓度微球溶液对细胞生存率的影响结果，对照组为纯聚乙丙交酯-聚乙二醇共聚物空白微球(没有染料和钆剂)，在1.0mg/ml浓度以下，对照组和本发明的微球均未观察到明显毒性，浓度为2mg/ml时，两组细胞死亡率明显增加，因此微球的用量在1.0mg/ml浓度以下为宜。

本发明微球的示踪情况测试方法如下：

(1)3月龄未孕雌性sd大鼠6只行去势手术切除双侧卵巢，术后饲养3个月。

(2)sd大鼠3.6％水合氯醛麻醉后，切开股骨外皮肤，暴露骨膜，用直径为3mm的打孔电钻在股骨皮质上，缓慢匀速凿出深度1mm的圆形骨缺损区域。

(3)将宽荧光发射光谱和mri双功能微球标记好的hucmscs取5×10⁵-5×10⁶个细胞，用30μlpbs重悬，1ml注射器抽取后注入到股骨皮质圆形缺损区域，缝合皮肤。

(4)小动物荧光影像系统、micro-ct、mri定期扫描骨缺损部位的骨质修复状况。

通过连续观察骨缺损区域的荧光变化和骨修复情况，综合多种影像手段，可以阐明示踪干细胞对骨缺损区域的修复过程，得出干细胞修复骨缺损的修复机制。

图4图示了本发明微球示踪的间充质干细胞注入大鼠颅骨后的ct扫描结果，与对照组(control，未做任何处理)相比，本发明微球示踪mscs组骨缺损处骨小梁结构更为致密，骨间隙变窄，骨密度增高，修复后骨缺损区域面积仅为对照组的20-40％左右，证明该组对于骨缺损修复效果更佳。

实施例7

此外，微球表面还可以连接一些修饰化合物，修饰化合物为聚精氨酸、聚赖氨酸、聚酰亚胺或聚乙二胺。修饰化合物能够提高微球的干细胞内吞量。具体修饰方法如下：

向实施例1或4制备的微球溶液中加入聚精氨酸、聚酰亚胺或聚乙二胺，通过氨酯化反应，修饰化合物表面的氨基与微球表面的羧基反应后连接到微球表面。氨酯化反应，可以通过偶联剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)辅助进行。也可以通过戊二醛为交联剂，将修饰化合物的氨基与含氨基的聚苯乙烯微球偶联。将最终所得的微球与间充质干细胞用实施例2中的方法进行培养，得到宽荧光光谱和mri双影像功能微球示踪间充质干细胞。与未修饰组化合物的微球相比，修饰了化合物的微球示踪的间充质干细胞的荧光强度可增加50-100％，mri亮度可增加30-100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。