一种用于荧光仪器校准测量的标准样片及其制备方法与流程

本发明涉及荧光仪器校准测量。更具体地，涉及一种用于荧光仪器校准测量的标准样片及其制备方法。

背景技术：

随着生物技术的不断发展，荧光检测技术(fluorescentdetection)由于其具有荧光定量、结果稳定、灵敏度高、封闭操作、安全便捷等特点，已经广泛地应用于生命科学、医药卫生、食品安全、药理学及生物化学分析等领域。荧光检测是一种自然发光反应，通过荧光素酶与atp进行反应，利用专用设备对光照度进行测量并以数字形式予以表示，迅速得到反应结果，可用于检测人体细胞、细菌、霉菌和食物残渣等。

传统的荧光仪器通常采用激光、氙灯、高压/低压汞灯等光源作为激发光源，通过检测荧光物质受激发后发射光的光谱及信号强弱来进行分析。不同荧光仪器的光源、光路、检测系统的设计与集成各不相同，即使是同一仪器的光源、光路及检测系统也可能因为老化、环境或震动等原因出现细微的变化，从而引起激光光谱发生变化，带来测量误差，影响测量结果。由于荧光检测的灵敏度极高，通常用于痕量检测中，极小的测量误差可能会很大程度上影响测量结果，甚至导致完全相反的结论。因此，制备标准样片并应用其对荧光仪器进行校准测量显得尤为重要。

目前，用于荧光仪器校准测量的标准有按特定浓度配成的液体和固态薄膜等形式。液体标准需要置于玻璃容器之中，应用领域受限。固态薄膜型荧光强度标准样品，将含有荧光材料的薄膜制作于玻璃基片上，可用于荧光显微镜、荧光光谱仪等多种生物荧光检测仪器的日常校准和仪器间比对。但是，这种标准样品通常只含有一种特定的荧光强度，当需要标定多个荧光强度时，需要更换多个不同强度的标准样品，操作不便其标准样片的利用率低。

为了简化操作过程，提高标准样片的利用率，提出了包含多个荧光强度区域的标准样片。其中，不同荧光强度区域用于标定不同的荧光强度，使得在不更换标准样品的情况下对荧光检测仪的荧光强度、线性度、饱和度等关键参数进行测试成为可能。为了获得具有不同荧光强度区域的标准样品，通常将不同区域的荧光薄膜层设置为不同厚度或不同浓度。具体地，如果将荧光薄膜层设置为不同厚度，需要采用多次匀胶、多次曝光和一次显影的方法制作同一浓度多个厚度的荧光材料薄膜，其操作的次数与荧光强度区域的个数正相关，特别是制作包含荧光强度值多的标准样品时，其操作将异常繁杂。如果将荧光薄膜层设置为不同浓度，通常使用微阵列点样仪或旋涂加丝网印刷等相对较为简单的方法将不同浓度的荧光材料溶液涂覆于基片表面，从而形成具有大约等同厚度和不同荧光强度的点阵。但是，其并不能精准控制标准样品不同浓度的荧光材料薄膜厚度一致性，导致实际荧光强度不能得到精准控制而影响校准测量结果。另外，采用这种方式获得的标准样片只能制作大尺度的圆形图形，并不能制作含有复杂图案的小尺度图形。

因此，需要提供一种包含多个荧光强度区域的标准样片，能够简化制作过程，同时保证对荧光强度的精准控制，满足制作含有复杂图案的小尺度图形的要求。

技术实现要素：

为了克服上述缺点，本发明的一个目的在于提供一种包含厚度相同的多个荧光强度区域，制作过程简单且满足复杂图案的小尺度图形要求的标准样片。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于荧光仪器校准测量的标准样片，包括

基板；及

荧光薄膜，设置于基板上且包括具有不同荧光强度的多个荧光强度区域；多个荧光强度区域中每个荧光强度区域具有特定的荧光染料填充占空比。

优选地，基于微纳加工技术获得特定的荧光染料填充占空比。

优选地，荧光强度区域包括多个与像素对应的重复单元，同一荧光强度区域中的重复单元具有相同的荧光染料填充占空比。

进一步优选地，重复单元尺寸小于或等于像素尺寸。

进一步优选地，像素为人眼像素或ccd像素。

进一步优选地，采用光刻、纳米压印或电子束曝光获得重复单元。

进一步优选地，光刻时，与重复单元对应的光刻板中透光或不透光部分的占空比与重复单元的荧光染料填充占空比相同。

进一步优选地，光刻胶为混有荧光材料的光敏高分子材料。

优选地，标准样片表面涂覆有保护层。

本发明的另一个目的在于提供一种制作过程简单、对荧光强度控制精准的用于荧光仪器校准测量的标准样片的制备方法，包括：

制备基板；

在基板上制作荧光薄膜，具体包括：

在荧光薄膜上形成具有不同荧光强度的多个荧光强度区域；

基于微纳加工技术在每个荧光强度区域上形成多个与像素对应的重复单元，使同一荧光强度区域中的重复单元具有相同的荧光染料填充占空比。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于荧光仪器校准测量的标准样片及其制作方法，通过利用微纳加工技术，精确控制调整荧光薄膜表面上每个像素对应区域内的荧光染料填充占空比，在一个标准样片上获得多个厚度相同的荧光强度区域，且每个荧光强度区域具有精准可控的特定的荧光染料填充占空比，使获得复杂图案的小尺度图形成为可能。简化了制作工艺，优化了校准测量过程，提高了不同荧光强度区域图形的复杂度和精细度，能够获得更多更加精准的荧光强度，改善了荧光仪器校准测量标准样片的可用性。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出实施例1中用于荧光仪器校准测量的标准样片结构示意图。

图2示出实施例2中第一重复单元结构示意图。

图3示出实施例2中第二重复单元结构示意图。

图4示出实施例2中第三重复单元结构示意图。

图5示出实施例2中第四重复单元结构示意图。

图6示出另一种重复单元结构示意图。

图7示出又一种重复单元结构示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的属于“第一”、“第二”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述特定顺序。此外，术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一些列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可选地还包括没有列出的步骤或单元，或可选地还包括对于这些过程、方法或设备固有的气体步骤或单元。

本发明中，通过利用微纳加工技术，精确控制调整荧光薄膜表面上每个像素对应区域内的荧光染料填充占空比，在一个标准样片上获得多个厚度相同的荧光强度区域，且每个荧光强度区域具有精准可控的特定的荧光染料填充占空比，使获得复杂图案的小尺度图形成为可能。

本发明中，荧光染料填充占空比是指荧光薄膜中荧光染料填充部分面积与荧光薄膜面积的比值。

实施例1

如图1所示，一种用于荧光仪器校准测量的标准样片，包括基板10及荧光薄膜20。所述荧光薄膜20设置于基板上10且包括具有不同荧光强度的多个荧光强度区域，多个荧光强度区域中每个荧光强度区域具有特定的荧光染料填充占空比。

应说明的是，本发明中，多个荧光强度区域中每个荧光强度区域具有特定的荧光染料填充占空比是指不同的荧光强度区域具有不同的荧光染料填充占空比。

在本实施例中，基板10为玻璃基板，荧光薄膜20例如包括四个荧光强度区域，分别为第一荧光强度区域210、第二荧光强度区域220、第三荧光强度区域230和第四荧光强度区域240。每个荧光强度区域具有特定的荧光染料填充占空比，例如第一荧光强度区域210的荧光染料填充占空比为25％，第二荧光强度区域220的荧光染料填充占空比为50％，第三荧光强度区域230的荧光染料填充占空比为75％和第四荧光强度区域240的荧光染料填充占空比为100％。

本发明中，通过对不同荧光强度区域的荧光染料填充比进行精确控制，能够获得确定荧光强度的荧光强度区域，且各荧光强度区域具有精准的薄膜厚度，实现了实际荧光强度的精确控制。相对于现有传统的简单工艺，克服了只能制作大尺度圆形图形的缺陷，使得制作小尺度的含有复杂图案的图形成为肯能。

实施例2

一种用于荧光仪器校准测量的标准样片，包括基板10及荧光薄膜20。所述荧光薄膜20设置于基板上10且包括具有不同荧光强度的多个荧光强度区域，荧光强度区域包括多个与像素对应的重复单元，同一荧光强度区域中的重复单元具有相同的荧光染料填充占空比。

如图2-图5所示，本实施例中，例如荧光薄膜20包括四个荧光强度区域，分别为第一荧光强度区域210、第二荧光强度区域220、第三荧光强度区域230和第四荧光强度区域240。例如，第一荧光强度区域210包括m个第一重复单元，第二荧光强度区域220包括n个第二重复单元，第三荧光强度区域230包括p个第三重复单元，第四荧光强度区域240包括q个第四重复单元。其中，第一重复单元的荧光染料填充占空比为25％，第二复单元的荧光染料填充占空比为50％，第三重复单元的荧光染料填充占空比为75％和第四重复单元的荧光染料填充占空比为100％。

上述m、n、p、q为自然数，且其由荧光强度区域与像素尺寸的对应关系决定。本实施例中，设定重复单元尺寸小于或等于像素尺寸，像素为人眼像素或ccd像素。基于此，根据选定的荧光强度区域大小包含重复单元大小个的个数确定上述m、n、p和q。上述ccd像素是指ccd/cmos上光电感应元件的单元，经过光电信号转换、a/d转换等步骤后，在输出的照片上形成一个点，这些点是构成整个画面的最小单位。在视野范围内，ccd上每个像素点与荧光标准样片的实物端的特定尺寸区域是一一对应的，通过在荧光标准样片上与像素点对应的尺寸内调整荧光染料填充占空比可以实现调整此区域的荧光强度等级。

重复单元为可重复的任意图形如方形。本实施例中，重复单元为方形，且每个重复单元的方形中包括a区域、b区域、c区域和d区域。为了获得上述荧光染料填充占空比，可以设置第一荧光强度区域210中m个第一重复单元的a区域为荧光染料；第二荧光强度区域220中n个第二重复单元的a区域和b区域为荧光染料；第三荧光强度区域230中p个第三重复单元的a区域、b区域和c区域为荧光染料；第四荧光强度区域240中q个第四重复单元的全部四个区域为荧光染料。

应说明的是，不同荧光强度区域的面积和/或形状可以相同或不相同，其荧光强度值应根据校准检测需要而设定，并不限于本发明实施例中数值。如图6和图7所示，不同荧光强度区域中的重复单元具有相同的大小。每个荧光强度区域中具有相同的重复单元，且不同荧光强度区域中的重复单元可以相同或者不相同，例如第一重复单元中包括四个区域，第二重复单元中包括两个区域等。进一步地，本实施例中个，对重复单元中区域的划分并不做限定，如重复单元中子区域可以为长方形、正方形或其他可获得特定荧光染料填充占空比的图形。

实施例3

在上述实施例1和实施例2的基础上，为了提高无机荧光材料在基板上的牢固程度，可在形成荧光薄膜的基板表面涂覆保护层，常用保护层为聚甲基硅氧烷(pdms)膜或聚乙烯醇(pva)膜等透明的低荧光背景膜，膜的厚度应小于50微米。

实施例4

本发明还提供一种制作过程简单、对荧光强度控制精准的用于荧光仪器校准测量的标准样片的制备方法，包括：

s100：制备基板，本实施例中基板为玻璃基板；

s200：在基板上制作荧光薄膜，具体包括：

s201：在荧光薄膜上形成具有不同荧光强度的多个荧光强度区域；

s202：基于微纳加工技术在每个荧光强度区域上形成多个与像素对应的重复单元，使同一荧光强度区域中的重复单元具有相同的荧光染料填充占空比。

实施例5

在光刻时，使与重复单元对应的光刻板中透光或不透光部分的占空比与重复单元的荧光染料填充占空比相同。

在实施例4的基础上，该标准样片的制备方法具体包括：

1)、量取1～100ml荧光材料，例如但不限于cy3，使其均匀分布于100ml的光敏高分子材料中，例如但不限于su-8；

2)、取10ml以上混合溶液，旋涂于玻璃基板上，并在100℃下烘烤5分钟；

3)、制作重复单元为0.5～2μm的光刻板，该重复单元的尺寸小于或等于人眼或ccd像素的尺寸，光刻板上包括多个荧光强度区域，且每个荧光强度区域中重复单元的透光或不透光部分的占空比为相同的特定值；

4)、使用上述光刻板对旋涂有光敏荧光材料的玻璃基板进行曝光，曝光时间根据图层厚度和光刻机的光功率综合确定；

5)、显影得到需要的含有多个特定微纳结构区域的荧光材料层。

本实施例中，通过掩模的制备达到上述效果。掩模的制备是光刻中的关键步骤之一，其作用是在一个平面上有选择性的阻挡紫外光的通过，从而实现光刻胶的局部曝光。掩模的图形及尺度按照上述实施例的设定由计算机设计完成，常用的设计软件有l-edit和autocad等。带有图形结构的掩模常用介质有透明膜和玻璃板，图形结构一般由透明和不透明的区域组成，掩模有时也被称作原图或光刻版。

本实施例中，根据重复单元的尺寸确定掩膜的制备方法：

1、当分辨率要求不高时，掩模可用简单的方法来制备。最常用的方法是使用高分辨率的激光照排机(3000dpi以上)将图形打印在透明胶片上，这种方法的误差一般为3-7μm，视激光照排机的精度而定。当图形的尺度为10μm量级时，此法制成的掩模可近似视为精确。

2、当分辨率要求较高时，通过电子束曝光的方法可以得到精度更高的掩模版，精度可达100nm甚至10nm级。这种掩模版为金属掩模，所以不论是精度、寿命还是使用时的方便程度，均要优于打印方法制成的模版。应说明的是，还有其他一些方法可以得到掩模版，如纳米压印、准分子激光刻蚀和光学缩小等方法。

应说明的是，本发明还可以直接应该用纳米压印和电子束曝光等技术获得重复单元。

实施例6

不同于实施例5采用的荧光材料均匀分布于光敏高分子材料中，本实施例中分别使用荧光材料和光敏高分子材料进行光刻和曝光。

该标准样片的制备方法具体包括：

1)、量取1～100ml荧光材料，例如但不限于cy3，旋涂于玻璃基板上；

2)、量取100ml光敏高分子材料旋涂于荧光材料上，例如但不限于su-8，并在100℃下烘烤5分钟；

3)、制作重复单元为0.5～2μm的光刻板，该重复单元的尺寸小于或等于人眼或ccd像素的尺寸，光刻板上包括多个荧光强度区域，且每个荧光强度区域中重复单元的透光或不透光部分的占空比为相同的特定值；

4)、使用上述光刻板对旋涂有光敏荧光材料的玻璃基板进行曝光，曝光时间根据图层厚度和光刻机的光功率综合确定；

5)、显影得到需要的含有多个特定微纳结构区域的荧光材料层，刻蚀并去除残留的光刻胶，得到标准样片。

光刻胶采用正型光刻胶或负型光刻胶。对应地，当采用正型光刻胶时，在曝光时聚合物发生链断裂分解而变得更容易溶解，每个荧光强度区域中重复单元的不透光部分的占空比为相同的特定值；当采用负型光刻胶时，在曝光时发生交联反应形成较曝光前更难溶的聚合物，每个荧光强度区域中重复单元的透光部分的占空比为相同的特定值。

应用本发明中的用于荧光仪器校准测量的标准样片，能够精确控制调整荧光薄膜表面上每个像素对应区域内的荧光染料填充占空比，在一个标准样片上获得多个厚度相同的荧光强度区域，且每个荧光强度区域具有精准可控的特定的荧光染料填充占空比，使获得复杂图案的小尺度图形成为可能。简化了制作工艺，优化了校准测量过程，提高了不同荧光强度区域图形的复杂度和精细度，能够获得更多更加精准的荧光强度，改善了荧光仪器校准测量标准样片的可用性。

实际中，生物芯片荧光检测仪器需要经常使用生物荧光强度标准样片进行校准以尽可能降低测量误差，单片包含多个荧光强度区域的标准样片由于能够在不更更换样片的情况下对荧光检测仪器的荧光强度、线性度和饱和度等关键参数进行测试，因此，能够使实际的测量和校准过程更为便捷。

以对荧光显微镜的线性度的测试为例进行说明如下：当光束照射到标准样片并反射经荧光显微镜收集，ccd上光电感应元件经过光电信号转换和a/d转换等步骤，不同荧光强度区域对应不同的接收强度。若标准样片不同荧光强度区域对应的接收强度关系与各荧光强度区域的荧光强度关系在误差范围内具有一致性，则说明该荧光显微镜具有良好的线性度。

本发明实施例中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。