基于高效液相色谱‑串联四极杆质谱测定动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留量的方法与流程

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种基于高效液相色谱-串联四极杆质谱测定动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留量的方法。
背景技术：
：寄生虫感染是危害畜禽生产和畜牧业发展的重要疾病，其防治以药物为主。作为新型氨基乙腈衍生物类驱虫药莫奈太尔(monepantel，mop)口服液(商品名)2009年9月首先在欧洲批准上市，用于治疗和控制羊肠道蠕虫感染。随后，该药在澳大利亚、新西兰和巴西等国家上市。该药物特定地作用于线虫特有的烟碱乙酰胆碱受体亚科acr－23蛋白，具有快速、高效和渗透性神经肌肉效应，通过引起体壁肌肉过度收缩导致咽前部麻痹、痉挛性收缩并最终死亡，可以有效杀灭耐受其他类别药物的线虫。由于哺乳动物中没有该受体，因此莫奈太尔对除线虫之外的其他有机体均表现为低毒性。莫奈太尔经口给药后，在动物体内被快速吸收并快速氧化为亚砜，亚砜又进一步被氧化为砜。国外已有大量研究表明该药具有较好的驱虫效果，同时还制定了莫奈太尔的最大残留限量。欧盟37/2010规定：牛羊肌肉0.7mg/kg,牛羊肝脏5mg/kg,牛羊肾脏2mg/kg，牛羊奶0.17mg/kg。该法规已于2013年6月29日生效。2015年cac在第38次会议通过了新增莫奈太尔药物列入《食品中兽药残留的最大残留限量和风险管理建议》。cac规定了：莫奈太尔的最大残留限量分别为：羊肌肉0.5mg/kg,羊肝脏7mg/kg,羊肾脏1.7mg/kg。我国尚未制定出动物组织中莫奈太尔的最大残留限量。我国在国家标准和各行业标准中尚未有关于动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留量的检测方法标准，尚未发现有关动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留检测的公开文献。为了更好的进行监管，促进我国进出口贸易更好的发展，保障我国进出口食品的安全，保障我国消费者的健康，建立动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留量的检测方法是非常必要的，具有重要的实践和应用价值。目前，尚未有检测在动物组织中的莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的相关研究及报道。因此，建立快速准确测定动物组织中的莫奈太尔及其代谢物残留量的检测方法已迫在眉睫，以保障食品安全，促进人体健康。技术实现要素：本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简便、灵敏度高、抗干扰能力强、定性定量准确、回收率和重复性良好的测定动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留量的方法。为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：一种基于高效液相色谱-串联四极杆质谱测定动物组织中莫奈太尔及其代谢物残留量的方法，其包括以下步骤：步骤1：配制标准溶液；步骤2：处理并净化动物组织样品；步骤3：使用高效液相色谱-串联四极杆质谱进行测定。所述的莫奈太尔及其代谢物包括莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和/或莫奈太尔砜。莫奈太尔的化学结构式如下：莫奈太尔亚砜的化学结构式如下：莫奈太尔砜的化学结构式如下：作为一种优选的实施方式，所述动物组织包括但不限于肌肉组织、肝脏组织和肾脏组织。作为一种优选的实施方式，所述步骤1包括配制标准储备液、混合标准中间液、标准工作液和定容液。进一步，配制所述标准储备液的步骤为：分别准确称取适量莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜标准品置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100mg/l的标准储备液。进一步，配制所述标准中间液的步骤为：分别吸取适量的标准储备液至50ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/l标准中间液。进一步，配制所述标准工作液的步骤为：吸取一定量的10mg/l标准中间液，用甲醇逐级稀释配制成100μg/l的标准工作液。进一步，配制所述定容液的步骤为：以90ml甲醇和10ml0.5mmol/l乙酸铵溶液的比例，将二者混合摇匀。作为一种优选的实施方式，所述步骤2中，处理并净化所述动物组织的具体操作如下：称取动物组织试样5.00g至50ml的离心管a中，加入15ml乙腈，超声10min,均质提取30s，提取液以4000r/min离心5min。上清液转移至另一50ml离心管b中；取一50ml离心管c,加入10ml乙腈以洗涤匀浆刀10s；洗涤液转入离心管a中，用玻棒捣碎下层残渣，超声10min,在涡旋振荡器上振荡10min，4000r/min离心5min，上清液合并至离心管b中，用乙腈定容至25ml刻度，摇匀。吸取2ml样品提取液过中性氧化铝固相萃取柱，收集流出液，再用2ml乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集流出液，至10ml试管中，50℃吹氮浓缩至干。残渣用2.0ml定容液溶解，涡旋振荡1min，超声5min。经0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。作为一种优选的实施方式，所述步骤3中的液相色谱条件如下：色谱柱条件为inertsilc8-3，4.6mm×150mm，5μm；流动相为：甲醇为a相，0.5mmol/l乙酸铵溶液为b相；梯度洗脱条件：0～3min时，a由10％升至95％，保持2min；5～5.1min时，a由95％降至10％，保持4.9min；流速为0.80ml/min；柱温为40℃；进样量为5μl。作为一种优选的实施方式，所述步骤3中的质谱条件如下：离子源为电喷雾电离；扫描方式为负离子扫描；监测方式为多反应监测；气帘气压力为173kpa；雾化气压力为345kpa；辅助加热气压力为449kpa；碰撞气压力为76kpa；喷雾电压为－4500v；离子源温度为400℃。作为一种优选的实施方式，所述动物组织中莫奈太尔及其代谢物的检测定量限为5.0μg/kg。优选地，所述莫奈太尔及其代谢物在动物组织中被检测到的质量浓度为0.5～20μg/l。本发明的方法针对的检测药物为莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜，适用的基质动物组织，建立液相色谱-串联质谱法，以增强专利的适用性，易于专利的推广使用。本发明采用高效液相色谱-串联四极杆质谱结合固相萃取等技术，建立了动物组织中莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的检测方法。该方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确，能够为动物组织中莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜的分布状况的监测工作提供技术支持。附图说明图1是经atlantishillic柱分离的莫奈太尔mrm图。图2是经atlantishillic柱分离的莫奈太尔亚砜mrm图。图3是经atlantishillic柱分离的莫奈太尔砜mrm图。图4是经atlantist3柱分离的莫奈太尔mrm图。图5是经atlantist3柱分离的莫奈太尔亚砜mrm图。图6是经atlantist3柱分离的莫奈太尔砜mrm图。图7是经inertsilc8柱分离的莫奈太尔mrm图。图8是经inertsilc8柱分离的莫奈太尔亚砜mrm图。图9是经inertsilc8柱分离的莫奈太尔砜mrm图。图10是莫奈太尔的二级离子碎片扫描质谱图。图11是莫奈太尔亚砜的二级离子碎片扫描质谱图。图12是莫奈太尔砜的二级离子碎片扫描质谱图。图13是牛肉空白中莫奈太尔mrm色谱图。图14是牛肉空白中莫奈太尔亚砜mrm色谱图。图15是牛肉空白中莫奈太尔砜mrm色谱图。图16是牛肉空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔mrm色谱图。图17是牛肉空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔亚砜mrm色谱图。图18是牛肉空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔砜mrm色谱图。图19是羊肝空白中莫奈太尔mrm色谱图。图20是羊肝空白中莫奈太尔亚砜mrm色谱图。图21是羊肝空白中莫奈太尔砜mrm色谱图。图22是羊肝空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔mrm色谱图。图23是羊肝空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔亚砜mrm色谱图。图24是羊肝空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔砜mrm色谱图。图25是牛肾空白中莫奈太尔mrm色谱图。图26是牛肾空白中莫奈太尔亚砜mrm色谱图。图27是牛肾空白中莫奈太尔砜mrm色谱图。图28是牛肾空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔mrm色谱图。图29是牛肾空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔亚砜mrm色谱图。图30是牛肾空白标准添加样品(添加水平5.0μg/kg)中莫奈太尔砜mrm色谱图。图31是莫奈太尔及其代谢物标准溶液的总离子流图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。材料与试剂牛肉；羊肝；牛肾；均由广州市农贸市场购买。莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜美国witega公司；乙腈(色谱纯)，美国tedia公司；乙酸铵(优级纯)，印度fluka公司；去离子水由millipore公司超纯水机制得；中性氧化铝固相萃取柱(1g/3ml)美国色谱科公司，用3ml乙腈活化，备用。仪器与设备uflclc-20a超高效液相色谱仪，日本岛津公司；api4000qtrap三重四极杆串联质谱仪，配esi离子源，美国absciex公司；吹氮浓缩仪，美国zymarkturbovap.lv公司；涡旋振荡器，德国ika公司；3-16k型高速离心机，德国sigma公司。测定方法1.标准溶液配制标准储备液的配制：分别准确称取适量莫奈太尔、莫奈太尔亚砜和莫奈太尔砜标准品置于100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度配制成100mg/l的标准储备液，-18℃冰箱保存。混合标准中间液(10mg/l)：分别吸取适量的标准储备液至50ml容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/l标准中间液。标准工作液的配制：准确吸取一定量的10mg/l标准中间液，用甲醇逐级稀释配制成100μg/l的标准工作液。标准曲线的配制：吸取一定量的标准工作液，用基质空白溶液配制成0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/l系列标准溶液。定容液：量取90ml甲醇和10ml0.5mmol/l乙酸铵溶液，摇匀备用。2.样品处理与净化动物组织的提取与净化称取动物组织(如肌肉、肝脏、肾脏组织)试样5g(精确至0.01g)至50ml的离心管a中，加入15ml乙腈，超声10min,均质提取30s，提取液以4000r/min离心5min。上清液转移至另一50ml离心管b中。取一50ml离心管c,加入10ml乙腈以洗涤匀浆刀10s。洗涤液转入离心管a中，用玻棒捣碎下层残渣，超声10min,在涡旋振荡器上振荡10min，4000r/min离心5min，上清液合并至离心管b中，用乙腈定容至25ml刻度，摇匀。吸取2ml样品提取液过中性氧化铝固相萃取柱，收集流出液，再用2ml乙腈淋洗固相萃取柱，合并收集流出液，至10ml试管中，50℃吹氮浓缩至干。残渣用2.0ml定容液溶解，涡旋振荡1min，超声5min。经0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。3.液相色谱条件色谱柱：inertsilc8-3(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：a:甲醇+b:0.5mmol/l乙酸铵溶液,梯度洗脱条件：0～3min时，a由10％升至95％，保持2min；5～5.1min时，a由95％降至10％，保持4.9min；流速：0.80ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl。4.质谱条件离子源：电喷雾电离(electrosprayionization，esi)；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测(multiplereactionmonitoring,mrm)；气帘气压力(cur)：173kpa；雾化气压力(gs1)：345kpa；辅助加热气压力(gs2)：449kpa；碰撞气压力(cad)：76kpa；喷雾电压(is)：－4500v；离子源温度(tem)：400℃；莫奈太尔及其代谢物的相关质谱参数见表1。监测离子对、碰撞能量、去簇电压、采集时间和保留时间。表1莫奈太尔及其代谢物质谱参数注：带“*”的离子为定量离子。5.液相色谱-质谱/质谱测定和确证按照液相色谱测定条件对标准工作溶液及样液等体积参插进样测定,样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定。图31是莫奈太尔及其代谢物标准溶液的总离子流图。按照液相色谱-质谱/质谱条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的待测物。表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50％＞20％～50％＞10％～20％≤10％允许的相对偏差±20％±25％±30％±50％6.空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。7.结果计算和表述用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：。式中：xi——试样中被测组分含量，单位为微克每千克(μg/kg)；c——由标准曲线得到的样液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；c0——由标准曲线得到的空白试验中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；v——样液最终定容体积，单位为毫升(ml)；m——最终样液所代表的试样质量，单位为克(g)。计算结果保留两位有效数字。结果与讨论莫奈太尔几乎不溶于水，微溶于丙二醇和正辛醇，溶于乙醇，易溶于二氯甲烷和聚乙二醇，发明人选取乙腈进行提取试验。结果发现，对于动物组织，二氯甲烷提取出的脂肪、脂类物质最多，回收较差；乙酸乙酯次之，乙腈的提取效率最高，三种药物的回收率在90-110％之间，同时，还具有沉淀蛋白的作用，能有效去除部分杂质。综合考虑各因素，本实验选择乙腈作为动物肌肉、肝脏和肾脏的提取溶剂。提取液的净化是样品前处理过程中关键的一步,直接关系到方法的定量限和回收率。净化的方式主要有液液分配和固相萃取(spe)两种方式。本发明采用中性氧化铝二种固相萃取小柱的净化方式，填料为中性氧化铝的小柱，净化效果最佳，同时保证了较高的回收。此外，本发明还考察了淋洗体积的选择。spe是利用选择性吸附和选择性洗脱的液相色谱分离原理。本发明采用中性氧化铝固相萃取小柱净化的原理是选择性吸附杂质，而让被测化合物流出。发明人发现，采用2ml乙腈进行洗脱的回收率比采用0ml乙腈进行洗脱的回收率提高了3.9％～9.7％，洗脱体积增加，各药物的回收率没有明显变化，为避免spe小柱上吸附的杂质被洗脱下来和减少后续实验时间，洗脱体积为2ml乙腈。在相同的色谱分离条件下分别使用inertsilc8柱、atlantishillic柱和atlantist3柱。结果如图1至图9所示:在采用atlantishillic柱进行分离时，莫奈太尔及其代谢物(莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜)在1.8min初完成了分离，峰形严重拖尾且开叉，峰宽达0.8min。采用atlantist3柱进行分离时，莫奈太尔及其代谢物(莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜)在8min处开始分离，峰形较差，峰宽达0.4min～0.55min。而在inertsilc8柱上获得了理想的分离效果，峰形尖锐对称。流动相的组成和比例对被分离组分的色谱峰型及分离度有重要影响。流动相的组成与色谱柱及被分离的组分有关,流动相的洗脱能力由其极性决定,强极性的流动相占据吸附中心的能力强,其洗脱能力强,使组分的k值小,保留时间短。对于电喷雾质谱的负离子模式，流动相只能选择ph值较高的具有可挥发性的盐类或者水。采用甲醇作为有机相时莫奈太尔及其代谢物(莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜)的灵敏度优于乙腈；当水相乙酸铵浓度高于0.5mmol/l时，莫奈太尔及其代谢物灵敏度下降。此外，采用甲醇-0.5mmol/l乙酸铵体系进行分离时莫奈太尔和莫奈太尔亚砜的灵敏度比甲醇-水体系增强了18％和16％，莫奈太尔砜则没有明显变化。综合考虑分离度、保留时间和色谱峰形等因素，本发明采用甲醇-0.5mmol/l乙酸铵作为流动相，分离结果如图7、图8、图9所示。用蠕动泵以10μl/min的流速分别连续注射0.5mg/l的莫奈太尔及其代谢物(莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜)标准溶液入esi离子源中，在负离子检测模式下对莫奈太尔及其代谢物(莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜)进行一级质谱分析，得到莫奈太尔及其代谢物准分子离子峰(如图31所示)：莫奈太尔准分子离子峰(m/z472)和莫奈太尔亚砜准分子离子峰(m/z488)和莫奈太尔砜准分子离子峰(m/z504)。分别对准分子离子峰进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，选取2个丰度强、稳定的碎片离子作为定性与定量离子,以满足欧盟2002/657/ec[17]对于lc-ms/ms方法的定性监测的规定,即满足1个母离子、2个子离子共4个鉴定点数的要求。莫奈太尔的特征碎片离子分别为m/z186和m/z166，莫奈太尔亚砜的特征碎片离子分别为m/z186和m/z166，莫奈太尔砜的特征碎片离子分别为m/z186和m/z166，最终选择响应高、基线噪音低的离子对m/z472/186，m/z488/186和m/z504/186为定量离子对。莫奈太尔及其代谢物(莫奈太尔亚砜、莫奈太尔砜)的二级质谱图见图10至图12。线性范围和定量限在上述实验条件下，取一系列不同浓度的莫奈太尔及其代谢物标准溶液，以莫奈太尔及其代谢物响应峰面积与内标响应峰面积之比对莫奈太尔及其代谢物的浓度进行线性回归，结果表明，当莫奈太尔及其代谢物的浓度在0.5～20μg/l范围内，线性关系良好，其回归方程、相关系数见表3。表3回归方程、相关系数本实验选择空白的动物组织样品，当添加水平为5.0μg/kg时，信噪比大于10，表明其定量限(loq)可达到5.0μg/kg，空白样品及定量限色谱图见图13至图30。当样品中的莫奈太尔及其代谢物浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。方法的回收率和精密度选用未含有莫奈太尔及其代谢物的牛肉、羊肝、牛肾样品分别进行添加回收率和精密度实验，添加水平为5.0、10、50μg/kg，按上述方法进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率。回收率和精密度结果见表4。三个添加水平的平均回收率在90.2％～107.3％之间，相对标准偏差为2.0％～6.3％。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。表4动物组织中莫奈太尔及其代谢物的加标回收率与精密度(n＝6)实际样品的测定结果按照本发明的方法分别对目前市场销售的10份牛肉、10份羊肝、10份牛肾样品进行了测定，均没有检出莫奈太尔及其代谢物。由以上可见，本发明涉及固相萃取高效液相色谱-串联质谱测定动物组织中的莫奈太尔及其代谢物的方法。该方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，测定结果准确可靠，适用于动物肌肉、肝脏和肾脏等动物组织中莫奈太尔及其代谢物的测定。当前第1页12