一种黄曲霉毒素B1免疫快速检测装置和检测方法与流程

本发明涉及一种基于均相免疫反应和磁分离技术的黄曲霉毒素b1一体化快速检测装置和检测策略，属于免疫检测
技术领域：
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背景技术：
：随着社会经济的发展和科学技术水平的提高，人类对身体健康和安全愈来愈重视。目前许多消费者身体处于亚健康状态，这一现状食品和环境的安全程度有着直接或间接的联系。更为严重的是，部分食品和环境有毒有害物质还可能诱发血液病和癌症等恶性疾病，对消费者生命安全造成威胁。黄曲霉毒素b1是主要由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的极毒的次生代谢产物，主要存在于粮油和动植物食品中，花生和玉米污染最为严重，在高温高湿地区的粮油及制品中具有很高的检出率。黄曲霉毒素b1是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，结构中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，是已知的化学物质中致癌性最强的一种。其致癌能力为二甲基亚硝胺的75倍，比二甲基偶氨苯高900倍。对人和动物具有强烈的毒性，其毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍，慢性毒性可诱发癌变，主要是对肝脏的损害。在天然食物中以黄曲霉毒素b1最为多见，危害性也最强，国家质检总局规定黄曲霉毒素b1是大部分食品的必检项目之一。我国对玉米、花生、花生油中黄曲霉毒素b1的限量为20ng/g。欧盟等国对粮食、花生及其产品中人类直接使用的花生中黄曲霉毒素b1限量为2ng/g，作为食品原料进口的花生中限量为8ng/g。目前对于黄曲霉毒素b1的检测方法主要是薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱串联质谱法等仪器分析方法和常规酶联吸附免疫分析方法(elisa)。仪器分析方法灵敏度高，但是仪器昂贵、样品前处理复杂、耗时、需要专业人员操作，难以满足大量样品快速简便检测的需要。相比于仪器方法，免疫分析方法则具有成本低、操作简便、特异性高、高通量等优点，更适用于大量样品的现场即时监测。然而，elisa方法仍需要繁琐的分离和洗涤步骤，使得检测时间仍较长，更为简便快捷的检测方法研发是免疫分析检测当前的研究热点和难点。为了使免疫检测的流程更加简单，操作更加简便，本发明采用新型一体化快速检测装置，通过抗原抗体特异性结合、均相反应、磁分离等策略，将极大地简化常规elisa方法的检测步骤，使得检测更为简便快捷。本发明将实现黄曲霉毒素b1的简便快捷、高灵敏度、一体化定量检测，该检测装置和检测策略的发展对于免疫分析技术具有重要的推动和现实意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新型一体化免疫快速检测装置和检测策略，实现黄曲霉毒素b1的均相磁分离免疫分析检测，极大地简化检测程序和提高检测效率，为食品和环境样品中有毒有害物质快速检测提供新技术和新思路。本发明的技术方案：本发明主要包括检测装置制备、检测策略和检测程序三方面，技术方案如下：一种黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置，所述黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置包括样品室、洗涤室和检测室，作为三个功能区，所述样品室、洗涤室和检测室均设有一个盖板，用于加样和取样；所述样品室与洗涤室之间、洗涤室与检测室之间均通过孔道相连通，所述孔道处均设有玻璃插板，实现相邻功能区之间的隔离，互不干扰。进一步，所述样品室、洗涤室和检测室均为梭形。进一步，所述样品室、洗涤室和检测室尺寸均为(40-80)mm×(8-20)mm×(6-20)mm。所述样品室、洗涤室和检测室的有效容积均为300-500μl。所述孔道尺寸为1.5-3mm。所述玻璃插板的尺寸均为(1-2)mm×(0.5-1.5)mm×(5-15)。所述黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置的材质为聚二甲基硅氧烷(pdms)。所述黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置的模具是由镀铬青铜制成。所述黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置的制作方法如下：将聚二甲基硅氧烷预聚物倒入模具，70-80℃静置40-70min，冷却获得所述黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置。检测原理由样品室、洗涤室和检测室这三个功能区构成的一体化检测装置为简便快捷的免疫检测提供了基础条件。在样品室中抗原-磁性纳米颗粒探针、抗体-hrp探针、目标分析物三者间进行抗原抗体特异性免疫反应，形成磁性纳米颗粒-抗原-抗体-hrp复合物；通过磁分离和转移，将复合物转移至洗涤室进行洗涤，将复合物转移至检测室进行显色和读数。标准品/待检测溶液中的目标分析物浓度，与复合物浓度成反比例关系，随着目标分析物浓度降低，显色程度逐渐加深(如图1)。利用所述黄曲霉毒素b1免疫快速检测装置检测黄曲霉毒素b1的检测方法，步骤如下：步骤1、制备功能化探针将30-100mg商品化fe3o4磁性纳米颗粒(平均粒径为50-100nm)加入3-10ml无水乙醇中，室温超声10-15min获得均匀悬浮液，加入20-50μl3-氨丙基三乙基硅烷(aptes)室温搅拌5-8h，分离获得氨基化磁性纳米颗粒；通过碳二亚胺法将氨基化磁性纳米颗粒和黄曲霉毒素b1抗原(黄曲霉毒素b1半抗原与鸡卵清蛋白偶联物)偶联，纯化获得抗原-磁性纳米颗粒探针；通过过碘酸钠法将黄曲霉毒素b1单克隆抗体和辣根过氧化物酶(hrp)偶联，纯化获得抗体-hrp探针；将抗原-磁性纳米颗粒探针和抗体-hrp探针分别保存在含1％bsa和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l)中备用；步骤2、均相免疫反应和磁分离(1)在样品室中加入25-50μl抗原-磁性纳米颗粒探针溶液、25-50μl各浓度梯度标准品/待检测溶液、50-100μl抗体-hrp探针溶液，样品室中反应溶液为0.01mol/lpbs缓冲溶液，将检测装置在涡旋混合器上混合1-2min，进行均相免疫反应，形成磁性纳米颗粒-抗原-抗体-hrp复合物，在磁场作用下，复合物从均相溶液中分离出来；(2)倾斜检测装置，磁场作用力将磁性纳米颗粒-抗原-抗体-hrp复合物从样品室转移到洗涤室，通过玻璃插板密封各功能区，在洗涤室中加入250-500μl洗涤液，所述洗涤液含0.05％吐温-20的0.01mol/lpbs缓冲溶液，涡旋混合1-2min，进行洗涤，重复洗涤2-3次，在磁场作用下，复合物从洗涤液中分离出来；(3)倾斜检测装置，磁场作用力将洗涤后的复合物从洗涤室转移到检测室，通过玻璃插板密封各功能区；步骤3、显色和读数(1)在检测室中加入100-200μltmb显色液，所述显色液含0.4mmol/ltmb和3mmol/lh2o2的柠檬酸缓冲溶液，ph5.0，涡旋混合1-2min，显色液呈现蓝色程度与待检测黄曲霉毒素b1溶度成反比例关系；(2)用50-100μl2mol/lh2so4终止显色，测定450nm吸光值；(3)通过对系列浓度标准品和待测样品检测，建立检测标准曲线，并对未知样品进行定量。有益效果：本发明根据黄曲霉毒素b1检测的需求和当前免疫检测仍需较为复杂的分离洗涤步骤，在常规elisa基础上对检测模式进行改进，通过将三个独立的功能区域组合，设计了一体化免疫快速检测装置，并通过均相磁分离技术在该装置上实现了黄曲霉毒素b1的简便快速定量检测。本发明涉及的一体化免疫快速检测装置和检测策略，不仅可以应用于黄曲霉毒素b1快速检测，对于其它小分子有毒有害化合物免疫快速检测技术的发展同样具有指导和参考价值，其推广应用对于保障食品和农产品安全具有重要现实意义。附图说明图1检测原理示意图；图2为本发明所述装置的俯视示意图；图3为本发明所述装置的前视示意图；图4为黄曲霉毒素b1检测标准曲线图。具体实施方式以下所描述的优选实施例仅用于更好地说明和解释本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成限制。实施例：黄曲霉毒素b1一体化免疫快速检测装置设计及应用1检测装置如图2、3所示，以聚二甲基硅氧烷(pdms)为材料制作一体化检测装置。模具由青铜制成，抛光后镀铬。该检测装置有三个功能区，分别是样品室、洗涤室和检测室，尺寸为45×10×8mm3，有效容积为300μl/腔室。每个腔室都有一个盖板，用于加样和取样；腔室之间通过1.5mm宽的孔相连，作为复合物在磁场下的通道；腔室之间通过1×0.6×7mm3的玻璃插板实现封闭隔离，使得各功能区间互不干扰。将pdms预聚物倒入模具，70℃静置60min，冷却获得检测装置。2检测程序2.1功能化探针制备将50mg商品化fe3o4磁性纳米颗粒(平均粒径为100nm)加入5ml无水乙醇中，室温超声10min获得均匀悬浮液，加入30μl3-氨丙基三乙基硅烷(aptes)室温搅拌6h，分离获得氨基化磁性纳米颗粒。通过碳二亚胺法将氨基化磁性纳米颗粒和黄曲霉毒素b1抗原(黄曲霉毒素b1半抗原与鸡卵清蛋白偶联物)偶联，纯化获得抗原-磁性纳米颗粒探针。通过过碘酸钠法将黄曲霉毒素b1单克隆抗体和辣根过氧化物酶(hrp)偶联，纯化获得抗体-hrp探针。将两种功能化探针保存在含1％bsa和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l)中备用。2.2均相免疫反应和磁分离(1)配置浓度为0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5ng/ml的黄曲霉毒素b1标准样品溶液，稀释液用10％甲醇的pbs缓冲溶液(na+浓度为0.4mol/l，ph7.4)；(2)在样品室中加入25μl抗原-磁性纳米颗粒探针溶液、25μl各浓度梯度标准品/待检测溶液、50μl抗体-hrp探针溶液，样品室中反应溶液为0.01mol/lpbs缓冲溶液，将检测装置在涡旋混合器上混合1-2min，进行均相免疫反应，形成磁性纳米颗粒-抗原-抗体-hrp复合物，在磁场作用下，复合物从均相溶液中分离出来；(3)倾斜检测装置，磁场作用力将复合物从样品室转移到洗涤室，通过插板密封各功能区，在洗涤室中加入250μl洗涤液(含0.05％吐温-20的0.01mol/lpbs缓冲溶液)，涡旋混合1min，进行洗涤，重复洗涤3次，在磁场作用下，复合物从洗涤液中分离出来；(4)倾斜检测装置，磁场作用力将洗涤后的复合物从洗涤室转移到检测室，通过插板密封各功能区。2.3显色和读数(1)在检测室中加入100μltmb显色液(含0.4mmol/ltmb和3mmol/lh2o2的柠檬酸缓冲溶液，ph5.0)，涡旋混合1min，显色液呈现蓝色程度与待检测黄曲霉毒素b1溶度成反比例关系；(2)用50μl2mol/lh2so4终止显色，测定450nm吸光值；(3)通过对系列浓度标准品和待测样品检测，建立检测标准曲线，并对未知样品进行定量。用origin7.0软件对浓度和结合率(b/b0，％)进行四参数拟合绘制标准曲线(如图4)。结合率计算公式：式中：odmax为不加标准溶液或分析物时的吸光值，odx为标准溶液或分析物浓度为x时的吸光值，odmin为空白对照孔的吸光值。3灵敏度方法对于黄曲霉毒素b1检测的抑制中浓度(ic50)为0.101ng/ml，最低检测限(lod，ic10)为0.0142ng/ml，检测范围(ic10-ic90)为0.0142-0.725ng/ml；该检测技术灵敏度能够很好地满足黄曲霉毒素b1检测限量要求。4特异性通过交叉反应率(cr％)来反映该方法的特异性。结果表明该方法对黄曲霉毒素b1的其它几种结构类似化合物具有不同程度的交叉反应率(表1)。cr％＝[ic50(黄曲霉毒素b1)/ic50(结构类似化合物)]×100表1特异性化合物cr％黄曲霉毒素b1100黄曲霉毒素b235.4黄曲霉毒素g125.4黄曲霉毒素g23.6黄曲霉毒素m118.2本发明的检测原理如图1所示。本发明公开了一种针对黄曲霉毒素b1的简单、快速、一体化免疫检测装置和检测策略。该发明基于抗原-抗体特异性结合、均相反应、磁分离等策略，对黄曲霉毒素b1进行分析检测，检测灵敏度能够很好地满足食品和农业样品中黄曲霉毒素b1污染检测限量要求，均相磁分离技术的应用使得检测时间和检测步骤比常规elisa获得显著优化和改进，是一种更加简便快捷的免疫分析策略。本发明公开的免疫检测装置和检测策略，作为仪器分析方法的补充或替代方法，以及常规elisa方法的改进，具有灵敏度高、简便快捷、一体化、无需大型仪器、检测成本低等优势特征，其推广应用对于免疫快速检测技术的发展具有重要指导价值，对于保障食品和农产品安全具有重要的现实意义。当前第1页12