血清中柠檬酸定量测定方法及其在糖尿病肾病早期诊断中的应用与流程

本发明涉及生物技术领域，涉及血清中柠檬酸水平作为糖尿病肾病早期诊断标记物的应用及其测定方法。

背景技术：

糖尿病肾病(dn)是糖尿病微血管并发症之一，是糖尿病患者的重要死亡原因。据统计，大约有1/3的糖尿病(dm)患者会发展成糖尿病肾病，而糖尿病肾病导致的死亡概率是普通肾病的17倍。糖尿病肾病是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一，早期的介入和治疗可以延缓糖尿病肾病的发展、减少治疗费用、降低疾病死亡率，因此寻找糖尿病肾病的早期诊断标志物成为治疗糖尿病肾病的关键所在。微量白蛋白尿仍是诊断dn并判断进展的主要临床指标，但是，出现微量白蛋白尿是否就肯定进入临床dn？有人对386例2型糖尿病伴微量白蛋白尿的患者随访12年，发现仅有30％的微量白蛋白尿患者发展为确诊的糖尿病肾病。现有的指标(如反映肾脏损伤指标、肾功能指标、足细胞损伤指标以及细胞外基质指标等)很少是dn的特异性标志物，因此在临床实际应用中尚难令人满意。其他研究报道的糖尿病肾病的早期诊断标记物有中性粒细胞载脂蛋白(ngal)、肝型脂肪酸结合蛋白(l-fabp)、免疫球蛋白轻链(flc)以及α-1-酸性糖蛋白(aga)等。然而，针对所提出来的标记物用于早期诊断dn并无后续验证以及临床上的应用。因此，需要寻找更敏感、特异且临床应用可靠的早期诊断标记物。

近年来，利用系统生物学技术，人们发现了一些新的生物学标志物，对dn的诊断提供了帮助。前期研究发现dn动物模型db/db小鼠血清中柠檬酸水平在dn早期显著升高，因此，提出血清中柠檬酸水平可作为早期糖尿病潜在诊断标记物加以研究。本发明开发了一种用¹³c标记的柠檬酸替代血清中内源性柠檬酸的替代分析物的gc/ms定量方法，并进行了全面的方法学验证，成功用于准确定量人血清中内源性柠檬酸。通过roc曲线分析发现血清中柠檬酸对尿白蛋白阴性的dn病人的诊断百分比高达90％以上，可作为潜在的糖尿病肾病早期诊断标记物用于临床上进一步研究。

技术实现要素：

本发明建立了一种¹³c标记的柠檬酸(¹³c6-柠檬酸)替代血清中内源性柠檬酸的替代分析物的gc/ms定量方法，在已建立的gc/ms代谢组学平台上采用sim扫描模式进行检测。首先测定替代分析物和真正分析物响应因子(rf)以消除同位素效应和离子化效率的差异。测定结果显示在线性范围内响应因子的值恒定且趋近于1，由此说明可以用血清中系列浓度的¹³c6-柠檬酸建立标准曲线用于定量内源性柠檬酸。然后依照分析方法指导原则，从选择性、定量下限及线性范围、准确度与精密度、提取回收率与基质效应对本测定方法进行了全面的方法学验证，实验结果表明，¹³c6-柠檬酸特异性良好，定量下限为1μg/ml。人血清中¹³c6-柠檬酸在1.0-200.0μg/ml范围内线性良好，相关系数r＞0.99。批内和3日内批间差在85％-115％之间，介质效应均在可接受范围(85％-115％)，提取回收率均＞70％，所建立的方法符合生物样本的测定要求，解决了柠檬酸这一内源性物质定量的难题。

将所建立的内源性柠檬酸的定量方法用于测定健康受试者以及尿白蛋白阴性(uae-)、尿白蛋白阳性(uae+)和大量白蛋白尿(pro)三个不同组别dn病人血清中柠檬酸，发现三组dn病人血清中柠檬酸水平都显著高于正常组，roc曲线下面积分别为0.946，0.894和0.983，提示血清中的柠檬酸水平对早期dn具有极高的预测性。此外，根据测定结果划定了每个组别受试者血清中柠檬酸分别于90％和95％置信区间的浓度范围，为临床应用提供参考。

本发明的有益效果：

本发明建立了一种方便可靠且重复性好的血清中内源性柠檬酸的定量方法，并成功应用于测定正常受试者以及dn病人血清柠檬酸水平，通过roc曲线分析得出其诊断百分比高达90％以上，具有极高的预测性，有一定临床参考价值。

附图说明

图1：¹³c6-柠檬酸与柠檬酸gc/ms全扫描质谱图

a：柠檬酸质谱图；

b：¹³c6-柠檬酸质谱图。

图2：特异性色谱图

a：人空白血清与血清中的¹³c6-柠檬酸(1μg/ml)对比色谱图；

b：人空白血清与内标对比色谱图；

c：人血清中内源性柠檬酸色谱图。

图3：正常受试者与不同组别dn病人血清中柠檬酸定量结果

其中，uae-代表尿白蛋白阴性组别，uae+代表尿白蛋白阳性组别，pro代表大量白蛋白尿组别。

*p＜0.05，**p＜0.01以及***p＜0.001vs正常组。

图4：roc曲线分析

a：尿白蛋白阴性组别roc曲线图；

b：尿白蛋白阳性组别roc曲线图；

c：大量白蛋白尿组别roc曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行进一步的说明。

实施例1人血清中¹³c6-柠檬酸定量方法学验证

1.1血清样本处理方法

¹³c6-柠檬酸储备液的配置：精密称取¹³c6-柠檬酸标准品溶解于甲醇中配制成相当于2.0mg/ml储备液，置4℃冰箱中保存，临用时用甲醇稀释成系列工作液浓度(10、20、50、100、200、500、1000、2000μg/ml)。内标储备液的配置：精密称取1，2-¹³c2-肉寇酸溶解于甲醇中配置成相当于5mg/ml储备液，临用时用甲醇稀释到5μg/ml。取50μl血清样本，加入200μl含内标甲醇，震荡5min沉淀蛋白后4℃冰箱静置1h。20000×g、4℃离心10min，取上清液100μl于gc进样瓶中，减压挥干，再加入甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)30μl，涡旋振荡3min，室温静置16h进行肟化。然后加入衍生化试mstfa(含1％tmcs)30μl，涡旋振荡3min，室温静置1h进行硅烷化，最后再加入外标甲基肉寇酸酯庚烷溶液(30μg/ml)30μl，混匀后采用气相色谱-质谱联用(shimadzugc/msqp2010ultra/se，kyoto，日本)0.5μl进样分析(其色谱和质谱参数参照jiyea，etal，analchem.2005，77，8086-8094)。其中，本方法在原有方法的基础上采用sim扫描模式，分析物采集离子的选择由全扫描质谱图(图1)得出。扫描离子与保留时间如表1。

表1采集离子与保留时间

1.2¹³c6-柠檬酸与柠檬酸响应因子的测定

45μl超纯水分别加入5μl不同浓度的¹³c6-柠檬酸与柠檬酸系列工作液配制成终浓度为1、2、20、200μg/ml的标准样本，每一浓度水平配制5份。按“1.1”项下处理进样，响应因子(rf)＝a真实/a替代。其中a真实代表某浓度下柠檬酸的峰面积，a替代代表同等浓度下¹³c6-柠檬酸的峰面积，测定结果如表1。可以看出，rf值在线性范围内为一恒定值且趋近于1，说明在本发明的测定方法下柠檬酸与¹³c6-柠檬酸与无明显离子化效率的差异。

表2响应因子的测定

1.3特异性实验

选取6份不同来源的空白正常人血清50μl，用纯甲醇4倍沉淀按“1.1”项下操作进样分析得空白色谱图。在空白血清中加入10μg/ml标准工作液和内标(is)，按“1.1”样品处理方法项下操作，得到的色谱图与空白色谱图进行对照(图2)。结果表明：人空白血清中中内源性物质不干扰同位素峰和内标的测定，内源性柠檬酸与其同位素峰的出峰时间一致分别为10.65min和10.655min。is在本色谱系统中的保留时间为10.745min，本法具有较高的专属性。

1.4标准曲线与定量下限

按“1.4”项下方法配制¹³c6-柠檬酸终浓度分别为1、2、5、10、20、50、100、200μg/ml的标准血清样本，按“1.1”项下方法处理进样分析。以所测生物样品中待测物¹³c6-柠檬酸与is的峰面积比值为因变量，待测物的终浓度为自变量，进行最小二乘法(w＝1/x)回归运算，求得¹³c6-柠檬酸在人血清中的直线回归方程：y＝0.052x-0.029(r＝0.9996，n＝5)。配制1μg/ml的标准血清样品按“1.1”项下方法处理进样分析，其中，平行制备5份样品进行连续分析，由当日随行血清标准曲线回归计算样本中¹³c6-柠檬酸下限可达1μg/ml(表3)。

1.5准确度与精密度

按“1.4”项下方法配制¹³c6-柠檬酸终浓度分别为2、20、100μg/ml的血清标准样本，每一浓度水平平行制备5份，连续测定3个分析批，根据每批随行血清标准曲线，计算每批每份血清样品中分析物的测定浓度。如表3所示，血清样品中¹³c6-柠檬酸的批内精密度(rsd)、批间精密度(rsd)以及准确度均符合生物样品测定相关规定。

表3人血清中¹³c6-柠檬酸gc/ms检测的准确度和精密度

1.6提取回收率与基质效应

取六份不同来源的人空白血清若干，按以下三种方式处置：第一组，按“1.4”项下方法配制¹³c6-柠檬酸终浓度分别为2/100μg/ml的标准血清样本，按“1.1”项下方法处理进样分析；第二组，取45μl空白人血清，加入200μl含内标甲醇蛋白沉淀处理后，再加入5μl上述浓度的¹³c6-柠檬酸工作液处理进样分析；第三组，以等量超纯水代替人空白血清，依第二组样品的处置方式同法制备。其中，每个浓度水平平行制备六份样本。

将第一组所得分析物的峰面积与第二组中同浓度同来源血清样本所得的峰面积相比，即可求得¹³c6-柠檬酸的提取回收率；将第二组所得分析物的峰面积与第三组同浓度水基质样本所得的峰面积相比，即可求得¹³c6-柠檬酸的基质效应。结果如表4所示，本测定方法血清中内源性物质对¹³c6-柠檬酸的gc/ms检测基本不存在干扰，提取回收率在70％以上。

表4¹³c6-柠檬酸在人血清中的提取回收率与基质效应

实施例2正常受试者以及不同组别dn病人血清中柠檬酸的测定及roc曲线分析

步骤一：临床来源的正常受试者、尿白蛋白阴性(uae-)、尿白蛋白阳性(uae+)和大量白蛋白尿(pro)三个不同组别dn病人血清样品，37度水浴中放置20分钟解冻，取50μl上述血清样本按“1.1”项下方法处理进样，根据当日随行血清标准曲线计算每个血清样本中内源性柠檬酸的浓度(图3)。疾病组与正常组相比，尿白蛋白阴性(p＜0.01)、尿白蛋白阳性(p＜0.05)和大量白蛋白尿(p＜0.001)组别血清样本中内源性柠檬酸都有显著性升高。值得注意的是，作为肾病进展主要临床指标尿白蛋白检查呈阴性的组别，柠檬酸水平却有显著的升高。

步骤二：将四组人血清内源性柠檬酸的定量结果绘制roc曲线(图4)，尿白蛋白阴性、尿白蛋白阳性和大量白蛋白尿组别roc曲线下面积分别为0.946、0.894、0.983，其数据分析结果如表5。

表5正常受试者与dn病人血清中柠檬酸定量结果