一种流式细胞仪藻类在线检测系统及方法与流程

本发明属于藻类检测技术领域，具体涉及一种流式细胞仪藻类在线检测系统及方法。

背景技术：

要想在蓝藻水华暴发前进行准确的预警，对水中蓝藻含量进行连续监测是切实可行的途径。目前的连续监测主要依靠流式细胞仪来监测分析，流式细胞仪检测的基本原理为：根据流体动力学原理让液体中的颗粒(包括细胞)逐一通过激光束(检测区)，激光照射到颗粒上会引起光的散射，如果颗粒(如藻细胞)含有色素还可以发出荧光，这些散射光和荧光被检测器收集后转换成电信号存储下来，并利用软件进行自动分析。水中的浮游植物细胞作为一个个颗粒，当然可以进行流式细胞计数，由此即可监测水中蓝藻的含量。

专利申请公布号为cn102128779a以及cn102128776a的中国发明专利申请均公开了一种采用流式细胞术检测藻类和有色可溶性有机物的方法，大体内容如下：采用进样器采集水样，经过滤除渣，然后采用流式细胞术对待检测藻类以及有机物进行检测，并将检测的参数通过一定的算法来求得藻类或有机物细胞大小以及单位体积内的个数。专利申请公布号为cn102128779a的中国发明专利申请在进行流式细胞术检测时，公开了待检测藻类和有色可溶性有机物被不含任何颗粒的非外置鞘液包裹着流过流动室，期望通过非外置鞘液的流体力学聚焦作用使所述待检测藻类以及有机物在鞘液的包被下单行排列，依次通过藻类检测区域，这个过程中，颗粒间的距离被拉开，检测用激光每次只照射在一个藻类单细胞或一个有机物细胞上，以达到提高检测准确性的效果。但是，由于没有对采集的液体样本进行分散预处理，只通过非外置鞘液包裹的方式很难达到单个细胞分离并依次通过激光检测区的效果，另外，上述两个发明专利申请并没有公开采样的具体方式，也没有公开发明所述采样方式的适用的水域范围，其检测藻类尤其对团聚密度大的藻类不一定具有普适性，同时，上述采样方式有可能在操作过程中杀死藻类细胞，会导致检测结果准确性的进一步下降。

另外，专利申请公布号为cn106053302a的中国发明专利申请详细公布了一种流式细胞术检测用装置，但是并没有公开采集样本的前处理方法以及具体的采样过程。

国内常用的藻类检测方法是采用人工现场采集藻类样品，固定后带回实验室利用显微镜成像技术进行观察。显微成像方法包括光学显微观察、电镜观察、荧光显微方法等。光学显微观察可分辨到种，但前处理工作复杂，样品鉴定必需由经验丰富的分类学专家进行，耗时费力；电镜放大倍数高，有利于辨别疑似种，但样品制备和操作鉴定过程过于复杂；荧光显微观察则多用于自发荧光的生物。目前，国内开展的藻类监测工作也以传统方法为主，由于分类鉴定工作量较大，难以适应野外大批量样品快速准确分析的要求，且不能进行原位的实时监测，在实际应用中具有一定局限性。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的缺陷提供了一种流式细胞仪藻类在线检测系统及方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种藻类在线检测系统，包括进水管，所述进水管的一端伸入采集水样中，所述进水管的另一端连接有水池，位于采集水样与所述水池之间的进水管上依次连接有电磁阀及用于采样的水泵，所述水池的底部设置有磁力搅拌器，所述水池的一侧设置有超声细胞破碎仪，所述超声细胞破碎仪通过电缆与变幅杆的一端相连，所述变幅杆的另一端伸入所述水池内，所述水池内设置有水位传感器，所述水池通过水管与用于藻类检测的cytosense流式细胞仪相连接，所述水池的侧壁底部连接有排水管，所述水池的侧壁上部连接有溢流管；所述磁力搅拌器、超声细胞破碎仪、cytosense流式细胞仪、水位传感器、电磁阀、水泵分别与电子控制箱电连接，所述电子控制箱与终端电脑电连接。

一种根据权利要求1所述的藻类在线检测系统的在线检测方法，包括如下步骤：

1)采样：开启终端电脑的控制软件，控制开启所述电磁阀及水泵，通过所述水泵控制进水管采集采样水源中的水源样本，每隔一段时间向所述水池内泵送定量的水源样本，采集速率为0.5-2l/min；

2)前处理：当所述水源样本达到预定的量时，通过开启终端电脑的控制软件，设置所述磁力搅拌器、超声细胞破碎仪的相关参数并运行，所述终端电脑向所述电子控制箱发送电信号，所述电子控制箱分别控制磁力搅拌器、超声细胞破碎仪按照预设的参数运转，所述磁力搅拌器对位于水池内的水源样本进行搅拌，保证样本水源的均匀性、避免藻类上浮；所述超声细胞破碎仪通过与其相连的变幅杆对水池内的水源样本进行超声震动，达到充分分散藻类的目的；

3)检测：当所述前处理过程完成时，通过终端电脑的控制软件，控制所述cytosense流式细胞仪开始运行，所述cytosense流式细胞仪会通过定时定量从所述水池内抽取经过预处理的样本水源，并对抽取的样本水源完成藻类的数目、藻类细胞长度、大小、形态、粒度、色素、峰数、藻类群特征检测并绘制相应的脉冲图谱。

进一步地，所述水泵为蠕动泵；所述进水管伸入样本水源的一端分叉形成多个进水支管，所述电磁阀具有多个，多个所述进水支管分别通过一个电磁阀与所述进水管相连；多个所述进水支管分别伸入所述样本水源垂直方向的不同深度处。

进一步地，所述进水管伸入样本水源的一端分叉形成第一进水支管、第二进水支管及第三进水支管，所述电磁阀包括第一电磁阀、第二电磁阀、第三电磁阀及第四电磁阀，所述第一进水支管、第二进水支管及第三进水支管分别通过第一电磁阀、第二电磁阀、第三电磁阀与进水管相连，所述进水管位于蠕动泵与水池之间的一段连接有第四电磁阀和泥沙过滤器；所述第一进水支管位于样本水源下部0.5m，所述第二进水支管位于样本水源下部1m，所述第三进水支管位于样本水源下部1.5m。

进一步地，在采样步骤中，选择性地开启所述第一电磁阀、第二电磁阀、第三电磁阀中的一个或几个及第四电磁阀，能够实现对样本水源垂直方向的不同深度处藻类的检测。

进一步地，在前处理步骤中，当所述水池水量为1-3l时开始预处理；控制所述磁力搅拌器的转数为1000-3000转/min；控制所述超声细胞破碎仪的功率为300-660w，所述超声细胞破碎仪处理10-33个循环，每个循环包括超声震动3-10s，停止3-15s。

进一步地，在检测步骤中，控制所述cytosense流式细胞仪的进泵速率为0.5-2μl/s，采集样本水源量为0.1-0.5ml，所述cytosense流式细胞仪鞘液选取纯净水。

进一步地，所述藻类在线检测系统还包括隔音箱，所述变幅杆、磁力搅拌器及水池位于所述隔音箱内。

进一步地，所述水池的侧壁上部还连接有热水冲洗管，所述进水管上还连接有冷水冲洗管，所述热水冲洗管与所述冷水冲洗管之间连接有连通管，所述热水冲洗管、所述冷水冲洗管在位于所述连通管一侧的管道端口处分别连接有第五电磁阀及第六电磁阀，所述热水冲洗管、所述冷水冲洗管在位于所述连通管一侧的管道上还分别连接有控制管路开关的第七电磁阀与第八电磁阀。

进一步地，所述流式细胞仪的下部设有废液箱。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1.本发明所述藻类在线检测系统在采样过程中使用蠕动泵代替简单的自吸泵，尽可能地减少在采样过程中对藻类的破坏，监测结果更准确。而传统的藻类监测技术则需利用固定剂固定藻类，对藻细胞有所损伤，且在运输以及保存过程中的颠簸也会对藻类细胞造成影响；

2、本发明创新地加入了水样前处理，通过物理方法将藻类大团体打散为小团体甚至单体，有利于提高流式细胞仪的计数准确性，通过磁力搅拌器对样本水体进行搅拌，避免藻类上浮影响检测的准确性，同时，磁力搅拌与超声震动分散不会对藻类产生破坏；

3、本发明能够采集水源垂直方向不同水深处采集藻类样本，以获取水体垂直方向上不同位置处的藻类数量、种群结构的特征以及变化规律；

4、本发明选取太湖中不同藻密度的水样进行检测，该系统工作正常，显示该藻类在线监测系统可适应高浓度藻类的水体；该流式细胞仪藻类在线监测系统适用于对全国范围内的淡水湖泊/水库的藻类在线监测，适用范围广；

5、本发明的流式细胞仪藻类在线检测系统与远程控制系统相结合，方便决策者根据需要对监测区域的藻类的数目以及种群结构等作出实时原位的检测判断，并对藻类变化趋势作出预测，通过终端电脑既能够做出检测的决定并设定相应参数，实现藻类检测的自动化操作，方便快捷；

6、本发明的流式细胞仪藻类在线检测系统与传统的藻类监测技术相比效率更高，这意味着藻类在线检测系统能够采集并分析处理更多的藻类样品；

7、本发明的流式细胞仪藻类在线检测系统采用全仪器操作的模式，与传统的藻类监测技术需要人工显微镜观察藻类细胞数目以及种群结构的状况相比，检测结果受主观因素干扰的概率较低，准确性和可靠性更高；

8、本发明与其他型号的流式细胞仪相比，cytosense流式细胞仪的操作简单，适于检测的藻类范围广，同时本发明的装置还适用于有机物等的检测，适用范围广。

附图说明

图1为本发明所述的藻类在线检测系统的机械结构的示意图；

图2为本发明所述的藻类在线检测系统的信号连接示意图。

其中，1-藻类在线检测系统；2-进水管；3-第一进水支管；4-第二进水支管；5-第三进水支管；6-第一电磁阀；7-第二电磁阀；8-第三电磁阀；9-蠕动泵；10-第四电磁阀；11-水池；12-磁力搅拌器；13-超声细胞破碎仪；14-电缆；15-变幅杆；16-进样管；17-cytosense流式细胞仪；18-溢流管；19-排水管；20-立柱；21-站房；22-隔音箱；23-泥沙过滤器；24-冷水冲洗管；25-热水冲洗管；26-第五电磁阀；27-第六电磁阀；28-第七电磁阀；29-第八电磁阀；30-连通管；31-废液箱；32-cytousb检测软件；33-在线检测软件；34-电子控制箱；35-终端电脑；36-cytoclus绘图软件。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

如图1所示，一种藻类在线检测系统1，所述藻类在线检测系统1位于样本水源的站房21内，所述站房21通过立柱20支撑在样本水源之上，所述藻类在线检测系统1包括进水管2，所述进水管2的一端伸入采集水样中，所述进水管2伸入样本水源的一端分叉形成第一进水支管3、第二进水支管4及第三进水支管5，所述第一进水支管3位于样本水源下部0.5m，所述第二进水支管4位于样本水源下部1m，所述第三进水支管5位于样本水源下部1.5m；还包括第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8，所述第一进水支管3、第二进水支管4及第三进水支管5分别通过第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8与所述进水管2相连，上述第一进水支管3、第二进水支管4及第三进水支管5分别用于抽取样本水源下不同深度的水源；所述进水管2的另一端连接有水池11，与所述水池11相连的进水管2上依次连接有用于采样的蠕动泵9、第四电磁阀10及泥沙过滤器23，所述蠕动泵9通过蠕吸的方式向所述水池11内抽取样本水源，能够避免对采集水样中藻类的破坏，所述泥沙过滤器用于过滤采集水样中的泥沙；在本实施例中，选择性地开启与第一进水支管3相连的第一电磁阀6以及第四电磁阀10，实现对样本水源垂直方向下部0.5m深度处藻类的检测。

所述水池11的底部设置有磁力搅拌器12，所述磁力搅拌器用于磁力搅拌所述水池11内的采集水样，所述水池11一侧设置有超声细胞破碎仪13，所述超声细胞破碎仪13通过电缆14与变幅杆15的一端相连，所述变幅杆15的另一端伸入所述水池11内，所述变幅杆用于对所述水池内部的采集水样进行超声搅拌，所述水池11通过进样管16与用于藻类检测的cytosense流式细胞仪17相连接，所述进样管16用于向所述水池11的内部抽取经过搅拌和超声处理的采集水样，所述水池11的侧壁底部连接有排水管19，所述排水管19用于实验后排除所述水池11内部的水样，所述水池11的侧壁上部连接有用于溢流的溢流管18，所述溢流管18用于将所述水池内部上溢的水排除，所述水池内部设有监测水位的水位传感器，当所述水池内的水位达到要求时，所述水位传感器将会向所述电子设备(即下文的电子控制箱34)发出信号，由所述电子设备关闭第一电磁阀、第四电磁阀和蠕动泵，停止抽水；

所述磁力搅拌器12、超声细胞破碎仪13、cytosense流式细胞仪17、水位传感器、第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8、第四电磁阀10、蠕动泵9、泥沙过滤器23分别与电子控制箱34电连接，所述电子控制箱34与终端电脑35电连接。

具体实施时，还包括隔音箱22，所述变幅杆15、磁力搅拌器12及水池11位于所述隔音箱22内，所述隔音箱22起到隔音隔震的效果。

一种藻类在线检测系统的在线检测方法，包括如下步骤：

1)采样：选择性地开启与第一进水支管3相连的第一电磁阀6、第四电磁阀10及蠕动泵9，通过所述蠕动泵9控制进水管采集采样水源中的水源样本，每隔一段时间向所述水池内泵送定量的水源样本，采集速率为1l/min，所述样本水源经过泥沙过滤器23过滤泥沙；

2)前处理：当所述水源样本达1.5l时，停止泵送水源并开始预处理，首先开启终端电脑35的控制软件，设置所述磁力搅拌器12的转速1500转/min；控制所述超声细胞破碎仪13的功率为480w，所述超声细胞破碎仪13处理23个循环，每个循环包括超声震动3s，停止5s；

所述磁力搅拌器12对位于水池11内的水源样本进行搅拌，以保证样本水源的均匀性、避免水样中藻类上浮影响cytosense流式细胞仪17检测的准确性；所述超声细胞破碎仪13通过与其相连的变幅杆15对水池11内的水源样本进行超声震动，达到充分分散藻类尤其是湖体中常见的微囊藻(藻类细胞间通过细胞间胶质连接最后成团状聚集在一起)的目的，尽可能将藻类大团体打散为小团体甚至单体。

3)检测：当所述前处理过程完成时，通过终端电脑35的控制软件，设置所述cytosense流式细胞仪17以泵速为1μl/s从所述水池11内抽取经过预处理的样本水源，同时开始检测，所述鞘液选取纯净水，对抽取的样本水源完成藻类的数目、藻类细胞长度、大小、形态、粒度、色素、峰数、藻类群体特征等参数检测并绘制相应的脉冲图谱。

所述磁力搅拌器12、超声细胞破碎仪13、cytosense流式细胞仪17、水位传感器、第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8、第四电磁阀10、泥沙过滤器23、蠕动泵9分别与控制所述磁力搅拌器12、超声细胞破碎仪13、cytosense流式细胞仪17、水位传感器、第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8、第四电磁阀10、泥沙过滤器23、蠕动泵9自动运转的电子控制箱34电连接，所述电子控制箱34与终端电脑35电连接，其中，所述水位传感器与所述电子控制箱34之间双向电连接，其他均为单向电连接。

如图2所示，所述控制软件包括申请人自行研发的在线检测软件33、cytosense流式细胞仪17自带的cytousb检测软件32和绘图软件cytoclus36，所述cytousb检测软件32通过终端电脑35与cytosense流式细胞仪17双向电连接，所述cytosense流式细胞仪17与所述电子控制箱34单向电连接；所述终端电脑35里面安装有绘图软件cytoclus36，所述绘图软件cytoclus36用于将所述cytosense流式细胞仪17检测的数据绘制成相应的图表；所述在线检测软件33通过终端电脑35与所述电子控制箱34之间双向电连接，所述在线检测软件33用于设置所述磁力搅拌器12、超声细胞破碎仪13的参数、所述cytousb检测软件32用于设置cytosense流式细胞仪17的参数，当相应参数设置完成后，点击运行上述两个软件，所述终端电脑35向所述电子控制箱34发出信号，所述电子控制箱34控制所述磁力搅拌器12、超声细胞破碎仪13、cytosense流式细胞仪17、蠕动泵9、电磁阀等自动运行。

所述电子控制箱34及终端电脑35的控制软件的连接关系及功能如下：

1)所述电子控制箱34与所述终端电脑35的在线检测软件33互相传输数据，所述电子控制箱34将接收的设备数据传输给在线检测软件33，并执行在线检测软件33的数据处理结果，所述执行就是根据在线检测软件传输过来的数据处理结果来有次序的运行与其相连的设备。例如，所述电子控制箱34接收水位传感器传来的数据并传输给在线检测软件33，并根据在线检测软件33回馈的结果来开启磁力搅拌器12、超声细胞破碎仪13的运行。另外，所述电子控制箱34根据接受的指令还具有控制第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8、cytosense流式细胞仪17、蠕动泵9、第四电磁阀10等与其相连的设备运行或关闭的功能，所述所述电子控制箱34按照上述藻类在线检测系统的在线检测方法中的步骤依次控制相关设备的运行或关闭。

2)所述在线检测软件33事先设置好采样、预处理的运行程序，并根据工作过程中从电子控制箱34接收的数据向电子控制箱34反馈信息，所述电子控制箱34根据反馈信息来控制与其相连的相关设备的运行。当采样、预处理过程完成时，所述在线检测软件33向电子控制箱34发出指令，由电子控制箱34向cytosense流式细胞仪17发送电信号，所述cytosense流式细胞仪17向所述cytousb软件32传输运行开始的信号，所述cytousb软件32向所述cytosense流式细胞仪17发出指令并控制所述cytosense流式细胞仪17开始按照所述cytousb软件32事先设定的检测参数自动运行，以达到上述藻类在线检测系统的在线检测方法中的检测的功能。

3)所述cytousb软件32用于将所述cytosense流式细胞仪17检测的结果文件保存终端电脑35中的指定文件夹中，人工打开所述cytoclus绘图软件36，并通过该cytoclus绘图软件36调取所述cytosense流式细胞仪17检测的结果文件，并将相关参数检测数据绘制成相应的图表形式显示出来。

所述水池的侧壁上部还连接有热水冲洗管25，所述进水管上还连接有冷水冲洗管24，所述热水冲洗管25与所述冷水冲洗管24之间连接有连通管30，所述热水冲洗管25、所述冷水冲洗管24在位于所述连通管30一侧的管道端口处分别连接有第五电磁阀26及第六电磁阀27，所述热水冲洗管25、所述冷水冲洗管24在位于所述连通管30一侧的管道上还分别连接有控制管路开关的第七电磁阀28与第八电磁阀29。当所述水样中藻类的检测完成以后，首先开启第五电磁阀26、第七电磁阀28、第八电磁阀29、第一电磁阀6、第二电磁阀7、第三电磁阀8及第四电磁阀10，用冷水将进水管、水池、泥沙过滤器、第一进水支管3、第二进水支管4及第三进水支管5内的残留的藻类细胞冲入采样水源中，当用冷水冲洗完以后，关闭第五电磁阀26，开启第六电磁阀27，用热水将进水管、水池、泥沙过滤器、第一进水支管、第二进水支管及第三进水支管内的残留的藻类细胞冲入采样水源中，这样冷热交替循环若干次以后，冲洗效果较好。另外，为了获取更好的冲洗效果，冲洗管路时也可以选择性的开启第七电磁阀28、第八电磁阀29中的一个，对管路进行选择性冲洗。

所述流式细胞仪的下部设有废液箱31。所述流式细胞仪会自动将检测废液排入废液箱31中。

实施例2

一种藻类在线检测系统的在线检测方法，包括如下步骤：

1)采样：选择性地开启与第二进水支管4相连的第二电磁阀7、第四电磁阀10及蠕动泵9，关闭其他电磁阀，通过所述蠕动泵9控制进水管采集采样水源中的水源样本，每隔一段时间向所述水池内泵送定量的水源样本，采集速率为2l/min，所述样本水源经过泥沙过滤器23过滤泥沙；

2)前处理：当所述水源样本达3l时，停止泵送水源并开始预处理，首先开启终端电脑35的控制软件，设置所述磁力搅拌器12的转速3000转/min；控制所述超声细胞破碎仪13的功率为300w，所述超声细胞破碎仪13处理33个循环，每个循环包括超声震动10s，停止15s；

所述磁力搅拌器12对位于水池11内的水源样本进行搅拌，以保证样本水源的均匀性、避免藻类上浮影响后续cytosense流式细胞仪17检测的准确性；所述超声细胞破碎仪13通过与其相连的变幅杆15对水池11内的水源样本进行超声震动，达到充分分散藻类尤其是湖体中常见的微囊藻(藻类细胞间通过细胞间胶质连接最后成团状聚集在一起)的目的，尽可能将藻类大团体打散为小团体甚至单体。

3)检测：当所述前处理过程完成时，通过终端电脑35的控制软件，设置所述cytosense流式细胞仪17以泵速为2μl/s从所述水池11内抽取经过预处理的样本水源，同时开始检测，所述鞘液选取纯净水，对抽取的样本水源完成藻类的数目、藻类细胞长度、大小、形态、粒度、色素、峰数、藻类群特征等参数检测并绘制相应的脉冲图谱。

实施例3

一种藻类在线检测系统的在线检测方法，包括如下步骤：

1)采样：选择性地开启与第三进水支管5相连的第三电磁阀8、第四电磁阀10及蠕动泵9，关闭其他电磁阀，通过所述蠕动泵9控制进水管采集采样水源中的水源样本，每隔一段时间向所述水池内泵送定量的水源样本，采集速率为0.5l/min，所述样本水源经过泥沙过滤器23过滤泥沙；

2)前处理：当所述水源样本达1l时，停止泵送水源并开始预处理，首先开启终端电脑35的控制软件，设置所述磁力搅拌器12的转速1000转/min；控制所述超声细胞破碎仪13的功率为660w，所述超声细胞破碎仪13处理10个循环，每个循环包括超声震动7s，停止10s；

所述磁力搅拌器12对位于水池11内的水源样本进行搅拌，以保证样本水源的均匀性、避免藻类上浮影响后续cytosense流式细胞仪17检测的准确性；所述超声细胞破碎仪13通过与其相连的变幅杆15对水池11内的水源样本进行超声震动，达到充分分散藻类尤其是湖体中常见的微囊藻(藻类细胞间通过细胞间胶质连接最后成团状聚集在一起)的目的，尽可能将藻类大团体打散为小团体甚至单体。

3)检测：当所述前处理过程完成时，通过终端电脑35的控制软件，设置所述cytosense流式细胞仪17以泵速为0.5μl/s从所述水池11内抽取经过预处理的样本水源，同时开始检测，所述cytosense流式细胞仪17的鞘液选取纯净水，对抽取的样本水源完成藻类的数目、藻类细胞长度、大小、形态、粒度、色素、峰数、藻类群特特征等参数检测并绘制相应的脉冲图谱。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。