测定大鼠血浆生物样品中的DTPA‑Zn的方法与流程

本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种可靠的方法用以测定生物体例如人、大鼠给予上述dtpa-金属螯合剂后生物样品例如血、尿等中的上述金属螯合剂的含量，以评估这些金属螯合剂的治疗效果或其在体内的行为。特别地，本发明涉及一种测定大鼠血浆生物样品中的dtpa-zn的方法。
背景技术：
：铅污染以及铅中毒对人体健康的危害已经受到广泛关注。铅是人体非必需元素，主要通过呼吸道、消化道进入人体吸收，能够在体内蓄积，对全身各系统和器官有毒性作用，主要影响神经、消化、血液系统，铅污染和铅中毒是需要重点解决的公共卫生问题[haoft,duxq,niuym,etal.progressinresearchoftheleadintoxication[j].chinjindmed(中国工业医学杂志),2008,21:200-202.1；zhouqq,huff,xiacy,etal.studyprogressonhealthhazardsinoccupationallead-exposedworkers[j].chinjindmed(中国工业医学杂志),2013,26:353-356]。在治疗方面，依地酸二钠钙被作为首选药物用于临床[zhoujy,duanz,dengjx,etal.clinicalobservationonchronicleadpoisoningtreatedwithdifferentdosagesofcana-edta[j].occuphealthemergresue(职业卫生与应急救援),2002,20:159-160]。依地酸二钠钙治疗铅中毒有良好的疗效，但在络合铅的同时，也络合排出体内的锌、钙、锰、铁、铜等，会造成体内必需微量元素的平衡失调，出现毒副作用，最重要的毒副作用是锌缺失引起的肾损害。ca-dtpa(又可记作dtpa-ca)又名二亚乙基三胺五乙酸三钠钙盐和zn-dtpa(又可记作dtpa-zn)又名二亚乙基三胺五乙酸三钠锌盐，二者同属氨羧络合剂，于2004年8月由美国fda批准同时上市，用于进入放射性核素严重污染场所工作或停留前以及放射性核素沾染后的治疗[cadadj,levient,bakerde.pentetatecalciumtrisodium(ca-dtpa)andpentetatezinctrisodium(zn-dtpa)[j].hospitalpharmacy,2005,40:65-71]。zn-dtpa与ca-dtpa在体内能选择性地与放射性核素镧(140la)、铈(144ce)、钷(147pm)、镅(124am)、钚(239pu)等的阳离子形成稳定性的可溶性络合物，很快经肾脏排出体外，从而减少了体内放射性物质的沉积量。由于ca2+同dtpa的络合常数要小于zn2+[xuehl.thechelatortreatmentofcommonmetalintoxication[j].chemindoccupsafhealth(化工劳动保护),1989,10:22-26]，ca-dtpa中dtpa更易于与核素的阳离子络合，因此其促排作用强于zn-dtpa。但毒理学研究显示，ca-dtpa易造成内源性的锌缺失，从而使得与锌有关的酶的活性受到严重的影响，其中包括dna与rna聚合酶、羧肽酶、碳酸酐酶等，可造成肝肾、肠黏膜的损伤和造血抑制等不良反应[shenby,ruantm,wudc.effectofzn-dtpaonthedecorporationofultra-uranium,ultra-plutoniumandlanthanideanditsapplication[j].foreignmedsci(raditmednuclmed)[国外医学(放射医学核医学分册)],1988,12:70-74；zhaoxc,wudc.toxicityofdtpaanditsapplicationonthedecorporationofnuclide[j].foreignmedsci(raditmed)[国外医学(放射医学分册)],1980,4:211-215]。zn-dtpa的安全性较高，虽也能造成锰和镁等微量元素的缺失，但不会引起缺锌而产生严重的毒副作用，其毒性约为ca-dtpa的1/10～1/30[zhangzy,xuxw,zhuz.pentetatezinctrisodium[j].chinpharmj(中国药学杂志),2007,42:557-558]。已有文献采用石墨炉原子吸收分光光度计法测定铅含量，考察了zn-dtpa对慢性铅中毒小鼠的促排作用[yangs,chenl,yinyy,etal.studyoftheeffectofpentetatezinctrisodiumonexcretionofleadinleadpoisonedmice[j].pharmjchinpla(解放军药学学报),2011,27:147-149]，然而石墨炉原子吸收分光光度计法测定方法复杂、成本高、灵敏度低，对于例如血、尿等生物样品中的量难以满足测定要求。另外，还有文献[陈立，等，icp-ms法分析zn-dtpa对铅中毒小鼠的促排作用，药学学报(actapharmaceuticasinica)2014,49(11):1588-1592]报道，应用电感偶合等离子体质谱(icp-ms)测定生物样本中铅的浓度，考察核素促排药zn-dtpa对铅中毒小鼠的促排作用。小鼠一次性腹腔注射乙酸铅溶液，每只染铅1mg，建立急性铅中毒模型，染铅后4h腹腔注射zn-dtpa，连续给药5天。同时设正常对照组、染铅模型组、zn-dtpa与ca-dtpa联用组。每天收集尿液，在实验的第2、4和6天分别处死部分小鼠，取全血、双侧股骨、脑，消解处理后，用icp-ms测定铅含量。据信结果表明zn-dtpa能显著增加尿铅的排出，降低血液、股骨和脑组织中的铅含量。然而，由于dtpa-ca和dtpa-zn不但可以用于排除体内重金属铅，还可以排除体内的镧、铈、钷、镅、钚等重金属甚至作为临床应用药品还可用于确诊或疑似被钚、镅、钜体内污染受试者的治疗，并提高这些金属元素的清除速率。在如此广泛的应用环境下，仅仅考察铅在体内的分布和含量显然不足以评价dtpa这种金属螯合剂的体内行为。因此，本领域仍然期待有可靠的方法来测定生物体例如人、大鼠给予上述金属螯合剂后生物样品例如血、尿等中的上述金属螯合剂的含量，以评估这些金属螯合剂的治疗效果或其在体内的行为。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可靠的方法来测定生物体例如人、大鼠给予上述金属螯合剂后生物样品例如血、尿等中的上述金属螯合剂的含量，以评估这些金属螯合剂的治疗效果或其在体内的行为。已经出人意料的发现，使用本发明液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法，能够有效的实现上述目的。特别是，本发明使用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法测定大鼠血浆生物样品中的dtpa-zn，呈现出优异的方法学特征。本发明因此发现而得以完成。为此，本发明第一方面涉及一种测定大鼠血浆生物样品中的dtpa-zn的方法，该方法使用液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法测定经处理的大鼠血浆生物样品中的dtpa-zn的含量，包括如下步骤：(1)生物样品的处理：(1a)取含有或不含有dtpa-zn的大鼠血浆50μl，置于1.5ml离心管中，加内标溶液即25μg/ml的edta-zn水溶液10μl或者不加内标溶液，0.1％氨水50μl，水400μl，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上；(1b)上样后依次用1ml水、1ml甲醇清洗，最后用含5％氨水的甲醇1ml洗脱；(1c)收集该洗脱液，吹干，用含0.05％氨水的50％甲醇150μl复溶，吸取20μl进行lc-ms/ms分析；(1d)标准曲线的制备：取不同浓度的dtpa-zn标准系列溶液分别加至空白人血浆中，配制成相当于浓度为1、2、5、10、20、50、100、和200μg/ml的标准曲线血浆样品；取该血浆样品50μl，依次加入内标溶液10μl，0.1％氨水50μl，水400μl，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着照以上(1b)和(1c)操作，根据lc-ms/ms分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；(2)液相色谱-串联质谱测定：(2a)提供高效液相色谱仪和串联质谱仪，所述高效液相色谱仪配备梯度泵和进样器，所述串联质谱仪配备电喷雾离子源和数据处理系统；(2b)色谱条件：所用的分析柱为shiseidoproteonavi品牌的色谱柱(其规格例如为5μm，250×4.6mmi.d.)，柱前连接c18保护柱(其规格例如为4×3.0mmi.d.，例如美国phenomenex公司的保护柱)，柱温25℃，流动相为甲醇-2mm甲酸铵(例如，其中含0.03％氨水)(50:50，v/v)，流速0.45ml/min；(2c)质谱条件：电喷雾离子化源(例如使用turboionspray源)，负离子方式检测；喷射电压为-4000v；源温度为400℃；卷帘气(cur)为20；碰撞气(cad)为4；扫描方式为多反应监测(mrm)，用于定量分析的离子反应分别为m/z226.6→m/z204.5(zn-dtpa，ce为-15v)和m/z444.2→m/z319.2(内标edta-zn，ce为-34v)，扫描时间为150msec；(3)数据处理与分析(3a)通过上述液相色谱-串联质谱测定得到生物样品中的目标物质含量；和，任选的(3b)用非房室模型计算选自下列的一下或多个药动学参数：cmax、tmax、t1/2、mrt、auc0-t、vz、cl；其中，cmax为实测的最大血药浓度，tmax为口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为药物末端消除半衰期，mrt为药物在体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积auc0-t由梯形法计算得到，vz为稳态时表观分布容积，cl为清除率；以及，任选的(3c)计算给药的生物利用度：在等当用药剂量下，用第二给药方式所得auc值除以第一给药方式所得auc值再乘以100％所得百分数，作为第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述大鼠血浆是从给予或未给予zn-dtpa的大鼠静脉血置于含肝素钠的离心管中，2000～4000g离心10～30min(例如3000g离心20min)获得的血浆。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所获得的大鼠血浆任选的被置于-20℃冰箱中冻存，以等待测定。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述大鼠静脉血是从大鼠眼眶静脉窦采血获得的。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所用的内标为edta-znna2·xh2o。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述固相萃取小柱在上样前，先用1ml甲醇活化，再用1ml水平衡。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述大鼠例如是sprague-dawley(sd)大鼠，本领域通常简称为sd大鼠。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述高效液相色谱仪例如是美国安捷伦公司agilent1200型液相色谱仪。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述串联质谱仪例如是美国absciex公司api4000型串联质谱仪；例如其配有turboionspray离子化源以及analyst1.5数据处理系统。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述用于药动学参数计算用的软件为软件，例如其版本为5.2.1版。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中步骤(3a)中，各组的参数均用平均数据即“均数±标准差”的方式表示；进一步的，所述平均数据是以样本数大于等于3所得的平均数。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述第二给药方式相对于第一给药方式的相对生物利用度，以f(相对)％表征，该f(相对)％是通过以下计算式算得的：上式中：auc是曲线下面积(其单位例如是h*μg/ml)，d是给药剂量(其单位例如是mg/kg)。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，当所述第一给药方式是静脉注射给药(即静注给药)时，所述第二给药方式相对于该静注给药方式而言的生物利用度为其绝对生物利用度，即以f(绝对)％表征，该f(绝对)％是通过以下计算式算得的：例如，气管吸入给药相对于静脉注射给药的绝对生物利用度f(绝对)％可用下式计算：又例如，气管吸入给药相对于肌内注射给药的相对生物利用度f(相对)％可用下式计算：在本发明中，proteonavi色谱柱是一种采用在多孔球形硅胶填料表面键合丁基(c4)的高性能蛋白质-多肽分析专用色谱柱，该填料既具有硅胶类填料的高分离能力和耐压性，又具有耐酸性、抑制蛋白质的吸附等特长。该色谱柱有时以proteonavis5标示。尽管本发明分析的dtpa金属络合剂是一种典型的小分子物质，分子量远小于普通的蛋白质-多肽，然而，已经出人意料的发现，本发明仅在使用上述proteonavi色谱柱的色谱柱的条件下本发明方法才能获得优良的方法学性能。例如，在使用ymc-c18、agilentextard-c18、资生堂pakcr-18(其与本文所用proteonavi柱是同一生产商)等c18柱时，dtpa金属络合物极其难以洗脱下来，例如在使用本发明色谱条件但改用这些c18柱时dtpa-za的保留时间大于43min且拖尾严重，然而无法解释的是内标物质却并未如此严重的延长保留时间(在不同的c18柱上保留时间约在5～6min之间)。又例如，在使用zorbaxedipsr-c8、dikma钻石-c8、费罗门gemini-c8等c8柱时，dtpa金属络合物在色谱柱中不保留，即保留时间极其短暂，例如在使用本发明色谱条件但改用这些c8柱时dtpa-za的保留时间小于1.5min且与容易与溶剂等混杂在一起而无法获得有效分离。根据本发明第一方面任一实施方案所述的方法，其中所述固相萃取小柱是型号为wax的固相萃取小柱，其例如购自waters公司。watersoasiswax固相萃取小柱在商业上通常是设计作为混合型弱阴离子交换反相吸附剂，对强酸性化合物具有高的选择性和灵敏度的固相萃取小柱。已经出人意料的发现，仅在当使用上述oasiswax型固相萃取小柱的情况下，本发明方法才能获得优良的方法学性能。而当改用其它品牌的固相萃取小柱例如美国艾杰尔的cleanertpwax固相萃取小柱、stratatm-x固相萃取小柱以及甚至是同一厂商的oasismax型固相萃取小柱时，远远无法获得上述oasiswax型固相萃取小柱所获得的优良结果。例如在照下文表2结果所涉及的方法进行试验时，用上述三种其它品牌/型号的固相萃取小柱时，回收率2μg/ml、18μg/ml、180μg/ml三种浓度回收率分别在36～41％、45～54％、52～68％范围内且各种小柱在三种不同浓度下所得rsd在8～19％范围内波动，这种不同浓度下回收率呈现巨大差异且rsd大范围波动的结果在生物样品分析中是不可接受的。另外，在进行生物样品处理时，在将样品上样到固相萃取小柱后，用含少量氨水的洗脱液进行洗脱是必要的，否则各浓度下的回收率比之于本发明下文表2回收率结果低20个百分点以上。在本发明上述操作方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的实例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。dtpa金属络合剂，例如dtpa的钙金属络合剂或者dtpa的锌金属络合剂，它们的体外检测，例如在一些化学制品、制剂中的检测，仍然是目前本领域技术人员遇到的一项巨大检测难题，而它们体内生物样品中的检测难度更是远远的比体外检测困难。特别是，目前国内外都没有这些化合物体内分析的报导。dtpa的钙金属络合剂，可缩写为ca-dtpa或者dtpa-ca，其通常亦称为ca-dtpa(dtpa-cana3)；dtpa的锌金属络合剂，可缩写为zn-dtpa或者dtpa-zn，其通常亦称为zn-dtpa(dtpa-znna3)。ca-dtpa、zn-dtpa以及本发明中使用到的内标物质edta-zn(为其二钠盐水合物edta-znna2·xh2o)的分子式分别为以下式a、式b和式c：其中，ca-dtpa可以静脉注射和吸入给药，分别以注射剂和粉吸入剂制剂形式提供于临床，首批样品于2004年在美国获得批准。ca-dtpa在临床上的适应症与应用为：ca-dtpa作为一种缓解放射螯合剂被用于确诊或疑似被钚、镅、钜体内污染受试者的治疗，并提高这些金属元素的清除速率。ca-dtpa的剂量与给药方面，fda的规范要求在受污染24h内给予首剂量的ca-dtpa进行治疗，24h后，建议使用zn-dtpa维持螯合治疗。螯合治疗在体内受污染后的24h内使用效果最好；在确诊或者怀疑受到污染时应及时给予螯合治疗；如若不能立刻治疗，在条件允许时应立刻给予螯合治疗。在体内污染后的一段时间螯合治疗仍然有效。放射性污染物在体内循环过程中或在间质液中时，ca的螯合效果最佳。螯合疗效随着体内污染过后放射性污染物被隔离在肝和骨中而降低。如若确诊或疑似体内污染并非由钚、镅、钜引起，需进行其他治疗。具体的给药方法是，污染途径未确定或有可能存在多途径污染时静脉注射ca-dtpa；将5ml的ca-dtpa溶液(1g/5ml)用时3-4分钟缓慢静脉推注给药，或将5ml的ca-dtpa溶液于5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸溶液、生理盐水中稀释成100-250ml静脉输液给药；若受试者由于吸入而受污染，24h内给予雾化的ca-dtpa可作为治疗途径使用。另外，zn-dtpa可以静脉注射和吸入给药，分别以注射剂和粉吸入剂制剂形式提供于临床，首批样品于2004年在美国获得批准。zn-dtpa在临床上的适应症与应用为：zn-dtpa适用于确诊或疑似的钚、镅、钜造成的体内污染，并加快其清除速率。zn-dtpa的剂量与给药方面，fda的规范要求，在受污染24h内给予首剂量的ca-dtpa进行治疗；在此期间ca-dtpa比zn-dtpa疗效更好；如果ca-dtpa无效，给予zn-dtpa进行首次治疗。给药第二天若额外的螯合疗法被建议给予，使用zn-dtpa进行常规治疗。若zn-dtpa无效，螯合治疗使用ca-dtpa维持。含zn的伴随矿物质补充剂应被给予。对成年人和青少年，静脉注射1g剂量的zn-dtpa；对于12岁以下的儿童，静脉注射14mg/kg的zn-dtpa，用量切勿超过1g。24h后的螯合持续治疗使用zn-dtpa，对成年人和青少年，静脉注射1g剂量的zn-dtpa，每天一次；对于12岁以下的儿童，静脉注射14mg/kg的zn-dtpa，每天一次，用量勿超过1g。dtpa的螯合治疗在体内受污染后的24h内使用效果最好。在确诊或者怀疑受到污染时应及时给予螯合治疗。如若不能立刻治疗，在条件允许时应立刻给予螯合治疗。在体内污染后的一段时间螯合治疗仍然有效。放射性污染物在体内循环过程中或在间质液中时，zn-dtpa的螯合效果最佳。螯合疗效随着体内污染过后放射性污染物被隔离在肝和骨中而降低。如若确诊或疑似体内污染并非由钚、镅、钜引起，需进行其他治疗。具体的给药方法是，污染途径未确定或有可能存在多途径污染时静脉注射zn-dtpa；将5ml的zn-dtpa溶液(1g/5ml)用时3-4分钟缓慢静脉推注给药，或将5ml的zn-dtpa溶液于5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸溶液、生理盐水中稀释成100-250ml静脉输液给药；若受试者仅由于吸入途径而受污染，24h内给予雾化的zn-dtpa可以作为治疗途径使用。通过建立本发明方法，为dtpa的金属螯合物在给予动物(例如大鼠、人等)后体内生物样品(例如血液、尿液、唾液等)中这些物质的含量测定提供了可能。本发明建立的分析方法具有优异的方法学性能。附图说明图1：dtpa-zn和edta-zn的二级质谱图，图中，a为dtpa-zn，b为edta-zn(内标)。图2：大鼠血浆样品的mrm色谱图，图中，a为空白血浆，b为加内标空白血浆，c为给药血浆样品；另外，图中，峰i为dtpa-zn，峰ii为内标edta-zn。图3：dtpa-zn样品测定阶段的一条标准曲线(y＝0.0706x+0.0309)。具体实施方式本发明所提供的以下实施例仅用于解释目的而不是用于，也不应被解释为以任何方式限制本发明。本领域那些技术人员将会认识到在不超越本发明的精神或范围的情况下可对以下实施例做出常规变化和修改。本发明的一个目的在于更好地理解dtpa-zn的体内处置规律，本发明试验建立并验证了定量检测生物样品中dtpa-zn的含量的液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)法，同时考察dtpa-zn在大鼠体内的药代动力学及生物利用度情况。一、实验材料1、药品、试剂与材料zn-dtpa(dtpa-znna3)原料，白色粉末，含量84.95％，自制。zn-dtpa粉雾剂，白色粉末，含量：53.45％，自制。zn-dtpa注射液，自制。乙二胺四乙酸二钠锌盐水合物(内标，edta-znna2·xh2o)，白色结晶性粉末，纯度＞98.0％，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。甲醇(色谱纯)为美国fisher公司产品；甲酸(分析纯)、甲酸铵(分析纯)均购自国药集团化学试剂有限公司；水为娃哈哈去离子水。固相萃取小柱购自waters公司，型号为wax，1cc。2、仪器液相色谱-质谱联用仪(lc-ms/ms)：美国absciex公司api4000型串联质谱仪(配有turboionspray离子化源以及analyst1.5数据处理系统)；美国安捷伦公司agilent1200四元梯度泵和自动进样器。ba11os型万分之一电子分析天平(德国sartorius公司)；qb-600型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司出品)；tdw-1型恒温加热仪(北京通达科技有限责任公司)；wyk-45d型空气压缩机(天津达因仪器厂)。3、实验动物sprague-dawley(sd)大鼠，雄性，体重为260±20g，许可证号为scxk(京)2012-0001，合格证号：11400700051827，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。二、实验方法1、lc-ms/ms条件色谱条件：分析柱为shiseidoproteonavi(5μm，250×4.6mmi.d.，日本shiseido公司)，连接c18保护柱(4×3.0mmi.d.，美国phenomenex公司)，柱温25℃，流动相为甲醇-2mm甲酸铵(含0.03％氨水)(50:50，v/v)，流速0.45ml/min，内标为edta-znna2·xh2o。质谱条件：电喷雾离子化源(turboionspray源)，负离子方式检测；喷射电压为-4000v；源温度为400℃；卷帘气(cur)为20；碰撞气(cad)为4；扫描方式为多反应监测(mrm)，用于定量分析的离子反应分别为m/z226.6→m/z204.5(zn-dtpa，ce为-15v)和m/z444.2→m/z319.2(内标edta-zn，ce为-34v)，扫描时间为150msec。2、生物样品处理取血浆50μl，加内标溶液(25μg/mledta-zn水溶液)10μl，50μl0.1％氨水，400μl水，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上。固相萃取小柱上样前先用1ml甲醇活化，再用1ml水平衡。上样后依次用1ml水、1ml甲醇清洗，最后用1ml甲醇(含5％氨水)洗脱。收集洗脱液吹干，用150μl50％甲醇(含0.05％氨水)复溶，吸取20μl进行lc-ms/ms分析，测定并计算生物样品中的目标物质的含量。3、zn-dtpa的大鼠实验方法雄性sd大鼠18只，随机分成3组，每组6只，分别为静脉注射给予zn-dtpa注射液、肌肉注射给予zn-dtpa注射液和气管喷入zn-dtpa粉雾剂组，剂量均为zn-dtpa50mg/kg(以zn-dtpa计算)。动物给药前未禁食，自由饮水，分别于给药前及给药后0.03、0.08、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4和6h眼眶静脉窦采血0.2ml，置于含肝素钠的离心管中，3000g离心20min，取血浆置于-20℃冰箱中冻存待测。4、数据处理与分析药动学参数用软件(version5.2.1，美国)的非房室模型计算。cmax为实测的最大血药浓度，tmax为口服给药后血药浓度达峰时间，t1/2为药物末端消除半衰期，mrt为药物在体内平均滞留时间，血药浓度-时间曲线下面积auc0-t由梯形法计算得到，vz为稳态时表观分布容积，cl为清除率。组平均数据用“均数±标准差”(mean±sd，n≥3)表示。生物利用度的计算：由气管吸入和静注(或肌注)的auc比值计算得到相应剂量zn-dtpa粉雾剂的绝对(或相对)生物利用度，计算公式如下：式中，auc：曲线下面积(h*μg/ml)；d：给药剂量(mg/kg)三、结果与评价1、lc-ms/ms定量方法学及验证(1)方法的选择性将空白血浆、加标空白血浆和大鼠给药后的血浆样品，按上文所述操作进行lc-ms/ms分析，得到mrm色谱图。经色谱图比较可见，大鼠血浆中的内源性物质均不干扰待测物及内标的测定。待测物的二级全扫描质谱图见图1，大鼠血浆样品的mrm色谱图见图2。zn-dtpa和内标的色谱保留时间(tr)分别为4.9min和5.3min(图2)。(2)标准曲线和定量下限取不同浓度的dtpa-ca标准系列溶液分别加至空白大鼠血浆中，配制成相当于浓度为1、2、5、10、20、50、100、和200μg/ml的标准曲线血浆样品；取该血浆样品50μl，依次加入内标溶液10μl，0.1％氨水50μl，水400μl，涡流混合3min，全部上样于固相萃取小柱上，接着上样后依次用1ml水、1ml甲醇清洗，最后用含5％氨水的甲醇1ml洗脱；收集该洗脱液，吹干，用含0.05％氨水的50％甲醇150μl复溶，吸取20μl进行lc-ms/ms分析；根据lc-ms/ms分析结果绘制标准曲线，该标准曲线用于计算各种样品中的目标物质含量；以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权(w＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得zn-dtpa的直线回归方程，标准曲线见图3。zn-dtpa在1～200μg/ml的范围内，浓度与峰面积比之间呈良好的线性关系(r2>0.998)。由6个样本分析的精密度和准确度，确定定量下限为1μg/ml。(3)方法的精密度与准确度用大鼠空白血浆加内标配制zn-dtpa低、中和高三个浓度(2，18和180μg/ml)的qc样品，在一日内对每一浓度进行6样本分析，得到本法的日内精密度和准确度，连续进行6样本分析，得到日间精密度和准确度。表1的结果显示，方法的精密度和准确度均符合生物样品定量分析要求。表1：zn-dtpa的精密度与准确度(n＝18)(4)回收率和基质效应配制3个浓度的大鼠血浆qc样品，每一浓度进行3样本分析，与相同浓度的标准溶液样品进行峰面积比较得到回收率，数据见表2。从表中结果可见，低、中和高三个浓度的回收率基本一致。表2：zn-dtpa的血浆回收率(n＝3)在3个qc浓度水平，应用空白血浆提取后加标(即，加内标物质)的方法，考察了zn-dtpa在大鼠血浆样品中的基质效应，结果见表3。实验结果表明大鼠血浆中zn-dtpa的基质效应均在85％～115％之间，血浆基质对zn-dtpa的测定没有显著的影响。表3：zn-dtpa的基质效应(n＝5)qc浓度(μg/ml)基质效应(％)相对标准差(rsd％)相对偏差(re％)299.7±5.35.3-0.31892.4±6.87.4-7.6180105.5±5.35.15.5(5)稳定性考察在3个qc浓度水平，考察了zn-dtpa血浆样品在各种实验条件下的稳定性。结果表明，zn-dtpa的rsd均小于9.9％，re在-8.25～9.87％的范围内(表4)，二者的稳定性符合本试验要求。表4：血浆样品中dtpa-zn的稳定性(n＝4)2、dtpa-zn的大鼠药代动力学本发明采用雄性大鼠静脉注射、肌肉注射和气管吸入给予50mg/kgzn-dtpa后，考察它们的血浆药代动力学，在不同取样时间点，测定三种给药方式中原药平均血浆药物浓度(在本申请中未具体提供这些数据)，根据这些平均血浆药物浓度数据可以绘制平均药-时曲线。用winnonlin药代动力学程序对所测数据进行分析，得到主要的药代动力学参数，结果显示，静脉注射、肌肉注射和气管吸入三种方式的t1/2分别在0.3～0.4h范围内、0.4～0.6h范围内、和0.7～0.9h范围内，三种方式的cmax分别在200～300μg/ml范围内、90～140μg/ml范围内、和60～80μg/ml范围内，三种方式的auc(0-t)分别在80～95h*μg/ml范围内、85～95h*μg/ml范围内、和45～55h*μg/ml范围内。另外，经计算，大鼠经气管吸入zn-dtpa粉雾剂(50mg/kg)后的体内吸收和消除均较快，原药的达峰时间为3min，t1/2为0.81±0.17h，体内平均驻留时间mrt为0.91±0.24h，给药后2.0h血药浓度降至峰浓度的1/10以下，绝对生物利用度f为55.32％，与肌肉注射相比，相对生物利用度为53.37％。这些结果表明本发明液相色谱-串联质谱法对于测定生物样品中的dtpa金属络合物是可行的。总体上讲，本发明建立并验证了定量检测生物样品中zn-dtpa的lc-ms/ms方法，方法的特异性、重现性和准确性均符合药代动力学研究的要求。大鼠静脉注射50mg/kg的zn-dtpa注射液后，原药在血浆中很快消除，t1/2为0.38h，给药4.0h后血浆浓度降至检测限以下。大鼠肌肉注射zn-dtpa注射液后，原药的吸收和消除亦较快，tmax在8min左右，t1/2为0.5h，平均驻留时间mrt为0.6h左右，生物利用度为103.6％。大鼠气管吸入zn-dtpa粉雾剂后，原药吸收和消除均较快，tmax在3min左右，t1/2为0.8h，平均驻留时间mrt为0.9h，绝对生物利用度为55.32％，与肌肉注射相比，相对生物利用度为53.37％。参考资料：国家食品与药品监督管理局：《化学药品非临床药代动力学研究技术指导原则》，2005.3。以上通过本发明较佳实施例对本发明的精神作了详细阐述。本领域技术人员理解，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12