用于检测碱性磷酸酶的修饰电极及制备方法与检测方法与流程

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极及制备方法与检测方法。

背景技术：

科学研究证明碱性磷酸酶在血清中含量的变化可以用来诊断某些疾病如肝炎、肝功能障碍、肝硬化、骨质疏松症、内分泌疾病、脑瘤、前列腺癌、骨癌和其他疾病等。因此，构建灵敏度高和选择性好的检测碱性磷酸酶的分析方法在医疗应用领域具有非常重要的意义。到目前为止，科研工作者开发了许多方法用于碱性磷酸酶的检测，如比色法、荧光分析法、化学发光法和表面增强拉曼散射（sers）法。然而，这些方法都存在一定的缺陷，如繁琐的样品处理步骤和复杂的反应机制，同时还通常需要复杂的外部仪器和复杂操作，这不仅增加了检测的复杂性，还增加了检测成本和时间。因此如何克服现有技术的不足是目前分析检测技术领域亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极及制备方法与检测方法，该电极可以作为工作电极，结合酶促金属化反应及电化学溶出伏安检测手段，建立一种快速、高灵敏检测碱性磷酸酶的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1），将浓度为1.8-2.2mg/ml羧基化多壁碳纳米管的dmf溶液与浓度为1.9-2.1mg/ml聚乙烯亚胺的超纯水溶液等体积混合均匀，得到修饰溶液；

步骤（2），取修饰溶液滴涂于干净的电极表面，修饰溶液的用量为0.7-0.75µl/mm²，室温下晾干后，用超纯水冲洗，得到聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极；

步骤（3），将聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极置于4.9-5.1mmol/l的氯金酸水溶液中，在-0.2v的恒电位下沉积58-62s，即得到用于检测碱性磷酸酶的修饰电极。

进一步，优选的是，所述的电极为玻碳电极。但不限于此，如常规的金电极、丝网印刷电极都可以。

进一步，优选的是，干净的电极的制备方法是：将电极在三氧化二铝中抛光至镜面，之后依次用无水乙醇超声清洗半分钟，再用蒸馏水超声清洗半分钟两次，接着将电极置于含有铁氰化钾和亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液中，在-0.2v~0.6v的电势范围内进行循环伏安扫描，电势差在80mv以下，表明电极清洗干净；

所述的含有铁氰化钾和亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液包括1mmol/l铁氰化钾、1mmol/l亚铁氰化钾以及ph为7.0的0.1mol/l磷酸缓冲液。

本发明还提供上述用于检测碱性磷酸酶的修饰电极的制备方法制得的修饰电极。

本发明另外提供一种检测碱性磷酸酶的方法，采用上述用于检测碱性磷酸酶的修饰电极的制备方法制得的修饰电极，包括如下步骤：

步骤（1），将待测碱性磷酸酶溶液按体积比为1:0.95-1.05加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，得到反应液；

所述的含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有：4mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、1mmol/l硝酸银、1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，溶剂为水，ph为9.8；其中优选采用浓硝酸调节ph到9.8；

步骤（2），将修饰电极插入反应液中，于37℃避光反应38-42分钟，然后依次采用1mol/ltris水溶液和超纯水将修饰电极冲洗干净，最后将修饰电极放入1mol/lkcl水溶液中进行线性伏安扫描测定，根据检测到的电化学信号的强弱采用标准曲线法对碱性磷酸酶进行定量。

进一步，优选的是，扫描范围为-0.1~0.3v，扫描速率为100mv/s。

进一步，优选的是，待扫描测定完后，将修饰电极置于0.5mol/l的硫代硫酸钠水溶液中浸泡5~10min后，取出用超纯水冲洗干净，之后修饰电极用于下一个样品的检测。

本发明将扫描测定完的修饰电极置于硫代硫酸钠水溶液中浸泡，之后用超纯水冲洗，可将电极表面沉积的银能被全部除去，使修饰电极得到再生，可以直接之后修饰电极用于下一个样品的检测

本发明检测方法是将待测碱性磷酸酶溶液加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，然后将修饰电极插入上述反应液中进行孵育，利用沉积到修饰电极表面银的溶出伏安信号实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。

上述碱性磷酸酶可以催化反应液中抗坏血酸2-磷酸酯磷酸基团的水解，产生具有强还原性的对抗坏血酸，而抗坏血酸能在修饰电极表面将ag⁺还原成ag单质并沉积到修饰电极表面，将修饰电极作为工作电极置于kcl溶液中进行线性伏安扫描可以得到电极表面沉积银的溶出伏安信号，利用该信号可以实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。

本发明将酶促金属化和纳米金诱导银沉积相结合，建立了一种超高灵敏且抗干扰能力强的非聚集的金属纳米颗粒比色法，该方法结合了酶催化反应的专一性和催化放大性及金属纳米颗粒独特的光学性质等优点，大大增加了检测的灵敏度及特异性。

本发明制得的修饰电极作为工作电极，可以放大电化学检测信号；结合酶促金属化，将碱性磷酸酶的催化信号转化为沉积银的溶出伏安信号，通过银沉积的方式将酶催化信号全部富集到电极表面，使检测信号得到进一步放大；最后通过修饰电极表面所沉积银的溶出伏安信号实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1、本发明方法将修饰电极、酶促金属化、纳米金诱导银沉积以及金属溶出伏安法相结合，通过酶促金属化反应将酶催化信号以银沉积的方式富集到修饰电极表面，结合修饰电极表面沉积银的溶出伏安信号可以实现对碱性磷酸酶的超高灵敏检测。

2、本发明只需通过简单的处理，修饰电极还可以再生，从而用于下一个样品的检测。

3、本发明通过银的溶出伏安信号对碱性磷酸酶进行定量检测，在孵育时间为40分钟时，碱性磷酸酶的浓度在50amol/l~2pmol/l范围内时，银的溶出伏安信号与目标物浓度的对数呈线性关系，检测限为10amol/l，相当于可以在10μl检测液中实现10个碱性磷酸酶的检测，而且增加孵育时间或者减少工作电极的尺寸还可以进一步提高检测灵敏度，证明该方法可以实现碱性磷酸酶的超高灵敏检测。

4、本发明方法还具有很好的抗干扰能力，可以实现人血清中碱性磷酸酶的检测。

5、本发明操作简单，不需要复杂仪器，而且灵敏度高，特异性好，在临床检测中具有非常好的应用前景。

6、本发明与以前检测碱性磷酸酶活性的基本方法相比，其灵敏度得到极大地提高，本发明的检测检测灵敏度低至10amol/l。

附图说明

图1为碱性磷酸酶的检测原理示意图。

图2为不同修饰电极在1mmfe(cn)6^3-/4-溶液中的循环伏安曲线。a裸玻碳电极；b聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的玻碳电极；c聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管-纳米金修饰的玻碳电极。

图3为制备修饰电极时电极修饰条件对检测碱性磷酸酶电化学信号的影响图，其中a为氯金酸的浓度对电化学信号的影响；b为纳米金的沉积时间对电化学信号的影响。

图4为不同检测条件对检测碱性磷酸酶电化学信号的影响图，其中a为底物抗坏血酸2-磷酸酯的浓度的影响；b为硝酸银浓度的影响；c缓冲液ph的影响；d酶促银沉积反应时间的影响。

图5为检测不同浓度的碱性磷酸酶所得到的电化学信号。其中a为不同浓度的碱性磷酸酶所获得的溶出伏安信号曲线：a为0fmol/l；b为5×10^-2fmol/l；c为2×10^-1fmol/l；d为2fmol/l；e为2×10¹fmol/l；f为1×10²fmol/l；g为2×10²fmol/l；h为1×10³fmol/l；i为2×10³fmol/l；b为所获得的电化学信号与碱性磷酸酶浓度的关系图。

图6检测碱性磷酸酶的标准曲线图。

图7为检测碱性磷酸酶方法的特异性柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

下面以碱性磷酸酶为例，对基于酶促金属化的电化学信号转换放大对碱性磷酸酶的高灵敏检测方法进行详细的说明。

实施例1

一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1），将浓度为1.8mg/ml羧基化多壁碳纳米管的dmf溶液与浓度为1.9mg/ml聚乙烯亚胺的超纯水溶液等体积混合均匀，得到修饰溶液；

步骤（2），取修饰溶液滴涂于干净的电极表面，修饰溶液的用量为0.7µl/mm²，室温下晾干后，用超纯水冲洗，得到聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极；

步骤（3），将聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极置于4.9mmol/l的氯金酸水溶液中，在-0.2v的恒电位下沉积58s，即得到用于检测碱性磷酸酶的修饰电极。

实施例2

一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1），将浓度为2.2mg/ml羧基化多壁碳纳米管的dmf溶液与浓度为2.1mg/ml聚乙烯亚胺的超纯水溶液等体积混合均匀，得到修饰溶液；

步骤（2），取修饰溶液滴涂于干净的电极表面，修饰溶液的用量为0.75µl/mm²，室温下晾干后，用超纯水冲洗，得到聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极；

步骤（3），将聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极置于5.1mmol/l的氯金酸水溶液中，在-0.2v的恒电位下沉积62s，即得到用于检测碱性磷酸酶的修饰电极。

干净的电极的制备方法是：将电极在三氧化二铝中抛光至镜面，之后依次用无水乙醇超声清洗半分钟，再用蒸馏水超声清洗半分钟两次，接着将电极置于含有铁氰化钾和亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液中，在-0.2v~0.6v的电势范围内进行循环伏安扫描，电势差在80mv以下，表明电极清洗干净；

所述的含有铁氰化钾和亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液包括1mmol/l铁氰化钾、1mmol/l亚铁氰化钾以及ph为7.0的0.1mol/l磷酸缓冲液。

实施例3

一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1），将浓度为2mg/ml羧基化多壁碳纳米管的dmf溶液与浓度为2mg/ml聚乙烯亚胺的超纯水溶液等体积混合均匀，得到修饰溶液；

步骤（2），取修饰溶液滴涂于干净的电极表面，修饰溶液的用量为0.71µl/mm²，室温下晾干后，用超纯水冲洗，得到聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极；

步骤（3），将聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的电极置于5mmol/l的氯金酸水溶液中，在-0.2v的恒电位下沉积60s，即得到用于检测碱性磷酸酶的修饰电极（聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管-纳米金修饰的玻碳电极）。

干净的电极的制备方法是：将电极在三氧化二铝中抛光至镜面，之后依次用无水乙醇超声清洗半分钟，再用蒸馏水超声清洗半分钟两次，接着将电极置于含有铁氰化钾和亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液中，在-0.2v~0.6v的电势范围内进行循环伏安扫描，电势差在80mv以下，表明电极清洗干净；

所述的含有铁氰化钾和亚铁氰化钾的磷酸缓冲溶液包括1mmol/l铁氰化钾、1mmol/l亚铁氰化钾以及ph为7.0的0.1mol/l磷酸缓冲液。

其中所述的电极为玻碳电极.

实施例4

一种检测碱性磷酸酶的方法，采用实施例3制得的修饰电极，包括如下步骤：

步骤（1），将待测碱性磷酸酶溶液按体积比为1:0.95加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，得到反应液；

所述的含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有：4mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、1mmol/l硝酸银、1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，溶剂为水，ph为9.8；其中优选采用浓硝酸调节ph到9.8；

步骤（2），将修饰电极插入反应液中，于37℃避光反应38分钟，然后依次采用1mol/ltris水溶液和超纯水将修饰电极冲洗干净，最后将修饰电极放入1mol/lkcl水溶液中进行线性伏安扫描测定，根据检测到的电化学信号的强弱采用标准曲线法对碱性磷酸酶进行定量；待扫描测定完后，将修饰电极置于0.5mol/l的硫代硫酸钠水溶液中浸泡5min后，取出用超纯水冲洗干净，之后修饰电极用于下一个样品的检测。

其中扫描范围为-0.1~0.3v，扫描速率为100mv/s。

实施例5

一种检测碱性磷酸酶的方法，采用实施例3制得的修饰电极，包括如下步骤：

步骤（1），将待测碱性磷酸酶溶液按体积比为1:1.05加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，得到反应液；

所述的含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有：4mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、1mmol/l硝酸银、1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，溶剂为水，ph为9.8；其中优选采用浓硝酸调节ph到9.8；

步骤（2），将修饰电极插入反应液中，于37℃避光反应42分钟，然后依次采用1mol/ltris水溶液和超纯水将修饰电极冲洗干净，最后将修饰电极放入1mol/lkcl水溶液中进行线性伏安扫描测定，根据检测到的电化学信号的强弱采用标准曲线法对碱性磷酸酶进行定量；待扫描测定完后，将修饰电极置于0.5mol/l的硫代硫酸钠水溶液中浸泡10min后，取出用超纯水冲洗干净，之后修饰电极用于下一个样品的检测。

其中扫描范围为-0.1~0.3v，扫描速率为100mv/s。

实施例6

一种检测碱性磷酸酶的方法，采用实施例3制得的修饰电极，包括如下步骤：

步骤（1），将待测碱性磷酸酶溶液按体积比为1:1加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，得到反应液；

所述的含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有：4mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、1mmol/l硝酸银、1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，溶剂为水，ph为9.8；其中优选采用浓硝酸调节ph到9.8；

步骤（2），将修饰电极插入反应液中，于37℃避光反应40分钟，然后依次采用1mol/ltris水溶液和超纯水将修饰电极冲洗干净，最后将修饰电极放入1mol/lkcl水溶液中进行线性伏安扫描测定，根据检测到的电化学信号的强弱采用标准曲线法对碱性磷酸酶进行定量；待扫描测定完后，将修饰电极置于0.5mol/l的硫代硫酸钠水溶液中浸泡8min后，取出用超纯水冲洗干净，之后修饰电极用于下一个样品的检测。

其中扫描范围为-0.1~0.3v，扫描速率为100mv/s。

利用上述方法对一系列已知浓度的碱性磷酸酶进行检测绘制标准曲线，利用检测待测样品所获得的电化学信号在标准曲线上对应的碱性磷酸酶浓度来实现对碱性磷酸酶的定量检测。

2、特异性实验

为了考察方法的选择性，采用比碱性磷酸酶浓度高10⁷~10⁹倍的干扰物质，如2μmol/l辣根过氧化物酶、2μmol/l胰蛋白酶、20μmol/l苏氨酸、20μmol/l牛血清白蛋白、0.2μmol/l的免疫球蛋白作为阴性对照，加入到反应液中进行检测。

3、血清样品中碱性磷酸酶的检测

因为本发明的方法特别灵敏，因此取1μl的人新鲜血清，利用0.1mol/l，ph为9.8的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液稀释2500倍（二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，溶剂为水，采用浓硝酸调节ph到9.8），然后取一定量的稀释血清按1:1加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，混合均匀后插入修饰电极，采用与上述同样的方法对人血清中的碱性磷酸酶进行检测。另外还将一定量的碱性磷酸酶加入到人血清中测定其加标回收率。

实施例7

一种碱性磷酸酶的定量方法，采用实施例3制得的修饰电极以及实施例6所述碱性磷酸酶的检测方法，包括如下步骤：

步骤（1），将已知浓度的碱性磷酸酶标准储备液采用1mol/lph为9.8的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液逐级稀释得到一系列浓度介于0.05fmol/l~2pmol/l的碱性磷酸酶标准工作液（至少4个浓度）。

步骤（2）将所配好的碱性磷酸酶标准工作液以及不含碱性磷酸酶的二乙醇胺-硝酸空白溶液按体积比为1:1加入到含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液中，得到一系列反应液；

所述的含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有：4mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、1mmol/l硝酸银、1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，溶剂为水，ph为9.8；其中优选采用浓硝酸调节ph到9.8；

步骤（3），将修饰电极插入反应液中，于37℃避光反应40分钟，然后依次采用1mol/ltris水溶液和超纯水将修饰电极冲洗干净，最后将修饰电极放入1mol/lkcl水溶液中进行线性伏安扫描测定，记录所检测到的电化学信号。然后利用浓度的对数作为横坐标、电化学信号作为纵坐标绘制标准曲线，利用origin软件进行线性拟合。

其中扫描范围为-0.1~0.3v，扫描速率为100mv/s。

步骤（4）将待测样品利用1mol/lph为9.8的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液稀释合适的倍数（浓度较低时可不稀释）后，采用步骤（2）和步骤（3）所述的方法对该样品进行检测，获得该样品的电化学信号。利用该信号在步骤3所述的标准曲线上所对应的碱性磷酸酶浓度来实现对碱性磷酸酶的定量检测。

结果

1、酶促金属化的表征

图1是基于酶促金属化反应的电化学信号转换放大策略检测碱性磷酸酶的原理示意图。首先利用酶促金属化反应技术，在碱性磷酸酶的存在下，溶液中的抗坏血酸2-磷酸酯能快速的脱掉磷酸根，变成具有还原性的抗坏血酸。生成的抗坏血酸将溶液中的银离子还原为银单质，同时电极表面修饰的纳米金诱导银沉积到电极表面。然后对碱性磷酸酶的高灵敏检测通过电极表面银的lsv信号来实现。该方法可以成功地将碱性磷酸酶的催化电化学信号转换为银单质的lsv信号，利用纳米金诱导银沉积可以非常方便地将银单质富集到电极表面，从而极大地放大了电化学信号。

2、修饰电极的表征和修饰条件的选择

由图2所示，在fe(cn)6^3-/4-溶液中对不同修饰电极进行循环伏安扫描，曲线a为一对可逆的氧化还原峰是对裸玻碳电极的表征。聚乙烯亚胺功能化的多壁碳纳米管修饰的玻碳电极表面的循环伏安图如曲线b，峰面积比裸电极显著变宽，氧化还原峰电流显著增大，由于聚乙烯亚胺带正电，可以吸引带负电的fe(cn)6^3-/4-探针，另外多壁碳纳米管也可以加快fe(cn)6^3-/4-探针在电极表面的电子传递，而且使电极的表面积增大。当电极表面修饰上纳米金以后其循环伏安图如曲线c，峰电流下降，但充电电流进一步增加，这是由于纳米金的修饰可以使电极的表面积进一步增大，但是由于修饰的纳米金覆盖在聚乙烯亚胺表面，减弱了其对fe(cn)6^3-/4-探针的静电引力，从而使fe(cn)6^3-/4-的氧化还原峰电流显著下降。

为了增加检测灵敏度，我们优化了修饰电极表面电沉积纳米金的时间和氯金酸的浓度。

首先固定电化学沉积金的时间为60s，改变氯金酸溶液的浓度，所得到的2pmol/l碱性磷酸酶的电化学信号变化如图3中a所示，随着氯金酸的浓度的加入量从1mmol/l变化到5mmol/l时，电化学信号逐渐增大，当氯金酸浓度为5mmol/l时电化学信号达到最大，进一步增加氯金酸的浓度，电化学信号逐渐降低。

固定氯金酸的浓度为5mmol/l，改变电沉积纳米金的时间得到不同的修饰电极，然后将其应用于2pmol/l碱性磷酸酶的检测，所得到的电化学信号如图3中b所示。从图中可以看出随着纳米金的沉积时间从20s延长到60s，电化学信号逐渐增大，当沉积时间为60s时电化学信号达到最大，随后继续延长沉积时间，信号逐渐降低。

沉积纳米金时间长短和氯金酸的浓度对银的溶出伏安信号的影响主要是由于纳米金在电极表面覆盖率不同所导致的。纳米金在电极表面覆盖太少，成核位点少，不利于银离子在电极表面的催化还原，银沉积在电极表面的量少，所以电化学信号小；纳米金在电极表面覆盖太多，电极表面大部分聚乙烯亚胺都被纳米金覆盖（聚乙烯亚胺可以与银离子配位，有利于银离子在电极表面的沉积），从而影响电极表面的聚乙烯亚胺与银离子的配位，同样也会影响银离子的沉积，从而影响电化学信号。因此选择60s为最佳纳米金电沉积时间，采用5mmol/l的氯金酸进行电沉积。

3、酶促金属化检测条件的优化

为了提高检测的灵敏度，我们对影响酶促金属化反应的几种因素进行了研究，如抗坏血酸2-磷酸酯的浓度、agno3的浓度、含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液的ph及银沉积时间等因素。

在酶促金属化反应中，我们将修饰电极浸入含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液于37℃避光反应40分钟后，先用1mol/ltris水溶液清洗电极，再用超纯水清洗干净，放入1mol/lkcl中检测其电化学信号。我们分别固定银离子的浓度为1mmol/l，含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液ph为9.8，酶促银沉积反应时间为40分钟，改变抗坏血酸2-磷酸酯的浓度，如图4a所示，2pmol/l碱性磷酸酶的检测信号随抗坏血酸2-磷酸酯浓度的增大而增加，当抗坏血酸2-磷酸酯的浓度达到4mmol/l时，电化学信号达到最大，继续加大抗坏血酸2-磷酸酯的浓度并不能进一步增大电化学信号。因此，我们选择4mmol/l为抗坏血酸2-磷酸酯的最佳反应浓度。

同样agno3浓度也会影响酶促金属化反应。要使碱性磷酸酶催化抗坏血酸2-磷酸酯生成的抗坏血酸的量能最大限度及快速的在电极表面被氧化，必需要加入足够量的agno3。我们固定抗坏血酸2-磷酸酯的浓度为4mmol/l，含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液ph为9.8，酶促银沉积反应时间为40分钟，改变硝酸银的浓度。图4b是2pmol/l碱性磷酸酶的电化学信号随银离子的浓度的变化曲线，随着银离子浓度的增加，银的溶出伏安信号先增大后趋于稳定，银离子的浓度在1mmol/l时电化学信号达到最大。继续加大银离子的浓度信号并不会产生多大变化。因此，1mmol/l为硝酸银的最佳反应浓度。

其次，酶的催化活性受ph的影响。我们固定抗坏血酸2-磷酸酯的浓度为4mmol/l，硝酸银的浓度为1mmol/l，酶促银沉积反应时间为40分钟，改变含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液的ph，如图4c所示。2pmol/l碱性磷酸酶的检测信号随着ph的增大而增大，当缓冲液的ph为9.8时，检测信号达到最大，继续加大反应液的ph银的lsv信号逐渐降低，9.8作为反应最佳ph。

另外，电化学信号也会受酶促银沉积反应时间影响。如图4d所示，我们固定抗坏血酸2-磷酸酯的浓度为4mmol/l，硝酸银的浓度为1mmol/l，含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液ph为9.8，改变酶促银沉积的反应时间，2pmol/l碱性磷酸酶的检测信号随反应时间的延长而增大，当反应时间达到40min后，检测信号趋于稳定。因此，40min为酶促金属化反应的时间。

因此，最终得到的含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液含有：4mmol/l抗坏血酸2-磷酸酯、1mmol/l硝酸银、1mmol/lmgso4、1mol/l二乙醇胺，用浓硝酸调节ph到9.8，溶剂为水。

4、碱性磷酸酶的检测

在最佳的反应条件下，采用溶出伏安法，对含有不同浓度的碱性磷酸酶进行检测，实验结果如图5所示，随着碱性磷酸酶浓度的增加检测信号逐渐增大，当碱性磷酸酶的浓度在50amol/~2pmol/l范围内时，lsv信号与目标物浓度的对数呈线性关系（如图6所示），其线性方程为y=148+77·lgx，其中y为电化学信号（单位：µa），x为碱性磷酸酶的浓度（单位：fmol/l）。该方法的检测限（s/n=3）低至10amol/l，证明该方法可以用于碱性磷酸酶的高灵敏分析。相对于其它文献报道的碱性磷酸酶的检测方法，本发明所提出的基于酶促金属化的电化学信号转换放大策略对碱性磷酸酶的检测灵敏度至少高出几个数量级。

5、特异性

选择性是实验定量检测的重要指标，为了考察方法的选择性，采用2pmol/l碱性磷酸酶以及浓度比碱性磷酸酶高10⁷~10⁹倍的干扰物质，如2μmol/l辣根过氧化物酶、2μmol/l胰蛋白酶、20μmol/l苏氨酸、20μmol/l牛血清白蛋白、0.2μmol/l的免疫球蛋白作为阴性对照。从图7可以看出，只有碱性磷酸酶的存在才能产生大的电化学信号，干扰物质只能产生小的背景信号，证明该方法具有非常好的选择性。

6、人血清样品中碱性磷酸酶的检测

为了探讨该方法是否可以用于复杂样品中碱性磷酸酶的检测，我们将人新鲜血清采用二乙醇胺-硝酸缓冲稀释2500倍以后采用实施例6所述的方法进行检测，三次检测所得到的电化学信号的平均值约为158µa，利用其标准曲线计算得出碱性磷酸酶的含量为1.37fmol/l，因此该样品中碱性磷酸酶的浓度为3.4pmol/l。我们还采用加标回收法对人血清样品中的碱性磷酸酶检测。检测结果如表1所示，我们向稀释的人血清样品中分别加入10〜30fmol/l的碱性磷酸酶，其加标回收率在100.7%至104.2%之间，检测结果与加入量很好的吻合，表明该方法可以应用于复杂样品中碱性磷酸酶的检测。

表1人血清样品中碱性磷酸酶的检测

通过以上各项检测，证明本发明方法可以应用于碱性磷酸酶的检测，操作简单、灵敏度高，检测限可达到10amol/l，而且该方法不需要复杂的仪器，可以实现复杂样品中碱性磷酸酶的超高灵敏检测。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。