基于发夹式DNA探针的水中汞离子检测方法与流程

本发明涉及一种水中汞离子的检测方法，尤其是一种利用hg2+可特异性地与dna的胸腺嘧啶碱基（t）共价结合形成稳定的t–hg2+–t结构，改变荧光能量共振转移的距离来实现一步法的hg2+定量检测方法。

背景技术：

汞是一种具有显著生物毒性的水环境污染物，对人体健康具有严重危害，它能够引起肝炎、肾炎，甚至破坏人体的中枢神经系统，导致脑死亡，我们熟知的水俣病就是汞中毒引起的。目前，对重金属汞的传统检测方法包括电感耦合等离子体质谱法（icp-ms），原子吸收光谱法（aas）和电感耦合等离子发射光谱法等。这些方法虽然准确度高、灵敏度好，但由于所需仪器价格昂贵、操作复杂、检测周期长，而且不能进行现场在线分析，因此难以推广，一般只在具有国家资质认可的专业性机构才会用到。

随着科学技术发展，新型汞离子检测方法和仪器陆续出现，例如：化学分子传感器(othmanab,leejw,wujs,etal.j.org.chem.,2007,72(20):7634.)、纳米材料传感器(leejs,ulmannpa,hanms,etal.nanolett.,2008,8(2):529.)、dna修饰的化学传感器(miaop,liul,liy,etal.electrochem.commun.,2009,11(10):1904.)以及dna酶传感器(lit,dongsj,wangek,anal.chem.,2009,81(6):2144.)等。

自从ono等人利用一种含富t碱基的dna与hg2+形成稳定的t-hg2+-t复合物，并用于检测hg2+以来，这种特殊序列的dna探针传感器逐渐引起人们的广泛研究兴趣(onoa,togashih,angew.chem.int.ed.,2004,43(33):4300.)；如公开号为cn103045460a公开了“一种以发夹式dna为探针的可视化塑料基生物芯片及其制备方法和应用”，该文献中主要是强调芯片的制备方法，虽然也用到了发夹式dna探针，但所使用检测原理完全不同；公开号为cn102590170a公开了：“基于荧光共振能量转移对水溶液中汞离子和/或银离子同时进行检测的方法”，该文献是基于能量共振转移的方法对水中汞离子和银离子的同时检测，是利用一种含富t碱基的dna与hg2+形成稳定的t-hg2+-t复合物，但是该文献中使用的dna链为两条，利用的是两条链两端标记荧光染料供受体实现的能量共振转移，此方法不仅需要先使两条链互补配对，对实验条件的要求比较苛刻；公开号为cn102912011a公开了：“基于寡核苷酸链的荧光增强型hg2+检测芯片及方法”，该文献是利用能量共振转移对汞离子进行检测，但是使用的是互补碱基杂交配对原理，使用三条互补配对链，这些方法，影响实验的外界条件比较多，过程较为复杂，因此稳定性不好，容易受到某个因素的影响。为此，针对水中汞离子的检测，开发更加简便、快捷、准确的检测方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供一种利用hg2+可特异性地与dna的胸腺嘧啶碱基（t）共价结合形成稳定的t–hg2+–t结构，改变荧光能量共振转移的距离来实现一步法的hg2+定量检测。该方法灵敏度高，准确性好，利于推广到现场实时在线检测，有望提供一种稳定、准确、快速的检测重金属的方法。

本发明的目的在于提供一种基于发夹式dna探针的水中汞离子检测方法，所述检测方法是利用hg2+可特异性地与dna的胸腺嘧啶碱基（t）共价结合形成稳定的t–hg2+–t结构，改变荧光能量共振转移的距离来实现一步法的hg2+定量检测。

在上述检测方法中，所述检测方法的dna探针是一条dna两端标记满足能量共振转移条件的荧光染料，加入hg2+之后，hg2+会与dna探针上的t碱基生成t-hg2+-t的稳定结构，使dna链结构发生变化，同时染料之间距离发生变化，能量强度发生变化；其中：

所述检测方法的dna链为：5ˈ-cy3-caaatgaactttggtttcccttttcatttt-cy5-3ˈ。

所述检测方法的hg2+是1.5nm的最低检测限。

所述检测方法是直接将待检测的hg2+加入到配置好的dna溶液中，实现一步法检测。

本发明上述一种基于发夹式dna探针的水中汞离子检测方法，与现有技术相比，其优点与技术效果在于：该方法简单易行，不需要复杂的处理；同时该方法检测耗时短，检测成本低，且能为后续实时在线现场检测提供可能性。

附图说明

图1是本检测方法的原理图。

图2是本检测方法加入不同浓度的hg2+后，发夹dna探针的荧光发射光谱图。

图3是本检测方法加入不同浓度的hg2+与cy3后，荧光发射强度值变化的线性关系图。

具体实施方案

下面对本发明的具体实施方式作出进一步地说明。

实施上述发明所提供的一种基于发夹式dna探针的水中汞离子检测方法，是利用hg2+可特异性地与dna的胸腺嘧啶碱基（t）共价结合形成稳定的t–hg2+–t结构，改变荧光能量共振转移的距离来实现一步法的hg2+定量检测。该方法灵敏度高，准确性好，便于后续的进一步研究和推广。进一步地特征在于：一种发夹dna探针，两端标记荧光染料cy3、cy5，在没有hg2+时，两种染料距离非常近，能够发生荧光共振能量转移；当存在hg2+时，发夹结构上的t碱基能够与hg2+形成t-hg2+-t的结构，导致dna链发生翻转，发夹结构被破坏，标记在dna链上的荧光染料cy3与cy5之间的距离变远，它们之间的荧光共振能量转移作用减弱，引起cy3的发光强度发生变化。最后，通过检测cy3荧光发射强度的变化趋势，从而得到待测样品重金属hg2+的浓度。

本发明中hg2+检测的具体步骤如下：

dna探针原始溶液用配置好的tris-hcl缓冲溶液（10mm,ph=7.4）从100µm稀释到我们需要的浓度。

在发夹式dna探针溶液中分别加入不同浓度hg2+，并分别测其荧光光谱，并分析实验结果。

本发明中所使用的探针序列：

双标dna探针

5ˈ-cy3-caaatgaactttggtttcccttttcatttt-cy5-3ˈ；

单标cy3dna探针

5ˈ-cy3-caaatgaactttggtttcccttttcatttt-3ˈ；

单标cy5dna探针

5ˈ-caaatgaactttggtttcccttttcatttt-cy5-3。

实施例1

荧光标记发夹式dna探针激发波长的选择

本发明主要采取荧光分析的方法来进行hg²⁺的检测，荧光分析中一个重要的因素就是荧光激发波长的选择，因为在荧光分析中需要观察荧光发光强度，为了得到良好的发光强度，选择合适的激发波长很重要。而为了对实验中用到的荧光染料cy3和cy5的激发波长进行优化选择，我们对单标cy3与单标cy5的dna链进行了荧光光谱测试，结果表明cy3能被510-535nm波长的光激发，其荧光发射的峰位置在560nm，且随着激发光波长的增大，cy3的荧光发光强度缓慢增加；而cy5被610nm波长的光激发后荧光发射强度很高，但对510nm-560nm的激发光很不敏感；因此，我们采用510nm的光作为两端标记的dna链的激发光，既满足对cy3有很好的激发，同时可能对cy5的影响很弱；为了证明这一判断，我们用510nm的光激发两端标记的dna链，实验结果表明激发cy5的光主要来自cy3在600nm以上的发射光，这一结果证明，若用510nm作为荧光染料cy3、cy5的激发光，可以忽略激发光（510nm）以及cy3在560nm处的发射波长对cy5的发光强度的影响，所以本发明中选择510nm作为激发光波长。

实施例2

hg2+对单独荧光染料的影响。

本发明中利用hg²⁺与dna链上的t碱基之间的作用，形成t-hg²⁺-t的复合物引起dna链两端标记的荧光染料的荧光强度的改变，从而实现对hg²⁺的定量检测。因此hg²⁺本身对荧光染料荧光强度是否影响直接影响检测的准确性，我们在浓度均为0.002μm的cy3、cy5中加入不同浓度（0µm，1.25µm，2.50µm，3.75µm，5.00µm，6.25µm，7.50µm）的hg²⁺，实验证明hg²⁺本身对荧光染料的荧光强度没有影响。

实施例3

hg2+的定量检测

本发明中的荧光发夹式dna探针在初始状态时为发夹式结构，当探针链5´端标记的cy3被激发后，由于发生荧光共振能量的转移，cy3的大部分能量转移给3´端标记的cy5，cy3荧光发射强度降低。当加入hg²⁺后，发夹式dna探针上的t碱基与hg²⁺形成t-hg²⁺-t结构，导致dna链发生翻转，发夹结构被破坏，cy3、cy5之间的距离变远，它们之间的能量共振转移减弱，cy3荧光发射强度回升。在0.002µm的两端标记的发夹式dna探针链中分别加入不同浓度（0µm，1.25µm，2.50µm，3.75µm，5.00µm，6.25µm，7.00µm）的hg²⁺，并分别测其荧光光谱，实验发现当hg²⁺浓度为0µm时，dna链上标记的cy5有非常高的荧光发射强度，说明此时cy3与cy5之间发生了能量共振转移，dna探针为发夹式结构；随着加入的hg²⁺浓度的增大，cy3的荧光发光强度不断增强，而cy5的荧光强度在降低，说明在hg²⁺存在的情况下，cy3与cy5之间的能量共振转移减弱了，进而证明hg²⁺与dna链上的t碱基形成了t-hg²⁺-t结构。

在上述的基础上，我们分析加入的hg²⁺浓度与cy3荧光发射强度变化趋势的关系，结果如附图2所示。图中f0代表cy3在初始状态下荧光发射强度，f代表加入hg²⁺后cy3的荧光发射强度。可以看出，hg²⁺的浓度与cy3荧光发射强度相对变化值有良好的线性相关度，其线性相关系数r=0.9836，如附图3所示。