一种评估纯钛材料表面骨原细胞成骨分化能力的方法。
背景技术：
用于体外培养的骨原细胞在具有不同结构纯钛表面其成骨分化能力会有不同。常规评估纯钛材料促进骨原细胞成骨分化能力的方法主要为宏观上生物化学手段进行统计学意义的测量，包括相关基因表达的检测，特异性蛋白—碱性磷酸酶、骨钙素等活性的检测，特定分泌物—矿化结节分泌量等的检测。这些方法的测试只能体现骨原细胞受到纯钛表面结构刺激后成骨分化过程中的生物学行为，而骨原细胞细胞本身与纯钛材料之间的微观水平上相互作用机制无从得知。而了解材料结构刺激细胞分化的微观作用机制对于进一步优化结构设计，从而提高材料生物相容性，促进材料表面细胞成骨分化有着十分重要的作用。因此，本发明的目的在于提供一种新的对于纯钛种植体材料表面设计更具指导意义的评估骨原细胞成骨分化能力的方法。该方法基于单细胞水评估细胞对材料表面结构的响应。一般而言，细胞在不同结构的材料表面因为力传导会表现出不同的形态、粘附力、骨架结构，进而影响细胞的力学特性，而最主要的就是细胞刚度—弹性模量表征。已有研究表明，在培养初期细胞对材料的粘附作用越好，细胞弹性模量越大，表明材料与细胞的生物相容性越好；骨原细胞成骨分化后，分化程度越大，细胞弹性模量越小。因此，可以用细胞表面弹性模量表征不同材料促进骨原细胞成骨分化能力的大小。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的对于种植体材料表面设计更具指导意义的评估骨原细胞成骨分化能力的方法。本发明，应用原子力显微镜(以下简称afm)，在生理环境下测试活细胞弹性模量来评估材料表面骨原细胞成骨分化能力，实现单细胞水平评估细胞与材料之间相互作用的机制。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种评估纯钛材料表面骨原细胞成骨分化能力的方法，包括下面的步骤：
1)分别制作多组结构各异的纯钛种植体片；
2)用afm扫描形貌图表征各种结构的表面形貌；
3)将步骤1)制作的各组纯钛种植体片进行清洗、灭菌、消毒，放入孔板中备用；
4)将处于对数增殖期的细胞接种到孔板中的各个不同结构的钛表面，每种结构的纯钛种植体片，用完全培养基培养细胞增长至融合度达到80％后换成骨诱导培养基继续诱导培养，分别在诱导培养后1，3，7，14，21，28天将长有细胞的钛片取出应用afm进行细胞力学性能的测试，每个样品选择10个细胞进行测试；
5)选用一种探针，标定探针端部半径r、探针弹性系数k以及检测器的灵敏度s，用扫图模式扫描得到细胞形貌，选定细胞核周围细胞骨架明显的区域5um*5um，在力曲线阵列模式下在该区域测试，得到一组线阵列，应用hertz模型计算细胞弹性模量e。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：
第一，该方法为单细胞水平细胞性能测试，与其他生物化学方法在整体水平研究细胞基因、蛋白的表达，分泌物的检测相比，可以更加直观精确的分析细胞的状态。同时可以了解细胞受到表面结构不同的材料刺激后细胞骨架和表面弹性模量的不同。同时各种材料在相同的培养时期对于骨原细胞成骨分化的诱导作用会有不同。弹性模量的不同对于分析各种结构对细胞的力学传导有重要的指导意义。
第二，该方法利用afm作为测试手段，可在生理环境中测试活细胞，可以有效避免其他测试手段中因为其他生物试剂的加入引起一定的反应对细胞造成不可恢复的损害。同时afm测试模量之前可以测试细胞形貌图，有很强的定位性和实时性。
附图说明
图1为典型力曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的进行详细的描述。
首先结合当前的研究现状，设计并制作四种表面结构各异的纯钛种植体圆片分别为：抛光钛、酸蚀钛、碱热钛、酸蚀-碱热复合结构钛。用afm扫描形貌图表征各种结构的表面形貌，比较各种钛片形貌和表面粗糙度。钛片依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗、高温高压灭菌，加入24孔板中备用。
将处于对数增殖期的mc3t3-e1(小鼠成骨细胞系)，以4*104cells/cm2的密度接种到24孔板中四种不同结构的钛表面，每种结构8个钛片。用完全培养基(89％dmem/high+10％胎牛血清+1％青链霉素混合液)培养细胞，并在细胞接种24h，48h后每种结构钛片各取出一片进行细胞力学性能的测试。增长至融合度达到80％后换成骨诱导培养基(完全培养基中添加50mg/l抗坏血酸、10mmβ-甘油磷酸钠、1um地塞米松)继续诱导培养。再分别在诱导培养后1，3，7，14，21，28天将长有细胞的各种结构的钛片取出进行细胞力学性能的测试。
力学性能测试举例(以抛光钛表面接种细胞后24h的测试为例)说明：
取mc3t3-e1(小鼠成骨细胞系)対数増殖期的细胞以4*104cells/cm2的密度传代接种到抛光钛片上。接种后24h，用afm测试细胞力学性能。
afm选择tappingmodeinair模式，安装探针mlct-c，调整激光，扫描粗糙样品形貌，根据形貌信息标定探针端部半径r。
afm切换到forcevolumeinfluid模式。重新装针，调整激光，准备细胞测试。
将取出的抛光钛片用pbs清洗2次，将钛片放到直径60mm的培养皿中。在培养皿中加入完全没培养基4ml于培养皿中置于样品台。
首先将探针置于培养皿底部(避开钛片)，用ramp功能做在皿底做力曲线，标定afm四象限检测器的灵敏度s。用热噪声的方法标定探针弹性系数k。
随后，移动培养皿位置，调整探针位置于钛片表面，重新调整激光。在光学显微镜下随机选择并定位在细胞中心，在scan功能下扫图得到细胞表面形貌。在扫描得到的形貌图中利用zoom功能选择细胞核周围细胞骨架明显的区域以5um*5um的扫描范围，在forcevolume功能测试得到16*16条力曲线。
其中forcevolume测试中主要参数设置为：
ramprate(afmz向压电陶瓷压入速度)：1hz
numberofsamples(力曲线采样点数)：1024，
triggermode(力曲线测试触发模式):relative
datatype(力曲线测试触发模式数据类型)：deflectionerror
trigthrishold(力曲线压力最大值)：200pn
forceperline(单条扫描力曲线条数):16
典型力曲线如图1所示，曲线一为进程曲线，曲线二为回程曲线。弹性模量测试应用进程曲线，以下简称力曲线。
由于细胞很软，测试过程会出现异常力线。比如在压电陶瓷自动调整压入的起始位置时产生的波动，细胞表面硬度不均引起的曲线抖动等等。因此应用qt编写c++程序对forcevolumemode得到的16*16条力曲线进行处理。
首先，剔除探针抖动、探针调整高度等原因导致的异常的力曲线。
该力曲线是探针受到的样品的作用力f与压电陶瓷z向位移z的关系，且为离散曲线。因此，该力曲线对应1024个(fi，zi)点。
fi＝f(zi)(1)
而探针受到的样品的作用力满足
f＝k*d(2)
其中d为悬臂梁偏移量，k为悬臂梁的弹性系数。
探针压入细胞深度δ满足
δ＝z-d(3)
利用hertz模型计算细胞弹性模量
f＝4*e*r2*δ3/2/(3*(1-ν2))(4)
其中f为探针受到的样品的作用力，e为样品的弹性模量，r为针尖的端部半径，，ν为泊松比。
首先根据公式(2)、(3)，得到f-δ之间的关系，即得压痕力曲线。
随后，确定压痕力曲线的接触点，即探针与细胞刚刚发生接触的点。探针与细胞接触到之前因为系统和液体的关系，曲线显示探针仍受到力的作用，因此需要确定压痕力曲线的实际接触点。对压痕力曲线进行二次离散微分。确定二次微分曲线前30％部分的噪声△，选择在微分曲线中首次出现超过2△的点为接触点。
接触点即为f-δ的(0,0)点。由于f-δ也是离散曲线，根据公式(4)计算每个点对应的弹性模量ei，取平均值e，即为该条曲线得到的细胞的弹性模量。
按同样的方法处理所有的正常力曲线，并对结果进行统计学处理。至此，对一个细胞进行力曲线测试，从而计算模量完成。
换其他细胞进行测试。并统计各细胞的测试结果。
对各种材料上细胞测试完成后，结果分析如下：
在接种后24h和48h，测试细胞模量，模量越大，说明细胞对基底的黏附作用越好，材料对该种细胞的相容性越好；诱导分化后各个阶段测试细胞模量，模量越小，说明细胞分化程度越好，同时说明该种表面结构的纯钛材料的生物相容性越好。