本发明涉及基因工程、噬菌体展示技术以及elisa检测技术领域，具体地说，涉及一步法检测甲萘威残留的elisa试剂盒及其应用。
背景技术：
甲萘威是一种氨基甲酸酯杀虫剂，这类农药残留的常规检测主要是应用仪器分析法，包括气相色谱法(gc)和高效液相色谱法(hplc)等。这些分析方法所需的仪器价格昂贵，样品的分离、提取、净化、衍生等前处理复杂，分析速度慢、检测灵敏度低，难以满足现场快速检测需求。许多理化分析技术本身存在局限性，如甲萘威的热稳定性差，难于用气相色谱法分析，而液相色谱尚缺乏选择性好的高灵敏度检测器等。随着待检样品、特别是要求现场快速检测样品量的迅速增加，传统的农药残留分析手段难以适应要求。
胆碱酯酶抑制法是利用有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的抑制作用原理而建立的一种农药残留检测方法，具有通用性强、简便快速等优点，一定程度上满足了现场检测需求，但其灵敏度低，在0.1-10mg/l范围内，难以满足痕量检测需求。因此，亟待开发一种高效农药残留快速分析技术。
基于常规抗体显色原理(hrp酶标二抗显色、2m硫酸终止反应)的甲萘威残留酶联免疫吸附分析方法，添加待测样品和标准品反应30-60min后，还需添加酶标二抗反应30-60min，步骤较多、耗时较长，且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低的缺点。本发明以抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体(纳米抗体与碱性磷酸酶定向偶联后的融合表达蛋白)为基础，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30-60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。
技术实现要素：
本发明的目的是针对目前农药残留仪器分析方法成本高、前处理复杂、特异性差、灵敏度低和难以实验现场检测等缺点；常规elisa检测试剂盒操作步骤较多、耗时较长，且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低等缺点，提供一种具有高特异性、高灵敏度、高准确度、高精确度、操作方法简单，并能用于大批量样品快速检测的，一步法检测甲萘威残留的elisa试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明提供一种抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体(噬菌体纳米抗体与碱性磷酸酶定向偶联而成的融合蛋白)，所述抗体的氨基酸序列如seqidno:4所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，将seqidno:4所示序列去掉末端6个组氨酸标签后的氨基酸序列。
所述抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体可以按如下方法进行制备：利用已筛选得到的特异性甲萘威噬菌体纳米抗体的序列(seqidno:1)，利用基因工程技术将其序列c端与碱性磷酸酶n端进行定向偶联，得到兼具二者功能的融合蛋白，将其表达纯化，得到灵敏度高，特异性强的抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体。制备的vhh-ap基因工程抗体分子小，可溶性强，耐高温，易纯化，易表达，且在elisa检测过程中无需hrp酶标二抗，加样反应后可直接显色。
本发明提供的一步法检测甲萘威残留的elisa试剂盒，包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂，其中，所述酶标板的每个孔包被有甲萘威包被抗原，所述试剂包括所述抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体、甲萘威标准溶液、缓冲液pbs、洗涤液pbst、显色液和反应终止液等。
所述甲萘威包被抗原为半抗原n-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸与牛血清蛋白的偶联复合物，所述包被抗原的制备方法如下：(1)将30.2mgn-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸、13.9mgn-羟基琥珀酰亚胺和24.3mgn,n'-二环己基碳二亚胺溶于1ml无水二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜反应。将反应液离心(5000rpm，10min)，弃沉淀，收集上清液，上清液中含有活性酯。(2)将牛血清蛋白20mg溶于0.05m，ph9.6的碳酸盐缓冲液2ml中，搅拌下逐滴加入所述上清液(约200μl/滴)，滴加时缓慢，约20min加完。然后室温下继续搅拌反应4h。(3)反应结束后，将反应液装入透析袋内用pbs(0.01mol/l，ph7.4)透析；每6h换液一次，共换液5-6次。透析后离心，弃沉淀，收上清液，作为抗原包被液。
所述酶标板为96孔酶标板，包被抗原的包被浓度约为165ng/ml。
所述抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体的浓度为2.67μg/ml。
所述显色液由甘氨酸7.51g、mgcl2·6h2o0.203g、zncl20.136g、对硝基苯磷酸二钠(pnpp)1g和蒸馏水1000ml配制而成，ph值10.4。
所述反应终止液为3m的氢氧化钠。
本发明还提供一种甲萘威elisa检测试剂，其有效成分为所述抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体。
本发明进一步提供所述试剂盒或试剂在elisa法检测样品中甲萘威残留中的应用。分析检测时，向包被有所述甲萘威包被抗原的酶标板的各孔中依次加入待测甲萘威样品和所述抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体，固相包被抗原和待测甲萘威相互竞争与纳米抗体反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的纳米抗体含量均一致，因此当待测的甲萘威浓度高时，则被结合在固相抗原上的抗体少，最后加入显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的od值低，表明抑制率高；反之，当待测甲萘威浓度低时，则所测的od值高，抑制率低。根据用已知浓度的甲萘威标准溶液检测所绘制标准曲线，即可推算出待测甲萘威的浓度。
本发明的优点是能准确灵敏地检测水和土壤中甲萘威残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法。本发明对解决大批量样品的甲萘威残留现场监控技术问题具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明实施例4中基于vhh-ap基因工程抗体的甲萘威的标准抑制曲线。曲线回归方程为y＝0.8557+0.9268/[1+(x/27.865)^0.1515](r2＝0.9798)抑制中浓度ic50＝41.77ng/ml，最低检测限ic10＝8.14ng/ml。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1半抗原n-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸的合成
5.6gnaoh(0.139mol)溶于56ml蒸馏水中，加入20gα-萘酚(0.139mol)。混合物在85℃下搅拌反应1h，冷却至室温。在通风橱内缓慢加入过量的三光气(19.3g三光气和100ml甲苯)，室温下搅拌反应1h。有机相用无水na2so4干燥，真空减压除去有机溶剂，得到棕色油状物质。将其溶于二氯甲烷，真空蒸馏(1mmhg)，收集100℃的馏分，得到13.7g淡黄色油状产物氯甲酸萘酯。
称7.37g6-氨基己酸(56.1mmol)溶于7.5ml、4mol/l的naoh中，冷却至4℃。将6.25g氯甲酸萘酯(30.3mmol)溶于11ml1,4-二氧杂环己烷中，冷却至4℃，然后与7.5ml4mol/l冷naoh混合，在冰浴中分5次等批量加入到6-氨基己酸碱液中，每次加入至少间隔5min，搅拌反应3h后，用浓盐酸将ph调至4。所得油状产物用乙酸乙酯萃取3次(每次用量35ml)，有机相用1mol/l的盐酸洗涤2次(每次用量15ml)，然后用1mol/l的nahco3萃取3次(每次用量50ml)，萃取液最后在冰浴中用ph3的浓盐酸酸化，得到黄色固体物。洗涤、重结晶，得到4.8g干燥白色终产物n-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸。
实施例2甲萘威包被抗原的制备
以半抗原n-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸和牛血清蛋白制备偶联复合物，作为包被抗原。制备方法如下：
(1)将30.2mgn-(1-萘氧羰基)-6-氨基己酸、13.9mgn-羟基琥珀酰亚胺和24.3mgn,n'-二环己基碳二亚胺溶于1ml无水二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜反应。将反应液离心(5000rpm，10min)，弃沉淀，收集上清液，上清液中含有活性酯。
(2)将20mg牛血清蛋白溶于2ml0.05m，ph9.6碳酸盐缓冲液中，搅拌下逐滴加入所述上清液(约200μl/滴)，滴加时缓慢，约20min加完。然后室温下继续搅拌反应4h。
(3)反应结束后，将反应液装入透析袋内用pbs(0.01mol/l，ph7.4)透析；每6h换液一次，共换液5-6次。透析后离心，弃沉淀，收上清液，作为抗原包被液。
实施例3甲萘威噬菌体vhh-ap基因工程抗体的构建
前期通过噬菌体展示技术筛选得到特异性甲萘威纳米抗体(seqidno:1)，提取保存的特异性甲萘威纳米抗体质粒，克隆出vhh基因片段，用限制性内切酶sfii修饰粘性末端，通过t4连接酶将vhh基因片段连接至载体pecan45(见wangj,majkovaz,bevercrs,etal.one-stepimmunoassayfortetrabromobisphenolausingacamelidsingledomainantibody–alkalinephosphatasefusionprotein[j].analyticalchemistry,2015,87(9):4741.和liux,xuy,wandb,etal.developmentofananobody-alkalinephosphatasefusionproteinanditsapplicationinahighlysensitivedirectcompetitivefluorescenceenzymeimmunoassayfordetectionofochratoxinaincereal[j].analyticalchemistry,2015,87(2):1387.载体pecan45由美国冷泉港海军研究实验室jinnyl.liu博士和ellenr.goldman博士馈赠)，高效电转化至大肠杆菌top10f’，复苏后涂布于固体培养基过夜培养。次日，挑取若干单克隆于sb-羧苄培养基(羧苄青霉素工作浓度为50mg/l)中培养，经测序鉴定后，保存正确的克隆用于表达目的蛋白。
pcr：
反应体系如下：
反应程序如下：
pcr引物序列如下(seqidno:2-3)：
ap-f：5’-catgccatgactgtggcccagccggcccagktgcagctcgtggagtcnggngg-3’
ap-r2:5’-catgccatgactcgcggcccccgaggcctggccttgttttggtgtcttggg-3’
其中，k表示碱基g/t，n表示碱基a/t/g/c。
实施例4特异性甲萘威vhh-ap基因工程抗体的表达
提取阳性单克隆质粒，化转至大肠杆菌top10f’感受态细胞，复苏后涂布于固体培养基过夜培养。次日，挑取单个克隆于sb-羧苄培养基(羧苄青霉素工作浓度为50mg/l)中培养，加入iptg诱导过夜表达；次日，用超声破碎仪裂解细胞，滤膜过滤后用镍柱纯化，即利用组氨酸标签与镍柱中氯化镍的亲和层析对vhh-ap基因工程抗体进行分离纯化，得到高纯度的抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体，经氨基酸测序分析，所得vhh-ap基因工程抗体的氨基酸序列如seqidno:1所示。
实施例5一步法检测甲萘威残留的elisa试剂盒及其应用
所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的96孔酶标板以及设在盒体内的试剂，其中，所述酶标板的每个孔包被有实施例4的甲萘威包被抗原，所述试剂包括实施例4的抗甲萘vhh-ap基因工程抗体、甲萘威标准溶液、缓冲液pbs、洗涤液pbst、显色液和反应终止液等。
抗甲萘威vhh-ap基因工程抗体的浓度为2.67μg/ml。
显色液由甘氨酸7.51g、mgcl2·6h2o0.203g、zncl20.136g、对硝基苯磷酸二钠(pnpp)1g和蒸馏水1000ml配制而成，ph值10.4。反应终止液为3m的氢氧化钠。
将包被抗原包被于96孔酶标板上，每个孔包被浓度为165μg/ml，4℃过夜反应；次日，甩出孔中的液体，用含0.05％吐温的pbst洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；加入封闭液，37℃孵育30分钟，甩出孔中的液体，用0.05％pbst洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；配制0ng/ml，1ng/ml，4ng/ml，12ng/ml，37ng/ml，111ng/ml，333ng/ml，1000ng/ml的甲萘威标准液，加入50μl标样或处理好的样品到各孔中，标样和样品做2-4个重复，加入50μl稀释的vhh-ap基因工程抗体，37℃孵育30分钟；甩出孔中的液体，用pbst洗3次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；取显色液(其中pnpp现成加入并混匀)，每孔加150μl，避光显色10～15分钟，每孔加入终止液50μl终止反应，酶标仪上测定各孔在波长为405nm处的od值。
将含0ng/ml标准品孔的od值减去含最大浓度标准品孔的od值定为b0，其余孔经同样方法校正后的od值定为b；以b/b0值为纵坐标，相应标准品浓度为横坐标，绘制甲萘威标准抑制曲线(图1)。根据曲线的回归方程可以求出对应样品的浓度，也可以求出甲萘威抑制中浓度ic50(b/b0＝50％)及最小检测限ic10(b/b0＝90％)。
实际样品检测过程中，酶标板孔壁上吸附的包被抗原(包被浓度为165ng/ml)和待测甲萘威相互竞争与抗体反应，竞争结果通过显色反应出来。检测已知浓度的甲萘威并绘制标准曲线，可以推算出待测甲萘威的浓度。
本发明的优点是能准确灵敏地检测水、土壤和蔬菜中甲萘威残留，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统的仪器检测方法，常规抗体显色原理的elisa试剂盒步骤较多、耗时较长，且由于受到酶标二抗特异性和灵敏度的影响，具有稳定性相对较低等缺点，采用一步法酶联免疫吸附分析方法，无需酶标二抗，添加样品和和标准品反应30-60min后即可直接显色。其检测效率、热稳定性均优于常规抗体显色原理的酶联免疫分析方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一步法检测甲萘威残留的elisa试剂盒及其应用
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