本发明涉及生物检测
技术领域：
，尤其涉及一种食源性致病菌快速检测试剂盒。
背景技术：
：对于食物或食品微生物污染的检测，主要通过检测微生物的初级代谢产物或者次级代谢产物，甚至还包括微生物的菌体本身。由于以上检测目标多少是小分子物质或者一些短肽氨基酸等，所以检测方法主要使用仪器分析法，如分光光度计法、高效液相色谱法和气质联用法。然而hplc、hplc-ms、gc-ms测定方法相当复杂，需受过专门训练的人员才能操作，检测前需要对样品进行预处理，预处理的步骤也比较繁琐，且检测通量很小，仪器比较昂贵，很多基层单位不具备这种条件。对于目前我国经济来说单纯地采用大型仪器检测监控产品质量，很不现实，也不经济实用，且仪器分析法也无法满足现场或者大批量的快速筛查检测。免疫酶技术利用了抗原-抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定，达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的部位，以及对其进行定量的目的。可分为固相、均相和双抗体酶免疫测定技术。酶联免疫吸附试验(elisa)是目前应用最广泛的固相免疫酶测定技术。将免疫酶检测技术应用到水产品污染物检测也是一个新思路。动物的肠膜也是一种比较完善的自然膜结构，具有高强度的机械性能，层级网络结构复杂，是良好的生物屏障，具有一般的渗透膜的功能。可以这些优质的膜结构应用到生物制品中，提高资源的利用率。技术实现要素：针对现有技术的上述不足，本发明提供一种食源性致病菌快速检测试剂盒，以解决上述的技术问题。单增李斯特菌是引起食源性疾病的主要病原菌之一，也是我国沿海食物中毒和夏季腹泻的重要病原菌。本发明是通过以下技术方案实现的：一种食源性致病菌快速检测试剂盒，包括胶体金试纸，所述试纸由样品层10、胶体金标记层20、检测反应层30、吸水层40组成，所述胶体金标记层上包被有抗单增李斯特菌抗体，所述检测反应层上设置有检测线t和质控线c，所述检测线上包被有单增李斯特菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔igg，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。附图说明图1是本发明的结构示意图。其中：样品层10、胶体金标记层20、检测反应层30、吸水层40、检测线t、质控线c。具体实施方式结合以下实施例对本发明作进一步描述。一种食源性致病菌快速检测试剂盒，包括胶体金试纸，如图1所示，所述试纸由样品层10、胶体金标记层20、检测反应层30、吸水层40组成，所述胶体金标记层上包被有抗单增李斯特菌抗体，所述检测反应层上设置有检测线t和质控线c，所述检测线上包被有单增李斯特菌抗原，所述质控线包被有羊抗兔igg，所述检测用金标抗体可以与检测用包被抗原结合反应并显色，且检测用金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点；所述样品层、胶体金标记层和检测反应层按照从左至右、从上至下的顺序依次结合在背衬板同一面上，胶体金标记层和检测反应层的端部重叠；所述吸水层结合在检测反应层的另一端。优选地，所述胶体金标记层上包被有抗单增李斯特菌抗体是以单增李斯特菌体作为抗原免疫动物后制备获得的。优选地，所述样品层为吸水性良好的材料制成；所述背衬板为塑料制成。优选地，所述检测线为1～4条，质控线为1～4条。更优选地，所述所述检测线为1～2条，质控线为1～3条。优选地，所述胶体金标记层和检测反应层的材料为动物肠道膜制备的生物膜。优选地，所述猪肠道膜制备的生物膜。优选地，所述胶体金标记层为猪小肠膜制备的生物膜，所述检测反应层为猪小肠膜制备的生物膜。本发明首次将动物肠道膜应用于生物检测器械中，节约生物制品的制造成本，提高资源利用率，有利于生物制品的快速发展。结果判断：质控线的作用是：无论样品溶液中是否含有单增李斯特菌，胶体金标记层包被的金标抗体上移到达质控线时都可以与质控线上的igg结合，聚集形成肉眼可见的红色颗粒，质控线始终显色，如果质控线不显色，表示本次测试无效。本发明严格控制胶体金标抗体、单增李斯特菌抗原和羊抗兔igg的比例。具体应用时，可根据不同的检测线或参数线的显色与否以及颜色的深浅，判定样液中是否含有单增李斯特菌，以及含量的多与少，实现半定量检测。当两条检测线t1和t2均显红色时，则样品为阴性(即不含单增李斯特菌)；当检测线t1显色，检测线t2不显色时，则样品中含有单增李斯特菌，但其浓度不高；当两条检测线均不显色时，则样品中单增李斯特菌的浓度很高，以此进行半定量检测。当检测线t颜色深于参考线c3时，则样品为阴性(不含单增李斯特菌或极微量)；当检测线t颜色深于c3浅于参考线c2时，则样品含有单增李斯特菌，浓度比较低；当检测线t颜色深于c2浅于c1时，则样品中含有单增李斯特菌，浓度比较高；当检测线t不显色时，则样品中含有单增李斯特菌，浓度非常高，以此进行半定量检测。作为优选地实施例，以下将详细介绍猪小肠膜应用于生物膜的方法，包括以下步骤：s1.将收集到的猪小肠膜保湿，具体为定期喷淋37℃去离子水，后续操作过程保持猪小肠膜保持湿润的状态；s2.轻轻地将半球状猪小肠膜沿着经线切开、摊平，即将猪小肠膜平面化；s3.将上述步骤的猪小肠膜置于烧杯中，加入适量去离子水，将烧杯置于振荡器上，46℃，100-120rpm，振荡1-2h，振荡结束后，将蛋壳膜置于流动缓慢的水中漂洗，清除膜表面杂质；s4.将上述步骤的猪小肠膜置于平面上，使用镊子将猪小肠膜分层外膜和内膜；s5.将外膜置于50mmtris-hcl(ph7.5)，10mmcacl2溶液中，置于磁力搅拌器上，孵育40-55℃，30min，每100ml上述溶液加入20mg/ml的蛋白酶k100ul，继续孵育10-20min；s6.将内膜置于50mmtris-hcl(ph7.0)，10mmcacl2溶液中，置于磁力搅拌器上，孵育40-55℃，10min，每100ml上述溶液加入20mg/ml的蛋白酶k10ul，继续孵育5-10min；s7.步骤s5和s6反应结束后，快速取出，置于流动的自来水中冲洗3-5min，之后使用75％酒精清洗3-5次，每次5min；s8.上述步骤的膜使用去离子水清洗3-5次，每次3min，结束后4℃，保湿保存备用。本发明的免疫层析试剂盒，金标抗体上只有一个与抗原特异结合的位点，具有特异性强；灵敏度高，达到7.63ng/ml，检测速度快、通量大、操作简单方便、颜色稳定、检测温度适宜范围宽、试纸保质期长和成本低廉等优点，并能够实现半定量检测。该快速检测试纸条在4～40℃都可使用，5～15min以后便可观察结果，适合于食品药品、环保、检验检疫等部门对样品中的单增李斯特菌进行快速检测实验例分别使用本发明的免疫层析试剂盒、高效液相色谱、紫外分光光度计检测水产品中的单增李斯特菌的含量，同种方法进行10次检测，检测结果取平均值计算，统计结果如表1所示。表1检出极限(ng/ml)准确度免疫层析试剂盒7.6398.4％高效液相色谱7.4798.9％紫外分光光度计19.3997.6％综合表1检测结果可以看出，本发明的免疫层析试剂盒不管是检测极限还是准确度，与精度较高的高效液相色谱法都非常接近，同时本发明的试剂盒使用方便，检测成本更低，由于本发明的胶体金法操作简单，耗时段，对检测样品不需要进行发杂的预处理，有利于条件一般的基层单位开展工作，也方便相关部门进行现场快速检测。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。当前第1页12