一种Cyr61蛋白检测试剂盒及其使用方法与流程

本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种cyr61蛋白检测试剂盒及其使用方法。

背景技术：

cyr61(cysteine-rich61)，又称为ccn1，蛋白由381个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸和脯氨酸残基，相对分子质量为42kda。最早被克隆的cyr61是1985年lau等在用血清或血小板衍生生长因子(pdgf)刺激小鼠balb/c3t3成纤维细胞时发现的，因富含半胱氨酸(含10％的半胱氨酸残基)被命名为cyr61。目前已知，cyr61广泛表达于多种正常组织细胞，包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、膀胱及血管平滑肌细胞、间质细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞等。

cry61是一种十分重要的细胞基质调节因子在细胞的黏附、迁移与增殖以及血管生成、炎症反应和组织重构等重要生理、病理过程中发挥重要的调节作用。而cyr61异常的表达会导致癌症和一些慢性炎症疾病的发生。本发明申请人之前曾经发现cyr61的异常表达升高会导致滑膜的过度增生导致骨关节腔的破坏，在风湿性关节炎进程中有着非常重要的作用；cyr61的高表达刺激角质形成细胞，促进其增生导致皮肤增厚参与银屑病的发生发展；还发现cyr61可以刺激滑膜细胞使得il-8表达提高，募集中性粒细胞到局部参与炎症反应，因此检测cyr61的表达丰度具有非常重要的临床意义。然而目前cyr61在正常人外周血清中浓度情况却并不是非常明确，以及它未来是否能作为一个血清学检查指标也不是很清楚。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种cyr61蛋白检测试剂盒，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种cyr61蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括cyr61捕获抗体、cyr61检测抗体、cyr61检测抗体对应的二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂以及辣根过氧化物酶显色底物；

所述cyr61检测抗体对应的二抗标记有生物素。

本发明采用抗cyr61单抗和多抗，建立了双抗夹心法检测cyr61的含量。该试剂盒检测灵敏度高，可重复性好。

根据本发明的一方面，本发明还涉及使用如上所述的试剂盒检测cyr61蛋白的方法，包括：

1).将包被有cyr61捕获抗体的固相支持物用封闭液进行封闭化处理；

2).加入稀释后的待检样品和标准品，与cyr61捕获抗体孵育结合；

3).加入cyr61检测抗体进行孵育；

4).加入cyr61检测抗体对应的二抗进行孵育；

5).加入辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂进行孵育；

6).加入辣根过氧化物酶显色底物进行显色反应；

7).终止反应，检测od值，根据od值的大小判断cyr61的蛋白含量。

该方法敏感性高，操作简单。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本试剂盒能特异性地检测cyr61的含量。该试剂盒灵敏度高且操作简单，检测患者样本时，不需要进行样品酸化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例3检测得到的标准曲线；

图2为双抗夹心法检测cyr61含量时od值与cyr61浓度的曲线；

图3为ra和oa患者滑液中cyr61含量比较结果。

具体实施方式

根据本发明的一方面，涉及一种cyr61蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包括cyr61捕获抗体、cyr61检测抗体、cyr61检测抗体对应的二抗、辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂以及辣根过氧化物酶显色底物；

所述cyr61检测抗体对应的二抗标记有生物素。

本发明采用抗cyr61单抗和多抗，建立了双抗夹心法检测cyr61的含量。结果显示正常人血清cyr61浓度为57.97±1.70pg/ml呈正偏态分布，临床参考范围为<113.89pg/ml；血清cyr61浓度的升高提示临床mi存在的可能，在对于mi的检测有较高的敏感性和特异度以及对于pci术后的预后有一定价值，这表明血清cyr61检测能够成为潜在的一个诊断mi及行pci术的实验室参考指标。根据我们的设计，单抗096b7作为捕获抗体、兔抗人cyr61多抗作为检测抗体，通过与市售生物素标记抗igg结合，能够较好地检测出cyr61在血清或者体液中的含量，灵敏度可以达到400pg左右，为进一步发展建立具有自主知识产权、可用于临床检测试剂盒奠定了基础。

优选的，如上所述的cyr61蛋白检测试剂盒，所述cyr61捕获抗体包被于所述固相支持物上；

优选的，所述固相支持物为酶标板；

更优选的，所述酶标板上每孔包被有180ng～220ngcyr61捕获抗体；更优选为190ng～210ng，或200ng。

优选的，如上所述的cyr61蛋白检测试剂盒，所述辣根过氧化物酶显色底物包括tmb、opd或abts。

优选的，如上所述的cyr61蛋白检测试剂盒，所述cyr61检测抗体为多克隆抗体；

优选的，所述cyr61检测抗体(多抗)的效价≥10¹⁸，；

优选的，所述cyr61捕获抗体为单克隆抗体，效价≥10⁹；

优选的，所述cyr61检测抗体对应的二抗购自市售公司，如r&d，或abcom，均可。

优选的，所述cyr61检测抗体为浓度不小于其工作浓度1:5000的稀释液；

优选的，所述cyr61检测抗体对应的二抗为浓度不小于其工作浓度1:5000的稀释液。

优选的，如上所述的cyr61蛋白检测试剂盒，所述试剂盒还包括酶结合物工作液、样品稀释液、标准品、标准品稀释液、封闭液中的一种或多种。

优选的，如上所述的cyr61蛋白检测试剂盒，所述样品稀释液分为a液、b液和c液；

所述a液的成分包括2.5n冰醋酸以及10m尿素；

所述b液的成分包括2.7nnaoh以及0.8m～1.2mhepes；

所述c液的成分包括0.8w/v％～1.2w/v％bsa的pbs溶液，ph7.2～7.4；

更优选的，所述a液的成分包括2.2n～2.8n冰醋酸以及9m～11m尿素；

所述b液的成分包括2.7nnaoh以及1.0mhepes；

所述c液的成分包括1.0w/v％bsa的pbs溶液，ph7.2～7.4；

w/v％为质量体积百分数，单位为g/100ml；n为当量浓度；m为摩尔浓度。

本发明还涉及使用如上所述的试剂盒检测cyr61蛋白的方法，包括：

1).将包被有cyr61捕获抗体的固相支持物用封闭液进行封闭化处理；

2).加入稀释后的待检样品和标准品，与cyr61捕获抗体孵育结合；

3).加入cyr61检测抗体进行孵育；

4).加入cyr61检测抗体对应的二抗进行孵育；

5).加入辣根过氧化物酶标记的亲和素试剂进行孵育；

6).加入辣根过氧化物酶显色底物进行显色反应；

7).终止反应，检测od值，根据od值的大小判断cyr61的蛋白含量。

该方法敏感性高，操作简单。

优选的，如上所述的方法，在步骤2)中，所述标准品的浓度为0.35ng/ml～0.43ng/ml；更优选为0.37ng/ml～0.41ng/ml，或0.39ng/ml；

所述待检样品按照1:3.5～4.5稀释；优选为1:4稀释；

优选的，所述待检样品与上述的a液、b液、c液等体积比稀释；

优选的，稀释后的待检样品和标准品与cyr61捕获抗体孵育的条件为2℃～8℃孵育8h～16h；

更优选的，稀释后的待检样品和标准品与cyr61捕获抗体孵育条件为4℃孵育12h。

优选的，如上所述的方法，在步骤3)中，所述cyr61检测抗体的工作浓度为1：(3000～7000)；孵育时间为1.5h～2.5h；

更优选的，所述cyr61检测抗体的工作浓度为1：5000；孵育时间为2h；

优选的，在步骤4)中，所述cyr61检测抗体对应的二抗的工作浓度为1：(3000～7000)；孵育时间为40min～80min；

更优选的，所述cyr61检测抗体对应的二抗的工作浓度为1：5000；孵育时间为60min。

优选的，如上所述的方法，所述待检样品包括滑液或血清。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明采用自制抗cyr61/ccn1单抗和兔抗人cyr61/ccn1多抗建立了夹心法elisa检测试剂盒，能够检测患者或者志愿者血清中cyr61/ccn1含量，敏感度达ng级。

实施例1

1、主要材料：抗cyr61特异性单克隆抗体096b7(作为捕获抗体)；生物素标记的兔抗人cyr61作为检测抗体。市售cyr61蛋白(peprotech公司，美国)作为标准蛋白。建立elisa检测试剂盒。

2、采用双抗夹心法检测cyr61方法建立：

简述之：采用捕获抗体096b7(180ng/well)包板，未标记的多抗作为二抗，再加生物素标记羊抗兔igg孵育后再加入strepavidin-hrp，检测cyr61含量。

方法：

(1)抗cyr61特异性单抗096b7包被，50mmtris，180ng/well。

(2)标准品及样品准备：

标准品(市售cyr61蛋白，peprotec，美国)：100ng/ml对倍稀释至0.35ng/ml。

样品(滑液和血清)：100ul2.8n冰醋酸/9m尿素+100ul标本，10min后加100ul3.0nnaoh/0.8mhepes中和，加ph7.2～7.4的100ul0.8w/v％bsapbs稀释，总的1:4稀释。或者正常样本1:4稀释。

稀释后的待检样品和标准品与cyr61捕获抗体孵育的条件为2℃～8℃孵育8h。

(3)孵育2.5h，加兔抗人cyr61多抗，1:7000稀释。

(4)孵育80min，加生物素标记羊抗兔igg，1:7000稀释。

(5)孵育80min，加亲和素-hrp，1:250稀释。

(6)孵育25min，显色。

实施例2

1、主要材料：抗cyr61特异性单克隆抗体096b7(作为捕获抗体)；生物素标记的兔抗人cyr61作为检测抗体。市售cyr61蛋白(peprotech公司，美国)作为标准蛋白。建立elisa检测试剂盒。

2、采用双抗夹心法检测cyr61方法建立：

简述之：采用捕获抗体096b7(220ng/well)包板，未标记的多抗作为二抗，再加生物素标记羊抗兔igg孵育后再加入strepavidin-hrp，检测cyr61含量。

方法：

(1)抗cyr61特异性单抗096b7包被，50mmtris，220ng/well。

(2)标准品及样品准备：

标准品(市售cyr61蛋白，peprotec，美国)：100ng/ml对倍稀释至0.43ng/ml。

样品(滑液和血清)：100ul2.2n冰醋酸/11m尿素+100ul标本，10min后加100ul2.4nnaoh/1.2mhepes中和，加ph7.2～7.4的100ul1.8w/v％bsapbs稀释，总的1:4稀释。或者正常样本1:4稀释。

稀释后的待检样品和标准品与cyr61捕获抗体孵育的条件为2℃～8℃孵育16h。

(3)孵育1.5h，加兔抗人cyr61多抗，1:3000稀释。

(4)孵育40min，加生物素标记羊抗兔igg，1:3000稀释。

(5)孵育40min，加亲和素-hrp，1:200稀释。

(6)孵育15min，显色。

实施例3

1、主要材料：抗cyr61特异性单克隆抗体096b7(作为捕获抗体)；生物素标记的兔抗人cyr61作为检测抗体。市售cyr61蛋白(peprotech公司，美国)作为标准蛋白。建立elisa检测试剂盒。

2、采用双抗夹心法检测cyr61方法建立：

简述之：采用捕获抗体096b7(100ng/well)包板，未标记的多抗作为二抗，再加生物素标记羊抗兔igg孵育后再加入strepavidin-hrp，检测cyr61含量。

方法：

(1)抗cyr61特异性单抗096b7包被，50mmtris，200ng/well。

(2)标准品及样品准备：

标准品(市售cyr61蛋白，peprotec，美国)：100ng/ml对倍稀释至0.39ng/ml。

样品(滑液和血清)：100ul2.5n冰醋酸/10m尿素+100ul标本，10min后加100ul2.7nnaoh/1mhepes中和，加ph7.2～7.4的100ul1w/v％bsapbs稀释，总的1:4稀释。或者正常样本1:4稀释。

稀释后的待检样品和标准品与cyr61捕获抗体孵育的条件为2℃～8℃孵育12h。

(3)孵育2h，加兔抗人cyr61多抗，1:5000稀释。

(4)孵育1h，加生物素标记羊抗兔igg，1:5000稀释。

(5)孵育1h，加亲和素-hrp，1:200稀释。

(6)孵育20min，显色。

实验例

灵敏度：在cyr61蛋白390pg/ml时，od450读数为0.102(图2)。表明检测灵敏度在400pg/ml左右。此外我们还分析了孵育时间以及样品酸化对检测结果的影响，结果表明：孵育2小时比1小时的效果好，可以提高检测灵敏度；样本酸化与否对cyr61含量检测没有影响(结果未显示)。

采用此种方法检测类风关患者(ra，n＝8)和骨关节炎患者(oa，n＝4)滑液中cyr61含量。结果可见ra患者滑膜中cyr61表达明显比oa高(图3)，与已有报道一致。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。