本发明涉及一种质量控制方法，具体涉及天麻药材及其饮片与提取物的质量控制的方法。
背景技术：
天麻为兰科植物天麻gastrodiaelatabl.的干燥块茎，具有平抑肝阳，祛风通络的功效。目前一般认为天麻素是天麻重要的活性成分。近年来的研究发现天麻还具有增智、健脑等神经保护作用，对老年痴呆症有一定的疗效，现代药理研究表明，天麻中的巴利森苷c、巴利森苷b等成分对东莨菪碱所致学习记忆障碍以及血管性痴呆造成的学习记忆障碍等具有显著的改善作用，具有较大的研究价值和开发潜力。
一标多测法是以样品中某一典型组分为内标，建立该组分与其他组分之间的相对校正因子，通过相对校正因子计算其他组分的含量，一标多测法以成功应用于中药多成分多指标的质量控制，可避免高昂的检测费用和繁琐的检测操作。目前天麻的质量控制多以天麻素、对羟基苯甲醇为指标，采用外标法进行含量测定，控制指标相对简单，目前未见采用一标多测法测定天麻中天麻素、巴利森苷a等6种有效成分含量的报道，本发明解决了巴利森苷类成分对照品不稳定、价格高等因素而无法全面控制天麻药材及其饮片与提取物质量的问题，对控制天麻质量和保证疗效意义重大。
cn105277642a公开了一种同时测定天麻中多种酚类成分含量的方法，该方法采用荧光检测法测定了天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、parishinb等多种酚类成分含量，与本发明相比，其主要存在以下不足之处：①采用外标法进行含量测定，各对照品消耗数量大，检测成本高。②采用荧光检测器进行检测，其普及性、抗干扰性较差，应用紫外检测器进行检测，检测结果的重现性及准确性更好。
技术实现要素：
本发明的目的是解决现有天麻质量控制技术的不足，采用高效液相色谱技术，通过一测多评方法，以价格低廉，性质稳定的天麻素为内标物，建立其与对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e的相对校正因子，并计算各成分含量的方法。本方法检测灵敏度高，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价天麻药材及其饮片与提取物的质量，可解决天麻巴利森苷类成分对照品不稳定、价格高等因素而无法全面控制天麻药材及其饮片与提取物质量的问题，对控制天麻质量和保证疗效意义重大。
基于此，为实现上述目的，本发明采用的技术方案：
一种天麻药材及其饮片与提取物的质量控制方法，主要包括以下步骤：
（1）制备天麻供试品溶液；
（2）制备天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e单一对照品溶液和混合对照品溶液；
（3）分别吸取步骤（2）所述的单一对照品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测试，根据公式rm/k=tr(m)/tr(k)（式中tr(m)为其它组分m的保留时间，tr(k)为内标物的保留时间），计算对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e相对于内标物天麻素的相对保留时间；
（4）吸取步骤（2）所述的混合对照品溶液，进样1、2、4、6、8、12μl，注入高效液相色谱仪，测定，记录各成分峰面积，根据相对校正因子计算公式fkm=fk/fm=(wk×am)/(wm×ak)(式中ak为内标物峰面积，wk为内标物质量；am为其它组分m峰面积，wm为其它组分m质量)，以天麻素为内参物，计算其他5种成分的相对校正因子fkm；
（5）分别吸取步骤（1）所述的供试品溶液和步骤（2）所述的天麻素对照品，注入高效液相色谱仪，测定，对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e通过步骤（3）所述的相对保留时间进行定性，通过步骤（4）所述的相对校正因子计算各自的含量。
作为优选方案，以上所述高效液相色谱仪的色谱条件为：采用c18色谱柱，流动相：乙腈(a)-体积分数0.02～0.1%酸水溶液(b)，采用梯度洗脱：0min～5min,2%a；5min～20min,2%～30%a,20min～25min,30%～2%a；检测波长：220nm；体积流量：0.8～1.2ml•min-1；进样量为5～25μl；柱温：20～35℃；作为更优选方案，以上所述流动相为乙腈-酸水溶液。酸优选为磷酸，其体积分数为0.05%；体积流量为1.0ml•min-1，进样量为10μl，柱温为25℃。
本发明根据天麻药材及其饮片与提取物中各成分的理化性质，由于天麻素类化合物极性接近，在色谱柱上比较难分离，本发明通过大量的实验筛选流动相的组成，实验结果表明，采用本发明优选的梯度洗脱程序能很好的将6种天麻素类成分与其他物质分离，且峰型良好，分析时间短。
作为优选方案，以上步骤（3）所述对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e相对于内标物天麻素的相对保留时间分别为：1.3480、1.8173、1.6846、1.7286、1.6443。
作为优选方案，以上步骤（4）所述对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e与天麻素的相对校正因子分别为：0.6632、1.2777、1.4351、1.3885，1.5907。
作为优选方案，以上步骤（1）所述天麻供试品溶液的制备方法为：精密称取天麻药材、天麻饮片或天麻提取物，加入15～25倍体积分数为60%～80%的乙醇，加热回流提取40～60min，滤过，取5倍量续滤液，浓缩至近干无醇味，残渣加水溶解，转移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，得供试品溶液。
作为优选方案，以上步骤（2）所述天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e单一对照品溶液和混合对照品溶液，溶剂为水，各物质的质量浓度为0.01～0.08mg/ml。
有益效果
与现有技术相比，本发明涉及一种天麻药材及其饮片与提取物的质量控制的方法具有以下优点及显著进步：本发明通过大量实验筛选出最佳的流动相组成、洗脱程序、流速等色谱条件，并经过多次实验验证表明。
本发明针对现有天麻质量控制技术的不足，采用高效液相色谱技术，通过一标多测方法，以价格低廉，性质稳定的天麻素为内标物，建立其与对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e的相对校正因子，并计算各成分含量的方法。本方法检测灵敏度高，分析速度快，稳定性好，可以客观、全面、准确的评价天麻药材及其饮片与提取物的质量，可解决天麻巴利森苷类成分对照品不稳定、价格高等因素而无法全面控制天麻药材及其饮片与提取物质量的问题，对控制天麻质量和保证疗效意义重大。
附图说明：
图1为对照品(a)及供试品(b)hplc图，其中色谱峰1为天麻素、2为对羟基苯甲醇、3为巴利森苷e、4为巴利森苷b、5为巴利森苷c、6为巴利森苷a。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的一种天麻药材及其饮片与提取物的质量控制的方法作进一步说明本发明。
1材料
aglient1260型高效液相色谱仪(安捷agilent有限公司)；ab135-s型十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；ep214c型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；kq-250型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
天麻素对照品（110807-201306）购自中国药品生物制品检定所；巴利森苷a、b、c、e（纯度>98%），购自成都曼斯特生物技术有限公司；乙腈、磷酸为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。
从全国各地收集15批次天麻，经山东中医药大学药学院李峰教授鉴定为兰科植物天麻gastrodiaelatabl.的块茎。
2方法与结果
2.1液相色谱条件
色谱柱：agilentzorbaxsb-c18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈(a)-0.05%磷酸水溶液(b)，采用梯度洗脱：0min～5min,2%a；5min～20min,2%～30%a,20min～25min,30%～2%a；检测波长：220nm；体积流量：1.0ml·min-1；柱温：25℃；进样量10μl。在此条件下，天麻中6种化学成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，见图1。
2.2供试品溶液的制备
取天麻粉末，取约2.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，加热回流提取40min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液10ml，浓缩至近干无醇味，残渣加水液溶解，转移至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm滤膜，即得。
2.3对照品溶液的制备
混合对照品溶液：取天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e对照品适量，精密称定，加水液溶解并制成每1ml含天麻素0.0515mg、对羟基苯甲醇0.0323mg、巴利森苷a0.0438mg、巴利森苷b0.0438mg、巴利森苷c0.0546mg、巴利森苷e0.0586mg的混合溶液，即得。
单一对照品溶液：分别取天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e对照品适量，精密称定，加水液溶解分别制成每1ml含天麻素0.1288mg、对羟基苯甲醇0.0652mg、巴利森苷a0.0876mg、巴利森苷b0.0876mg、巴利森苷c0.1092mg、巴利森苷e0.1172mg的单一溶液，即得。
3方法学验证
3.1线性关系考察
取“2.3”项下的单一对照品溶液，用水液稀释配制成系列浓度，按照2.1项下色谱条件进行测定。以天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e进样量（μg）为横坐标（x），对应峰面积为纵坐标（y），分别绘制标准曲线，得回归方程，结果见表1。
表1天麻中6种化学成分的回归方程及线性范围、相关系数
3.2精密度试验
精密吸取2.3项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，重复测定6次，进样量10μl。结果天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e的峰面积的rsd分别为0.79%、1.18%、2.10%、1.10%、1.29%、0.14%，表明仪器精密度良好。
3.3稳定性试验
取2.2项下的供试品溶液分别于配制后的0、2、4、8、12、24h测定天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e的峰面积，进样量10μl。结果相应7种成分峰面积的rsd分别为1.75%、0.81%、1.07、1.22%、0.81%、1.07、1.22%，表明供试品溶液在24h内具有良好的稳定性。
3.4重复性试验
取天麻粉末，共6份，分别按2.2项下方法制得供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，进样量10μl，记录峰面积，计算天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e的含量，结果7种成分含量的rsd分别为1.09%、1.18%、1.21%、1.14%、2.28%、0.88%，表明本方法重复性良好。
3.5加样回收试验
取已知含量的天麻粉末，共6份，各约1g，精密称定，分别精密加入天麻素对照品溶液（0.6604mg•ml-1）、柠檬酸对照品溶液（3.0142mg•ml-1）、对羟基苯甲醇对照品溶液（0.2104mg•ml-1）、巴利森苷a对照品溶液（2.1250mg•ml-1）、巴利森苷b对照品溶液（1.042mg•ml-1）、巴利森苷c对照品溶液（0.1025mg•ml-1）、巴利森苷e对照品溶液（0.1025mg•ml-1）各5ml，再精密加入70%乙醇各15ml,称定重量，其余按2.2项下方法操作，制得供试品溶液，照2.1项下色谱条件采用标准对照法进行测定，进样量10μl，计算加样回收率。天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e的平均回收率（n=6）分别为100.59%、101.31%、101.87%、100.04%、99.88%、99.63%，rsd分别为1.66%、2.30%、1.36%、1.93%、2.07%、1.80%。结果表明本方法具有较好的回收率。
4相对校正因子的测定
4.1待测成分相对校正因子的测定
精密吸取2.3项下混合对照品溶液，分别进样1、2、4、6、8、12μl，平行测定2次，记录峰面积，根据相对校正因子计算公式fkm=fk/fm=(wk×am)/(wm×ak)(式中ak为内标物峰面积，wk为内标物质量；am为其它组分m峰面积，wm为其它组分m质量)，以天麻素为内参物计算其他5种成分的相对校正因子fkm，结果见表2。
表2以天麻素为内参物的5种成分的相对校正因子（n=2）
4.2不同仪器对相对校正因子的影响
考察agilent1200、waters2996、岛津2010a3个品牌的高效液相色谱仪对相对校正因子的影响，结果见表3。结果表明相对校正因子在不同的高效液相色谱仪具有良好的适应性。
表3不同仪器测定天麻中5种成分的相对校正因子结果（n=2）
4.3不同色谱柱对相对校正因子的影响
考察sinochromods柱（4.6mm×250mm，5μm）,kromasilc18柱（4.6mm×250mm，5μm）,merckods柱（4.6mm×250mm，5μm）3种色谱柱对相对校正因子的影响，结果见表4。结果表明相对校正因子在不同品牌色谱柱具有良好的适应性。
表4不同色谱柱测定天麻中5种成分的相对校正因子结果（n=2）
4.4不同流速对相对校正因子的影响
考察流速为0.8、1.0、1.2ml·min-1时对相对校正因子的影响，结果见表5。结果表明相对校正因子在不同流速时具有良好的适应性。
表5不同流速测定天麻中5种成分的相对校正因子结果（n=2）
4.5不同柱温对相对校正因子的影响
考察柱温为20℃、25℃、30℃时对相对校正因子的影响，结果见表6。结果表明相对校正因子在不同柱温下适应性良好。
表6不同柱温测定天麻中5种成分的相对校正因子结果（n=2）
5待测色谱峰的定位
本研究采用相对保留法rm/k=tr(m)/tr(k)来准确定位。本研究测定了相对保留值在不同品牌仪器、不同色谱柱时的重现性，结果表明，各待测成分的相对保留值rsd均小于5%，可用于待测成分色谱峰定位，结果见表6。
表6不同仪器和色谱柱测定天麻中5种成分的相对保留值结果（n=2）
6一测多评法与外标法测定结果比较
采用外标法（esm）对天麻中6种化学成分进行含量测定，并与用一测多评法(qams)计算的结果进行比较，验证一测多评法用于天麻中6中化学成分含量测定的准确定，可靠性，结果见表7。结果表明2种方法测定的结果无显著性差异，一测多评法用于天麻中6种天麻素类成分的含量测定是准确可行的。
表7qams法和esm法测定15批天麻中6种天麻类成分的含量结果(%,n=2）
综上可知，本发明采用一测多评法对天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷a、巴利森苷b、巴利森苷c、巴利森苷e6种有效成分进行含量测定，建立了天麻质量控制的一种有效方法，又用外标法测定了6种有效成分的含量，比较了其与采用相对校正因子计算值之间的差异，结果表明2种方法测得的含量没有显著性差异。
中国药典2010年版对天麻含量测定以天麻素单一成分为指标，要求不得少于0.20%，而2015年版天麻含量测定项下增加对羟基苯甲醇成分的含量测定，要求天麻素和对羟基苯甲醇的总量为不得少于0.25%，本发明首次将一测多评法应用到天麻中天麻素、巴利森苷类成分的多指标质量评价模式，避免了巴利森苷类成分对照品不稳定、价格高等因素，选用价格低廉，性质稳定的天麻素为内标物，建立天麻中6种有效成分的一测多评法，并对全国不同产地及不同批次的天麻进行了含量测定，测定结果表明天麻中天麻素等6种成分的总含量在2.7%-11.3%范围，是2015年版天麻含量测定要求低限的10-45倍左右，对控制天麻质量和保证疗效意义重大。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰应都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。