一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光试纸条及其应用的制作方法

本发明涉及一种检测黄曲霉毒素m1的时间分辨荧光试纸条及其应用，属于时间分辨荧光免疫分析(trfia)
技术领域：
，用于谷物粮食、食用油、花生、玉米类饲料(预混料)等样品中黄曲霉毒素m1的含量检测。
背景技术：
：黄曲霉毒素m1属于黄曲霉毒素的结构类似物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒法破坏。哺乳类动物摄入被黄曲霉毒素b1污染的饲料或食品后，通过羟基化作用转化成黄曲霉毒素m1。黄曲霉毒素m1危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡。为了控制该毒素对食品的污染，国际食品法典(cac)及许多国家(包括中国)制定了食品中黄曲霉毒素m1的限量标准。目前，检测黄曲霉毒素m1的方法有薄层色谱法、液相色谱法、酶联免疫法、液相色谱串联质谱法等。仪器检测方法的精确度较高，但是仪器昂贵，需要专业的技术人员，检测步骤复杂，难以批量检测样品，不适用于基层实验室批量、快速检测样品。而免疫学检测方法操作简单、快速、灵敏，可同时检测多数样品，是理想的快速筛选手段。技术实现要素：本发明的目的是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的黄曲霉毒素m1时间分辨荧光试纸条。本发明所提供了一种黄曲霉毒素m1时间分辨荧光试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、反应膜以及吸水垫三部分。反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水垫分别搭接于反应膜左右两端。其中，样品吸收垫上设有加样区和微球区，微球区上载有时间分辨荧光微球；反应膜上设有检测线(t线)和质控线(c线)，t线接上包被黄曲霉毒素m1抗原，c线包被抗兔抗体。所述黄曲霉毒素m1时间分辨荧光微球，包括检测微球和质控微球，检测微球为表面包被有黄曲霉毒素m1单克隆抗体的荧光微球，质控微球为表面包被有兔抗标记蛋白的荧光微球。所述荧光微球中填充了斓系元素化合物；较优的，该斓系元索鳌合物为铕鳌合物；最优的，该铕鳌合物可为eu(tta)3/topo或eu(tta)3/phen。所述蛋白可以是牛血清y-球蛋白(bgg)或小牛血清白蛋白(bsa)。所述时间分辨荧光微球粒径范围为100-1000nm。所述硝酸纤维素膜上，t线上包被的抗体为黄曲霉毒素m1抗原，c线上包被的抗兔抗体。所述黄曲霉毒素m1时间分辨荧光免疫定量检测试纸条底部设有塑料底板。所述t线接上包被黄曲霉毒素m1抗原是由黄曲霉毒素m1半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述黄曲霉毒素m1单克隆抗体是以黄曲霉毒素m1半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，是由黄曲霉毒素m1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述抗兔抗体是将兔源抗体免疫羊得到。所述样品吸收垫为fusion5膜或其他功能相同的膜；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水垫；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸条的方法，其包括步骤：(1)质控微球制备：①用生物素标记蛋白；②采用上述标记蛋白包被醛基修饰的荧光微球；(2)半抗原制备：将黄曲霉毒素m1与4-肼基苯甲酸反应得到黄曲霉毒素m1半抗原产物；(3)将黄曲霉毒素m1半抗原与载体蛋白偶联，得到黄曲霉毒素m1半抗原-载体蛋白偶联物；(4)用黄曲霉毒素m1半抗原-载体蛋白偶联物免疫新西兰大白兔，将新西兰大白兔脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到黄曲霉毒素m1单克隆杂交瘤细胞株；(5)提取新西兰大白兔igg免疫健康山羊，得到抗兔抗体；(6)检测微球制备：采用黄曲霉毒素m1的单克隆抗体包被醛基修饰的荧光微球；(7)空白大卡粘贴：将硝酸纤维素膜粘贴在塑料底板中间，fusion5膜与吸水垫分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端；(8)喷膜：将兔抗标记蛋白的荧光微球和黄曲霉毒素m1单克隆抗体的荧光微球采用释放缓冲液混合稀释到一定浓度，喷到fusion5膜的微球区；黄曲霉毒素m1抗原和抗兔抗体稀释后，分别喷到硝酸纤维素膜的t线和c线位置；(9)干燥及切条：将上述喷好试剂的大卡烘干、切条。喷膜步骤中用到的释放缓冲液含有10％-20％蔗糖、3％-10％海藻糖、0.5％-1％n，0-双三甲硅基乙酰胺(bsa)，0.2％-0.5％庆大霉素。喷膜步骤稀释后检测微球终浓度为0.5mg/ml-2mg/ml，质控微球终浓度0.05mg/ml-0.2mg/ml；t线抗原终浓度0.5mg/ml-2mg/ml，c线抗原终浓度0.5mg/ml-2mg/ml；c，t线喷膜液量为0.5μl/cm-1.5μl/cm，微球喷膜量为2μl/cm-8μl/cm。干燥及切条步骤中所述的烘干可在恒温烘箱或者烘房中，37℃烘干8-12小时。本发明的另一个目的是提供一种应用上述试纸条检测谷物粮食、食用油、花生、玉米类饲料(预混料)等样品中黄曲霉毒素m1残留的方法，它包括步骤：(1)样品前处理；(2)用试纸条进行检测；(3)分析检测结果。本发明的黄曲霉毒素m1时间分辨荧光试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将黄曲霉毒素m1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物固定于fusion5膜上，样品中的黄曲霉毒素m1在流动过程中，与fusion5膜上的黄曲霉毒素m1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物结合，形成药物-抗体-时间分辨荧光标记物。样品中的药物与反应膜检测线上的黄曲霉毒素m1半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合黄曲霉毒素m1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物，最终应用免疫层析检测仪计算待测样品液中含有的黄曲霉毒素m1残留量。本发明的试纸条具有特异性强、灵敏度高、定量检测、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测黄曲霉毒素m1残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1为黄曲霉毒素m1半抗原合成路线图。图2为黄曲霉毒素m1半抗原核磁共振氢谱图。图3为黄曲霉毒素m1包被原/免疫原合成路线图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。实施例1黄曲霉毒素m1检测试纸条的制备该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：1)制备喷涂有黄曲霉毒素m1单克隆抗体-时间分辨荧光标记物的样品吸收垫；2)制备具有包被有黄曲霉毒素m1半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有抗兔抗体的质控线的反应膜；3)将1)和2)制备好的样品吸收垫、反应膜以及吸水垫组装成试纸条。下面分步详细叙述：1、黄曲霉毒素m1半抗原的制备将32.8mg黄曲霉毒素m1溶于1ml0.01mpbs中，加入12mg氰基硼氢化钠，0℃搅拌溶解。加入16.5mg4-肼基苯甲酸，搅拌，缓慢升温至50℃，搅拌1h。蒸干溶剂，柱层析纯化，得38mg白色固体，收率82％。核磁数据见图。3.9的黄曲霉毒素m1的甲基峰以及12.7的4-肼基苯甲酸的羧基峰存在，说明半抗原合成成功。该方法制备的半抗原是用4-肼基苯甲酸，通过一步反应引入羧基，并且连接臂为6个键，比本领域常用的cmo法的连接臂长3个键，使半抗原与载体蛋白偶联后更容易暴露在外，增强免疫应答。2、免疫原的制备将133mgbsa溶于5ml0.01mpbs，搅拌溶解。黄曲霉毒素m1半抗原与bsa比例可在1∶1～60∶1的范围内调整，本申请选择在加入46.4mg黄曲霉毒素m1半抗原(与bsa摩尔比为50∶1)，加入edc盐酸盐10mg，室温搅拌2h。移入透析袋中透析48h。该比例下得到黄曲霉毒素m1免疫原可以在抗原表面暴露出更多的黄曲霉毒素m1半抗原，从而更好地引起针对黄曲霉毒素m1的免疫应答。3、包被原的制备将86mgova溶于5ml0.01mpbs，搅拌溶解。黄曲霉毒素m1半抗原与ova比例可在1∶1～40∶1的范围内调整，本申请选择在加入37.1mg黄曲霉毒素m1半抗原(与ova摩尔比为40∶1)，加入edc盐酸盐10mg，室温搅拌2h。移入透析袋中透析48h。该比例下得到黄曲霉毒素m1包被原在与样品中抗原竞争抗体时，能够充分与抗体反应，从而避免假阳性，也不会因为包被原暴露位点过多，形成空间位阻，从而避免假阴性。4、黄曲霉毒素m1单克隆抗体的制备将免疫原注入balb/c新西兰大白兔体内，产生抗血清。取免疫balb/c新西兰大白兔脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，筛选阳性孔，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞用冻存液制成细胞悬液，备用。将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。所述细胞培养基为向rpmi1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的ph为7.4。以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到抗兔抗体。5、微球溶液、检测线(t线)溶液以及质控线(c线)溶液的制备(1)微球溶液的配置用释放缓冲液(含有20％蔗糖、5％海藻糖、0.5％bsa，0.2％庆大霉素)将质控微球和检测微球配制成时间分辨荧光微球混合液，质控微球终浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml，检测微球终浓度为0.8mg/ml-1.2mg/ml。(2)检测线(t线)溶液的配制用0.01mpb溶液将黄曲霉毒素m1抗原复合物稀释成0.4mg/ml-0.6mg/ml。(3)质控线(c线)溶液的配制用0.01mpb溶液将链霉亲和素稀释成0.4mg/ml-0.6mg/ml。6、试纸条的制备反应膜位于中间，样品吸收垫与吸水纸分别搭接于反应膜左右两端，粘贴在带有背胶的塑料底板上。c，t线喷膜液量为0.6μl/cm-1.2μl/cm，微球溶液喷膜量为2μl/cm-6μl/cm。将喷好试剂的黄曲霉毒素m1大卡在恒温烘箱中37℃烘干12小时。将烘干的黄曲霉毒素m1大卡切割成3mm-5mm宽度的纸条，即得到黄曲霉毒素m1试纸条。实施例2样品中黄曲霉毒素m1残留的检测1、样品处理样品稀释液配制：用去离子水将10x样品稀释液(ph值为7.0、1mol/l的磷酸盐缓冲液)按1∶9体积比进行稀释，即1份10x样品稀释液加9份去离子水。样品提取液配制：准确称取1.5gnacl于50ml离心管中，加入25ml去离子水充分溶解再加入25ml甲醇溶液混匀，备用。准确称取10.0g均匀粉碎后的谷物粮食/食用油/花生/玉米类饲料(预混料)等样品(或者量取10ml液态样品)于50ml离心管中，再准确加入20ml样品提取液，将离心管盖盖紧密封，充分振荡5min，静置或于4000rpm离心2min，得上清液(若样品为食用油取下层液)；将上清液(或者下层液)用吸管吸出1.0ml于50ml离心管中，再加入4ml的样品稀释液混匀，待检。2、用试纸条进行检测(1)将试纸条和提取液恢复至室温。(2)用移液器准确吸取60μl待检样品，(取样时注意不要吸入气泡)垂直缓慢滴加于加样孔(s)中，加样后开始计时，加样后8分钟读取结果。(3)将试剂卡插入免疫层析检测仪的承载器中，按检测键，仪器将自动对测试卡进行扫描。(4)从免疫层析检测仪的显示屏幕上读取检测结果。3、分析检测结果检测限范围0.01ng/ml-10ng/ml。实施例3样品检测实例1、检测限试验取空白谷物粮食/食用油/花生/玉米类饲料(预混料)等样品，分别添加黄曲霉毒素m1至终浓度为0.005ng/ml、0.01ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml，取试纸条进行检测，每个样品重复测定三次。用试纸条检测谷物粮食/食用油/花生/玉米类饲料(预混料)等样品时，根据试纸条显示结果确定检测限，表明本试纸条检测限范围0.01ng/ml-10ng/ml。2、样本精密度和准确度试验以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(rsd％)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(％)＝实际测定值/理论值×100％，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差rsd％＝sd/x×100％，其中sd为标准偏差，x为测定数据的平均值。按0.01ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml六个浓度黄曲霉毒素m1分别对谷物粮食/食用油/花生/玉米类饲料(预混料)等样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度结果见下表。表1样品精密度及准确度试验以0.01ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml六个浓度的黄曲霉毒素m1分别对谷物粮食/食用油/花生/玉米类饲料(预混料)等样品进行添加，平均回收率在90.5％～107.8％之间；批内、批间相对标准偏差均小于15％。3、交叉反应率试验选择与黄曲霉毒素m1具有类似结构和类似功能的药物进行时间分辨荧光试纸条测定，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度，用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。表2交叉反应率试验药物名称交叉反应率(％)黄曲霉毒素m1100黄曲霉毒素b15.1黄曲霉毒素b23.6黄曲霉毒素m29.8黄曲霉毒素g1＜1黄曲霉毒素g2＜1当前第1页12