定量检测人表皮生长因受体2（HER2）的双光祖荧光免疫层析试剂盒及其制备方法与流程

本发明涉及医学检验领域中的癌症临床免疫诊断试剂盒领域，具体涉及定量检测人表皮生长因受体2(her2)的双光子荧光免疫层析试剂盒。

背景技术：

人表皮生长因受体2(her2/neu)是酪氨酸受体家族成员之一，主要通过ras/mapk、pi3k/akt等通路参与细胞的增殖及抗凋亡，通过促进基质金属蛋白酶(mmps)分泌、激活vegf的启动子，同时激活丝氨酸/苏氨酸激酶(akt)及核因子kb(nf－kb)等，促进肿瘤的浸润及转移。her2/neu蛋白的过表达和基因扩增存在于多种肿瘤中，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌及消化道肿瘤等。关系到肿瘤的发生、发展、转移、治疗及预后。

1.her2/neu与乳腺癌

研究发现20％－30％的乳腺癌患者存在her2/neu的过表达，her2/neu的过表达常提示肿瘤的恶性程度高。研究结果显示her2/neu基因的扩增可导致肿瘤复发和临床预后较差，并指出此激素受体、肿瘤大小等对预后的判断更有意义。her2的表达与乳腺癌的病理类型呈正相关与分化程度呈负相关。her2/neu的表达情况已作为乳腺癌独立预后指标及选择治疗的重要标准。

2.her2/neu与卵巢癌

卵巢癌存在her2/neu蛋白的过表达大约15％－30％的。在正常卵巢及交界性卵巢肿瘤中检测不到her2/neu扩增及过度表达，而在卵巢癌中常见her2/neu扩增和蛋白的过度表达。verri研究结果显示her2/neu蛋白过表达增加了卵巢癌患者肿瘤进展和死亡的危险。目前很多研究表明，her2/neu过表达与晚期卵巢癌总生存率降低及复发时间缩短有关，是卵巢癌治疗结果不佳的预后因子之一。

3.her2/neu与肺癌

her2/neu的突变与肺癌的类型存在着一定相关性。研究认为her2/neu突变主要存在于细支气管肺泡腺癌中。也有人的研究显示her2/neu在肺癌组织中的过度表达率为26.67％。其中主要表达于肺腺癌中，小细胞肺癌及鳞癌中均未见表达。其研究还通过观察抗癌药物对不同her2/neu表达水平的肺腺癌细胞增殖能力的影响，表明her2/neu基因的高表达可能是化疗耐药的原因之一，并提示her2/neu的过度表达与肺癌分化程度不相关。而美国科罗拉多州立大学肿瘤中心药理、病理教研室研究表明，her2/neu在肺癌中的表达率为7％－22.8％，细胞分化越差，则阳性率越高。

综合以上，her2/neu蛋白的过表达与基因的扩增存在包括乳腺癌在内的很多肿瘤中，与肿瘤发生、转移、治疗等关系密切，因此，血液her2/neu的检测能够对肿瘤的恶性程度及治疗效果进行评价。

目前，临床上常用的her2检测免疫方法学有酶联免疫法、化学发光法、电化学发光法等；由于酶联免疫法需要酶标记，过程复杂，需要专业的人员操作，并且美联免疫法位液体试剂，需要低温冷藏运输，对于基层医疗机构带来很大的不便；管式化学发光法和电化学发光法均为需要大型设备，且为封闭系统，价格昂贵，不利于基层医疗机构的诊疗。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述现有技术中存在的不足，提供一种基层医院到三甲医院均适用的、灵敏度高、准确性强、操作简便、能够快速诊断乳腺癌、肺癌及卵巢癌的诊断试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用荧光免疫层析技术，以人表皮生长因受体2(her2)作为检测指标，具体的技术方案为：

本发明的一个方面提供了一种定量检测人表皮生长因受体2(her2)的荧光免疫层析试剂盒，包括扣卡(11)、双光子荧光免疫层析试纸条和缓冲液，其中，扣卡(11)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括加样孔(9)和观察窗(10)，如图3所示。

荧光免疫层析试纸条结构如图1和图2所示，包括样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(6)、吸水垫(7)和底板(8)。当进行全血样品检测时，试纸条还包括血液分离膜(3)。其中，样品垫(1)、标记垫(2)、血液分离膜(3)、层析膜(6)和吸水垫(7)搭载于底板(8)之上，样品垫(1)位于加样孔(9)的下方，且连接于标记垫(2)，标记垫(2)连接于层析膜(6)，层析膜(6)连接于吸水垫(7)，其上固定有一条定量检测线(4)和一条质控线(5)，优选二者距离3mm～8mm，并位于观察窗(10)的下方。在包括血液分离膜(3)的情况下，血液分离膜(3)设置在标记垫(2)和层析膜(6)之间，此时标记垫(2)连接于血液分离膜(3)，血液分离膜(3)连接于层析膜(6)，或者血液分离膜(3)设置在样品垫(1)和标记垫(2)之间，此时样品垫(1)连接于血液分离膜(3)，血液分离膜(3)连接于标记垫(2)，或者血液分离膜(3)直接与样品垫(1)合并为同一结构。

标记垫(2)上同时固定有荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体，和荧光染料修饰的质控分子，修饰人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体的荧光染料的发射波长与修饰质控分子的荧光染料的发射波长相同，波长范围为300-500nm。

定量检测线(4)上固定有荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体，该特异性抗体所识别的抗原决定簇与固定在标记垫(2)上的荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体所识别的抗原决定簇不同。

质控线(5)上固定有能与质控分子特异性结合的荧光染料修饰生物分子或者抗鼠抗体。

修饰人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体的荧光染料的发射波长与修饰质控分子的荧光染料的发射波长相同，波长范围为500-800nm。

本发明的另一个方面提供了上述定量检测人表皮生长因受体2(her2)的双光子荧光免疫层析试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：用化学交联或生物分子间特异性作用分别将荧光染料偶联到人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体和质控分子的表面，分别得到荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体和荧光染料修饰的质控分子，修饰所述质控分子的荧光染料的发射波长与修饰人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体的荧光染料的发射波长相同，波长范围为300～500nm；

步骤(2)：将步骤(1)得到的荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体和荧光染料修饰的质控分子均固定到标记垫(2)上；

步骤(3)：在层析膜(6)上分别设置一条定量检测线(4)和一条质控线(5)，其中，质控线(5)上固定有能与质控分子特异性结合的荧光染料修饰的生物分子，定量检测线(4)上固定有荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体，且该特异性抗体所识别的抗原决定簇与固定在标记垫(2)上的荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体所识别的抗原决定簇不同；

步骤(4)：将样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(6)、吸水垫(7)和底板(8)构建成荧光免疫层析试纸条，当进行全血样品检测时，试纸条还包括血液分离膜(3)；

步骤(5)：将双光子荧光免疫层析试纸条装卡。

本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用将荧光染料偶联到人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体的表面或质控分子的表面，分别得到荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体和荧光染料修饰的质控分子。在本发明中，当荧光染料表面存在活性基团时，可将其直接与特异性抗体反应，不需用化学交联剂；反之，则需通过化学交联剂将荧光染料与人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体或质控分子相偶联。其中，化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)及戊二醛等。

在本发明的一个优选实施例中，采用有活性基团的荧光染料修饰人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体或质控分子，步骤为：将纯化后的荧光染料溶解，然后加入一定量的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体或质控分子，以缓冲液作为反应介质，反应2～4小时，加入盐酸羟胺终止反应，用色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，得到荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体或质控分子。

为了提高信号与背景的区分度，本发明中标记荧光染料的波长范围为300～500nm，本例选365nm。这是因为，在紫外照射下，层析膜、底板和扣卡的荧光强度在550nm以下会远强于550nm以上，从而会对低浓度人表皮生长因受体2(her2)的检测产生一定的影响，故优选发射波长大于550nm的荧光染料；此外，层析膜、底板和扣卡一般在近红外区域(600～800nm)荧光强度极弱，因此，包被荧光染料优选波长范围为500-800nm的荧光染料以进一步提高灵敏度，本例选荧光染料发射波长为635nm。

本发明的荧光染料包括有机荧光染料和稀土元素荧光染料。本发明的荧光染料可以偶联到是胶乳微球上，变成了荧光微球的形式。本发明的荧光染料可以是单一化合物的荧光染料或者由几种化合物组成的复合荧光染料，优选单一化合物荧光染料、且优选具有较强的光稳定性的荧光染料。本发明的荧光染料例如alexafluro系列(alexafluro647、610、633、700、750)的荧光素、dylight系列(dylight649、633、549、680)等。

本发明的人表皮生长因受体2(her2)特异性抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。质控分子例如兔igg，与质控分子特异性结合的生物分子例如羊抗兔igg。

为了降低对荧光染料荧光信号的影响，本发明采用弱荧光的层析膜、底板以及扣卡，其荧光噪声在大于550nm是会很弱，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。优选底板为白色，表面附有不干胶，且扣卡、层析膜、底板及不干胶均不含有荧光剂。

本发明中，待测样品可以是血清或血浆，此时荧光免疫层析试纸条不包括血液分离膜。待测样品也可以是全血，此时荧光免疫层析试纸条还包括血液分离膜，用于凝固、过滤细胞。血液分离膜可设置在标记垫和层析膜之间，分别与标记垫和层析膜直接毛细作用接触，或者设置在样品垫和标记垫之间，分别与样品垫和标记垫直接毛细作用接触，也可直接与样品垫合并为同一结构，从而样品垫同时具有样品收集、释放及过滤的作用。

本发明的荧光免疫层析试剂盒对待测样品中的人表皮生长因受体2(her2)进行定量检测。检测时，将待测样品通过加样孔加入到样品垫中，样品沿层析膜向吸水垫方向层析运动。样品层析时间通常为8～25分钟，优选15分钟。层析过后，用wash缓冲液清洗层析膜，时间为3-8分钟，优选5分钟，以降低本底，提高检测灵敏度。本发明的wash缓冲液中包含牛血清白蛋白、蔗糖和表面活性剂，ph值为7.0-8.0，其中，牛血清白蛋白的浓度为0.05～2％，蔗糖的浓度为1～15％，表面活性剂的浓度为0.05～2％。表面活性剂优选吐温20、曲拉通x-100，缓冲液优选tris-hcl缓冲液、磷酸盐缓冲液。

本发明的检测用荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发光源模块包含光源及聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，且波长位于600～750nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应的荧光信号。光电转换模块包括图像传感器或者光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号经滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，获得数字信号，质控线获得的荧光信号强度与检测线获得的荧光信号强度具有相关性：如果质控线荧光信号强度超出荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效前提下，检测线获得的荧光信号强度与质控线荧光信号强度的比值越高，表示样品中目标检测物的浓度越高，反之越低。

本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(x)与所对应的荧光信号强度(y)的关系曲线，关系式为y＝y0+bx，荧光信号强度为y＝检测线峰面积/质控线峰面积，然后检测样品，依据标准曲线获得待测样品中人表皮生长因受体2(her2)的浓度。

本发明的荧光免疫层析试剂盒的工作原理为：采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测样品(全血、血清或血浆)中的人表皮生长因受体2(her2)的含量。检测时，将样品滴加到上样孔中，样品流经标记垫时与荧光染料标记物相结合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带及质控带。若样品中含有人表皮生长因受体2(her2)，则与被荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)抗体相结合，当层析至检测线时，会被预先包被于该条带的捕获抗体所捕获，从而构成双抗体夹心复合物。光源激发下，采用荧光定量仪可获取检测线和质控线的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而可分析出样品中含有her2的浓度。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采双有机荧光染料、稀土元素荧光染料或者量子点荧光染料作为特异性抗体的荧光标记物，其中短波长荧光染料发射光发射的两个光子被长波长荧光染料吸收产生一个长波长发射光，具有发光强度高、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化、稳定性好及灵敏度高等优势。

2)本发明试剂盒组成部件中的扣卡、底板以及层析膜在大于550nm时均具有低的荧光特性，可以减少对荧光染料荧光信号获取的影响，从而保证获得高的荧光信背比，进而达到提高灵敏度的目的。

3)本发明所述的定量检测人表皮生长因受体2(her2)的双光子荧光免疫层析方法为wash层析技术，可减少非特异性吸附，降低荧光本底，增强特异性结合，进而提高检测灵敏度，有利于样品中人表皮生长因受体2(her2)含量极低时的准确定量。

4)本发明方法与常规荧光免疫层析相比，具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。

附图说明

图1为荧光免疫层析试纸条的组装示意图，其中1为样品垫，2为结合垫，3为血液分离膜，4为检测线，5为质控线，6为层析膜，7为吸水垫，8为底板。

图2为实施例1中荧光免疫层析试纸条样品测试示意图，以及利用该试剂盒测试样品得到的检测峰和质控峰。

图3为荧光免疫层析试剂盒示意图，其中11为扣卡，9为加样孔，10为观察窗，4为检测线，5为质控线。

图4为实施例1中荧光免疫层析试剂盒的标准曲线，以人表皮生长因受体2(her2)浓度为横坐标，以荧光强度(检测峰面积比质控峰面积比值)为纵坐标。

具体实施方式

实施例1：以共价交联方式用荧光染料修饰抗体，并采wash免疫层析技术对人表皮生长因受体2(her2)的定量检测

1)荧光染料与抗体的偶联

将发射波长为365nm的荧光染料与lmg/ml的人表皮生长因受体2(her2)单克隆抗体混合，室温反应2-4h，加入1mol/l盐酸羟胺终止反应，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)单克隆抗体。同理得到荧光染料修饰的兔igg(质控分子)。其中修饰人表皮生长因受体2(her2)抗体的荧光染料的荧光发射波长与修饰兔igg的荧光染料的荧光发射波长均为365nm。

将发射波长为680nm的荧光染料与lmg/ml的包被人表皮生长因受体2(her2)单克隆抗体混合，室温反应3h，加入1mol/l盐酸羟胺终止反应，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到荧光染料修饰的人表皮生长因受体2(her2)单克隆抗体。同理得到荧光染料修饰的养抗兔igg(质控分子)。其中修饰人表皮生长因受体2(her2)抗体的荧光染料的荧光发射波长与修饰兔igg的荧光染料的荧光发射波长均为680nm。

2)试剂盒的构建

以1:1的比例混合两种荧光染料标记物，并加入牛血清白蛋白(含量为1％)、蔗糖(含量为10％)以及表面活性剂曲拉通x-100(含量为0.8％)，随后均匀喷涂在标记垫上，45℃干燥后密封，室温下保存。

如图1所示，组装定量检测her2的荧光免疫层析试纸条，由样品垫(1)、标记垫(2)、血液分离膜(3)、层析膜(6)、吸水垫(7)组成，顺次粘贴于白色底板(8)上。其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为待测样品收集区；结合垫中含有荧光染料修饰的her2特异性抗体及荧光染料修饰的兔igg；层析膜上固定有定量检测线(4)和质控线(5)，检测线和质控线的间隔为5mm，且检测线(4)固定有区别于标记垫中her2特异性抗体的另一抗原表位的特异性抗体，质控线(5)固定有羊抗兔抗体。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于扣卡(11)内，如图2所示，加入干燥剂封装，与wash缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒。

3)样品的检测

a)将her2抗原标准品用正常人血清作为稀释液分别配制为2ng/ml和350ng/ml浓度；

b)将步骤a)中两种浓度的her2标准品溶液依次按照100:0、92:8、75:25、50:50、25:75、和0:100的比例进行混合；

c)分别将步骤b)中配制的血清溶液(100μl)滴加于加样孔(9)中，正向层析反应15min；

d)配制wash缓冲液，ph值为7.5，缓冲系统为20mm的磷酸盐，加入牛血清白蛋白(浓度为1％)、蔗糖(浓度为10％)以及表面活性剂曲拉通x-100(浓度为0.8％)，在样品孔加入50μl，静置5min。

e)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线，请参见图4；

f)同步骤c)和步骤d)操作，对待测样品进行检测，荧光仪检测峰见图3，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤e)中的标准曲线分析该样品中her2的含量；

g)输出检测报告。

4)结果分析

结果表明，其最低检测限为0.5ng/ml，最低定量限为2ng/ml，且批内与批间重复性均较好，相关系数r2>0.99。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。