基于太赫兹光谱技术的油菜种类鉴别方法与流程

本发明涉及油菜的品种区分方法，尤其涉及一种基于太赫兹光谱技术的油菜种类鉴别方法。

背景技术：

油菜是十字花科芸薹属的若干种可生产榨油籽粒的作物在农艺学上的统称。油菜是我国最主要的油料生产原料和经济作物之一，占我国油料经济作物总面积的40％以上，总油料产量的30％以上。油菜作为油料主要生产作物，其油菜籽油中富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，具有预防心血管疾病和降低人体内血清胆固醇等保健功效。在我国，大约有15个不同的油菜品种，不同品种的油菜具有一定形态特征、产量性状的特异性和稳定性的差异，可以通过分析品种遗传特性以便鉴定品质或与其它品种差异进行油菜品种的鉴定。油菜品种鉴定是筛选优良的油菜品种、保证油菜高产、品种改良和优化的基础，也是实现种子质量标准化、保护品种选育者和使用者利益的基础。因此建立油菜品种快速鉴定的技术平台具有十分重要的意义。

针对油菜品种的鉴定，目前普遍采用page银染法，但这种检测方法存在检测效率偏低、重复性差、不能精确识别片段大小等缺点；此外，还有ssr荧光标记毛细管电泳检测技术，但这种技术是基于dna的指纹鉴定，操作复杂、耗时耗力；该类检测方法在样本准备上需要花费大量的时间和精力，有些废液废弃物等对环境造成严重污染，且破坏性实验将使植物生长过程无法继续，同时过长的检测时间无法保证数据的时效性与不同样本测量数据之间的同步性。

随着光谱技术的快速发展，近红外光谱检测法、高光谱检测法、电磁波检测法及太赫兹波谱(terahert，thz)检测法广泛应用于植物种类鉴别研究。由于大量的大分子振动和转动能级都处于太赫兹波段(0.1～10thz)，在太赫兹波段表现出很强的吸收和谐振，并且物质的太赫兹光谱包含丰富的物理信息和化学信息。针对大多数的有机生物大分子，在太赫兹波段具有指纹特性，可以用于物质的区分鉴定。此外，太赫兹光子能量低可避免生物细胞的光致电离损伤。太赫兹具有较强的穿透性，能穿透像油菜叶片这种较薄的生物样本。因此，太赫兹光谱检测技术在鉴别不同品种的油菜叶片上具有一定的优势。

本发明利用太赫兹技术的指纹性、高穿透性、低损害性，采用太赫兹光谱技术进行基于油菜叶片的品种鉴定。实验选用在相同生长环境相同生长期的两个不同品种的油菜，通过太赫兹时域光谱仪透射式模块采集油菜叶片的时域光谱，通过傅里叶变换将时域光谱转换为频域光谱，再在频域光谱的基础上提取太赫兹透过率光谱、折射率光谱、吸收系数光谱和消光系数光谱。然后对4种光学参数光谱进行预处理优化，最后采用偏最小二乘线性判别分析对两个品种的油菜进行区分鉴定。本专利发明对建立油菜品种快速鉴定的技术平台、对油菜品种的优化筛选与育种精细化管理具有一定的理论与实践指导意义。

技术实现要素：

为克服现有技术所存在的问题，本发明提供了一种基于太赫兹光谱技术的油菜品种鉴定方法。

一种基于太赫兹光谱技术的油菜种类鉴别方法，包括如下步骤：

(1)分别从两种不同品种的油菜中挑选油菜叶片样品，采用太赫兹时域光谱仪采集参考信号和油菜叶片的太赫兹时域光谱；将太赫兹时域光谱转换成太赫兹频域光谱；

(2)从太赫兹频域光谱中提取透过率光谱、折射率光谱、吸收系数光谱和消光系数光谱；并对4种光学参数光谱进行平滑预处理；

(3)将两种油菜的类别编号分别赋值为1和-1，然后将类别编号信息分别与平滑预处理后的4种光学参数光谱信息进行偏最小二乘线性判别分析建模；

(4)采集如步骤(1)中两种不同品种油菜的油菜叶片为样本，获取油菜叶片的太赫兹时域光谱，经步骤(2)处理后带入步骤(3)所建模型中，进行油菜品种的鉴别。实施本发明方法可采用时域太赫兹光谱透射式扫描系统，激光器为钛宝石飞秒激光振荡器；波长：800nm；重复频率：80mhz；频率范围：0.1～3.5thz；脉冲宽度：50fs；平均功率：500mw；

作为优选，步骤(1)中的挑选的2个油菜品种分别为新油6号和垄油6号。2种油菜处在相同的生长环境和相同的生长期。

作为优选，步骤(1)及步骤(4)中挑选长势良好、株高相近、无病虫害、健康生长的油菜叶片；两个品种的油菜在相同的种植环境、相同的生长期。

作为优选，每次采集油菜叶片样本的太赫兹时域光谱时选取3个不同的点位进行采集，每个点位重复采集三次光谱。采集油菜叶片太赫兹时域光谱的点位为叶肉部分，避免叶脉部分。

作为优选，步骤(1)中的2个品种的油菜样本选取开花期的油菜植株，株高约80cm，挑选距离地面约60cm、长势良好、叶片完整、无病虫害、大小相近的新鲜油菜叶片。各采集40个叶片的光谱。针对每个油菜叶片样本，选择叶肉部位、避开叶脉部位，共采集3个不同的点位、每个点位重复采集3次，共采集9条时域光谱，将这9条谱取平均作为该叶片最终的时域光谱。积分时间为39.2ps，时域光谱的采样点数为1000，时间分辨率为39.2fs。

作为优选，在检测过程中，向样本检测仓内充干燥氮气，控制空气湿度低于5％，并采用太赫兹时域光谱系统的透射扫描模块，获取以干燥氮气为背景的参考信号时域光谱和油菜叶片的太赫兹时域光谱。

太赫兹时域光谱的时间分辨率为39.2fs(飞秒)。

步骤(2)中经傅里叶变换之后得到频域光谱，取频段范围为0.1～3.5thz，频率分辨率为25.5ghz。

作为优选，步骤(2)中针对4种光学参数光谱，提取信噪比较高的0.3～2thz频段的透过率光谱、折射率光谱、吸收系数光谱、消光系数光谱后，选取光谱范围为0.3～2thz的谱段进行偏最小二乘线性判别分析(pls-lda)建模。

基于太赫兹频域光谱提取透过率光谱、折射率光谱、吸收系数光谱和消光系数光谱采用thz光学参数提取的模型，参考如下文献。

1.duvillaret,l.；garet,f.；coutaz,j.l.,highlyprecisedeterminationofopticalconstantsandsamplethicknessinterahertztime-domainspectroscopy.appl.opt.1999,38(2),409.

2.duvillaret,l.；garet,f.；coutaz,j.l.,areliablemethodforextractionofmaterialparametersinterahertztime-domainspectroscopy.ieeej.sel.top.quantumelectron.2002,2(3),739-746.

3.dorney,t.d.；baraniuk,r.g.；mittleman,d.m.,materialparameterestimationwithterahertztime-domainspectroscopy.journaloftheopticalsocietyofamericaaopticsimagescience&vision2001,18(7),1562.

作为优选，所述平滑处理的方法为savitzky-golay平滑。以达到去噪优化的目的。

作为优选，步骤(3)中两种油菜的类型编号分别幅值为1和-1，然后与两种油菜的4种光学参数光谱分别进行偏最小二乘线性判别分析方法进行建模。

本发明获取两种油菜叶片在0-39.2ps内的时域光谱；将时域光谱进行傅里叶变换得到0.1～3.5thz范围内的频率光谱；根据频率光谱，提取信噪比较高的0.3～2thz范围内的透过率光谱、折射率光谱、吸收系数光谱、消光系数光谱；采用0.3～2thz范围内的4种光学参数光谱分别与两种油菜的类别编号进行偏最小二乘线性判别分析建模，根据模型结果分析基于太赫兹光谱技术的油菜品种鉴定方法的可行性与精确度。

本发明专利利用太赫兹光谱技术，研究对不同品种油菜的区分鉴定情况，对建立油菜品种快速鉴定的技术平台、对油菜品种的优化筛选与育种精细化管理具有一定的理论与实践指导意义，展示了thz在农业、农产品品种鉴定领域中的应用前景。

基于透过率光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.7602、特异性为0.8578、最佳最成分数为4、正确率为0.875；基于折射率光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.8253、特异性为0.8247、最佳最成分数为5、正确率为0.8875；基于吸收系数光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.8057、特异性为0.7619、最佳最成分数为3、正确率为0.8375；基于消光系数光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.7939、特异性为0.7936、最佳最成分数为3、正确率为0.8375。

针对基于太赫兹光谱技术的油菜种类鉴别方法，相比于传统的如page银染法和ssr荧光标记毛细管电泳检测技术等，太赫兹光谱检测技术由于具有指纹特性、高穿透性、相干特性、瞬态特性、强吸水性、低能量损害性等独特的特性。因此，太赫兹光谱是用于油菜种类鉴别的科学手段之一。

附图说明

图1：0.3～2thz范围内4种光学参数光谱下两种油菜的平均光谱。a

透过率光谱；b折射率光谱；c吸收系数光谱；d消光系数光谱。

图2：偏最小二乘线性判别分析结果。a透过率光谱；b折射率光谱；

c吸收系数光谱；d消光系数光谱。

具体实施方式

本文实施一种基于太赫兹光谱技术的油菜种类鉴别方法，包括以下步骤：

(1)样本准备：选取新油6号和垄油6号这两个油菜品种，均为芥菜型油菜，一般通过肉眼难以区分其品种。将两种油菜同时种植在温室中，生长环境为日照时长约为10h，温度24度，湿度65％。每天施加适量的水分，以确保油菜的正常生长。

(2)光谱采集：实验仪器采用cip-thz透射扫描系统，向样本仓内充满的干燥氮气，使系统内部湿度小于5％。整个扫谱过程中，实验室内恒温294k，相对湿度恒低于20％。先采集以氮气为背景的参考光谱，然后从两种油菜中各取40片叶片，要求相同叶位、距离地面高度大致相同、叶片大小相近、健康无病虫害。每个叶片选择3个不同的点位(选择叶肉部分，避开叶脉部位)，每个点位重复采集3次。将获取的9条时域光谱取平均作为该样本的太赫兹时域光谱。

(3)光谱处理：将所采集的样本太赫兹时域光谱进行傅里叶变换，转换成对应的频域谱数据，然后根据duvillaret、timothy等(参见如前记载的文献)提出的thz光学参数提取的模型，计算得到所测样品的透过率t(ω)、折射率n(ω)、吸收系数α(ω)、消光系数k(ω)这四种主要的光学参数光谱。提取的频段范围为0.3～2thz，再采用savitzky-golay方法对透射率谱进行平滑去噪处理。模型推导过程如下：

太赫兹发射的频域波形为e0(ω)，探测器直接接收到的发射频域波形即为参考光谱eref(ω)，穿过样品之后探测器接收到的频域波形为样本信号esample(ω)。测量的样品宏观光学性质可以用复折射率表示：

其中，n(ω)为样品的实际折射率，它描述的是样品的色散；k(ω)为消光系数，它描述的是样品的吸收特性。ω＝2πf，f为频率。自由空间空气折射率为1，则参考光谱eref(ω)表达式为：

l为太赫兹脉冲在自由空间传播的距离，c为光速，穿过样品的信号光谱可表示为：

其中d为样品厚度，1/(n(ω)+1)和2n(ω)/(n(ω)+1)分别为太赫兹脉冲入射样品和出射样品的透射系数。因此，太赫兹脉冲穿过样品后的透射率可以表示为：

由fresnel关系可以得到折射率和吸收系数：

折射率：

吸收系数：

(4)模型建立：将两种油菜的类别编号分别幅值为1和-1，然后与经过savitzky-golay方法处理后的4种光学参数光谱分别进行偏最小二乘线性判别分析建模。根据模型结果进行两种油菜的品种鉴定，其结果为：基于透过率光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.7602、特异性为0.8578、最佳最成分数为4、正确率为0.875；基于折射率光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.8253、特异性为0.8247、最佳最成分数为5、正确率为0.8875；基于吸收系数光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.8057、特异性为0.7619、最佳最成分数为3、正确率为0.8375；基于消光系数光谱所建pls-lda模型的灵敏度为0.7939、特异性为0.7936、最佳最成分数为3、正确率为0.8375。说明采用太赫兹的4种光学参数光谱均能较准确的识别鉴定出两个品种的油菜，在农业育种选种上具有重要的推广价值。