一种表面增强拉曼光谱检测平台及其制备方法与应用与流程

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及表面增强拉曼光谱检测平台及其制备方法与应用。

背景技术：

表面增强拉曼光谱优异的发光性质，近年来引起了材料科学、化学生物学、生命科学研究者的广泛关注。在过去五年内，很多科研工作者在表面增强拉曼光谱标记的功能化修饰方法方面已经做了大量的研究。表面增强拉曼光谱标记材料具有高亮度、无光漂白和窄光谱带宽等特点，是痕量物质检测和生物成像应用中理想的探针下料，在生命科学领域具有巨大的应用价值。

多巴胺（dopamine,da）是一种儿茶酚恩类神经传导物质，用来帮助细胞传送脉冲的化学物质。多巴胺可以在碱性条件下因酚羟基的氧化生成多巴胺-苯醌化合物，该物质经过分子内重排生成白色多巴胺色素（leukodopaminechrome），并进一步被氧化成多巴胺色素（dopaminechrome）。该粉色多巴胺色素进一步氧化和重排生成5,6-双羟基吲哚，从而具备了发生进一步交联反应的条件。5,6-双羟基吲哚一方面与氨基进行迈克尔加成和席夫碱反应，或者通过分子内环化作用生成脱氧吲哚羧酸酯，最终铰链形成聚多巴胺（polydopamine,pda）。

多巴胺自2007年被科学家发现可以在弱碱性水溶液中通过氧化-自聚合过程形成可以强力粘附于材料表面的聚多巴胺层后，引起了各个研究领域的兴趣。聚多巴胺表面包含丰富的羟基及氨基，使其具备了高表面活性。而且近年来发现因多巴胺的聚合反应可以发生在几乎所有的材料表面，故聚多巴胺越来越广泛的被应用在各个表面修饰应用领域。其中因聚多巴胺表现出的优异的生物相容性和水溶性等特点，其越来越多的被应用到生物医药领域。

低含量及痕量物质的检测方法中最常见的一种是富集-标记检测法，即先将含有被检测物的溶液置于能够选择性富集该检测对象的基底材料上，通过基底材料将被检测物的浓度提升，再加入标记材料，通过检测标记材料的各种光、电、磁效应进而计算出被检测物的浓度。其中基底材料通常是通过利用被检测物与基底发生静电相互作用，π-π相互作用，亲疏水作用及抗原-抗体反应等作用力，达到富集被检测物的目的。而标记材料的表面通常也被修饰上能够靶向捕捉被检测物的功能部件，如抗体等。通过上述这种富集-标记过程，对被检测物形成了基底-被检测物-标记材料这样的夹心结构，一方面使得被检测物的浓度提升，另一方面用标记材料强烈的信号代替了被检测物本身微弱的信号，从而达到检测痕量物质的目的。

聚多巴胺能够修饰于几乎各种材料表面的能力，且又具备优良的生物相容性，使得其在生物材料领域越来越受到重视，且不断被拓展到新的应用领域。其中聚多巴胺近年来被越来越多的研究人员应用于标记材料的修饰与改性，但却未见有将聚多巴胺用于定量检测基底修饰，与联合标记材料进行痕量生物标记物的定量检测的报道。

我们的研究发现，聚多巴胺不但可以便捷且有效的修饰基底材料，如载玻片，同时发现如果将具有靶向生物标记物的抗体一同加入到多巴胺的聚合过程中，可以制备出具有靶向富集能力的聚多巴胺芯片，因此本发明给多巴胺在生物检测领域开辟了一个全新的方向。为了利用聚多巴胺芯片，本发明还引入了经多巴胺修饰的表面含有抗体的表面增强拉曼光谱标记材料，并将两者结合起来，通过在检测过程中形成聚多巴胺芯片-被检测物-表面增强拉曼光谱标记材料这种夹心结构，形成了一种新的检测平台。在此基础上，本发明选择检测具有癌症诊断标志意义的胰腺癌细胞外泌体作为模型检测对象，并对该外泌体浓度进行了定量检测研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提出一种制备简单，专一性高的表面增强拉曼光谱检测平台及其制备方法与应用。

本发明提出的表面增强拉曼光谱检测平台，由聚多巴胺修饰的基底芯片和聚多巴胺修饰的表面增强拉曼光谱（sers）标记的探针组成，其制备具体步骤如下：

（1）聚多巴胺修饰的基底芯片的制备：室温下，用浓度为0.1~50mg/ml的盐酸多巴胺溶液浸泡洁净的载玻片，反应0.5-24小时后，加入ph值为8-10的浓度为1mm-100mm的磷酸盐（pb）或三羟甲基氨基甲烷/盐酸（tris-hcl）缓冲溶液，以及0.5-50μg/ml的抗体溶液或5nm-100μm的适配体分子溶液，反应0.5-5小时，得到修饰有靶向分子的聚多巴胺基底芯片；记为pda-chip，可用于捕获被检测物质；

（2）聚多巴胺修饰的sers探针的制备：将制备好的sers标记材料加入到牛血清白蛋白（bsa）溶液中，混合均匀，反应0.5-24小时，离心分离，取沉淀，再用ph值为8-10的浓度为1mm-100mm的磷酸盐（pb）或三羟甲基氨基甲烷/盐酸（tris-hcl）缓冲溶液分散沉淀，再加入浓度为0.1~50mg/ml的盐酸多巴胺溶液与0.5-50μg/ml的抗体溶液，混合均匀，反应0.5-5小时，再离心取沉淀，再用缓冲溶液或水溶液分散，即得到聚多巴胺修饰的表面增强拉曼光谱标记sers探针，记做sers-pdatag，可用作标记被检测物质的表面增强拉曼光谱探针。

本发明中，所述抗体为能识别特定外来物的蛋白质，可以为分别识别巨噬细胞迁移抑制因子（mif）和表皮生长因子受体（egfr）等具有癌症指示性作用的蛋白质的抗体。

本发明中，所述制备pda-chip的操作过程为：调节摇床的转速，在培养皿内放置洁净的载玻片，于10--50℃下加入0.1-50ml的0.1~50mg/ml的盐酸多巴胺溶液，反应0.5-24小时，加入等体积的1-50mm的ph为8-10的tris-hcl缓冲液、2-2000ul的5ug/ml的抗体溶液，反应0.5-5小时，溶液变灰色或黑色，即生成了pda-chip。

本发明中，所述制备ser-pdatag的操作过程为：将2ml制备好的sers标记材料加入0.1-5ml的0.1-5%bsa溶液，混合反应0.5-24小时，然后用离心机离心分离取沉淀，再加入0.2-5ml的1-50mm的ph为8-10的tris-hcl缓冲的2-2000ul的0.5-50μg/ml的抗体溶液，反应0.5-5小时，溶液变成灰色或者黑色，即生成sers-pdatag；然后用离心机离心分离取沉淀，再加入0.2-5ml的1-50mm的ph为7.4的pbs缓冲重新分散沉淀。

上述得到的sers-pdatag材料，在514、532、633、785和880nm的激光的激发下能够发射出强度被增强数个数量级的包含在sers标记材料中的拉曼信号分子的拉曼光谱信号。制备出的sers-pdatag可以在常温与4℃下保持6个月以上的稳定，经简单超声分散后可以恢复原有拉曼光谱强度。同时其表面有被聚多巴胺修饰的抗体，使得该标记材料可以靶向包含抗体所对应的抗原的物质或者其他被靶向目标。

本发明制备的pda-chip，可以均匀的分散被检测物，并固定与富集被检测物，该pda-chip可以在干燥与4℃下保持至少1个月以上的有效性，在有效期内可以直接使用，而不需要额外处理。

本发明将pda-chip与sers-pdatag组合，即构成表面增强拉曼光谱检测平台，记做pda-sersplatform。该平台可以用于定量检测各种微量及痕量的环境污染物，生物标记物和其他物质，并可视化显示检测结果。

例如，具体可用于检测胰腺癌细胞分泌外泌体数量:

外泌体指的是经由细胞分泌的，包含dna和蛋白质的小囊泡，存在于包括血液、唾液、尿液和脑脊液等的体液中。外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等各种生命体机能中。近年来越来越多的研究表明血液中特定组织分泌的外泌体的浓度与组织的癌症化有直接关系。本发明利用pda-sersplatform检测胰腺癌细胞分泌的外泌体浓度，具体步骤为：

（1）对panc-1胰腺癌细胞进行细胞培养，然后利用离心去除细胞保留含有外泌体的培养液，之后通过超速离心，从上清液中分离出外泌体；

（2）之后，通过流式细胞仪标定外泌体浓度，再将外泌体用1-50mm的pb缓冲液稀释，存放于4℃冰箱中备用；将外泌体用pbs缓冲液稀释成各个浓度的外泌体溶液，把不同浓度的外泌体溶液分别取2ul滴在pda-chip上，10-50℃下反应0.5-5小时，之后用pb缓冲液清洗，再加入20-2000ul的sers-pdatag反应0.5-50小时，之后再用pb缓冲液及去离子水冲洗，最后晾干待测；

（3）将与pda-sersplatform作用后的各个浓度下的外泌体样品置于拉曼光谱仪下检测；每个样品检测1-1000个点，并计算均值；通过读取serstag的信号中最强的拉曼峰的峰强度，并将峰强度与浓度对比，峰强度与浓度呈正相关。该pda-sersplatform对panc-1细胞系分泌的外泌体的检测所取得的信号的对数值，在外泌体浓度在5.44x10²to2.72x10¹⁰个/ml的范围内有良好的线性响应，且检测限为9x10^-19mol/l。

与现有报道相比，本发明的pda-sersplatform制备简单，该平台用于检测细胞分泌外泌浓度有检测均一度高，可重复性好，非常宽的线性响应检测范围，及非常低的检测极限。

（1）合成方法简便：sers-pdatag与pda-chip的制备，不需要复杂的仪器，不需要高温强酸强碱等苛刻条件，反应条件比较温和，反应后修饰便捷，具有长期稳定性。

（2）样品量需求少：pda-sersplatform只需要2μl的样品量。

（3）灵敏度高：外泌体最低检测浓度是5.44x10²个/ml,检出限9x10^-19mol/l（以信噪比计算，s/n=3），检测的浓度范围5.44x10²to2.72x10¹⁰个/ml。

附图说明

图1为pda-chip的制备过程与sers-pdaplatform用于检测外泌体流程的示意图。

图2为表面增强拉曼光谱检测平台的扫描电镜照片。其中，(a)为pda-chip的扫描电镜照片；(b)为sers-pdatag的透射电镜照片。

图3为sers-pdatag的拉曼光谱信号。其中，下面比较平坦的曲线为金纳米颗粒的，上面曲线为表面增强拉曼标记材料的。

图4为sers-pdatag信号强度的对数值响应不同外泌体的浓度的对数值的工作曲线。

图5为血清样品的拉曼光谱成像图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，进一步描述本发明。

实施例1

（1）聚多巴胺修饰的载玻片芯片（pda-chip）的制备

在制备前，先用食人鱼水（浓硫酸：过氧化氢溶液=7:3）浸泡载玻片，浸泡过夜，洗涤干净，烘干并且冷却至室温。下将载玻片放入洁净的培养皿中，并置于恒温摇床上，加入20ml10mg/ml盐酸多巴胺溶液，调节恒温摇床转速，在37℃下震荡反应1小时，再加入20ml10mm的ph值为8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（tris-hcl）缓冲液与200ul的15ug/ml的磷脂酰肌醇蛋白聚糖1（gpc1）抗体溶液，37℃下继续震荡反应1小时，溶液由澄清透明变至灰黑色，则生成了聚多巴胺修饰的载玻片芯片，之后用磷酸盐缓冲液冲洗，再浸泡在0.5%牛血清白蛋白溶液中1小时，之后用去离子水及磷酸盐缓冲液清洗，备用。pda-chip的扫描电镜照片如图2（a）所示。

（2）聚多巴胺修饰的表面增强拉曼光谱标记材料（sers-pdatag）的制备

将8ml的表面增强拉曼光谱标记材料加入到10ml的洁净的玻璃瓶中，调节磁力搅拌器转速，室温下加入2ml的1%的牛血清白蛋白溶液。搅拌均匀后静置1小时。将反应液离心分离，去除上清液，用5ml的浓度为10mm的ph为8.4的tris-hcl缓冲液分散沉淀，1ml15ug/ml的gpc1抗体溶液和1ml5mg/ml的盐酸多巴胺溶液，反应2小时，溶液变成灰黑色。将反应液离心分离，去除上清液，用5ml的浓度为10mm的ph=7.4的磷酸盐缓冲液分散沉淀，制备出聚多巴胺修饰的表面增强拉曼标记材料。sers-pdatag的透射电镜照片如图2（b）所示。

（3）细胞培养和外泌体提取

把人胰腺癌细胞（panc-1）在thermo培养箱里面培养，培养箱的温度是37℃，5%二氧化碳以及细胞培养湿度在100%。配制的培养液含有高糖dmem和10%胎牛血清。为了提取外泌体，将含有细胞的培养液用超速离心机离心分离，取上清，再用孔径为0.22微米的滤膜过滤上清液，再用超速离心机离心过滤液，并用磷酸盐缓冲液充分分散洗涤及超速离心2次，最后将分离出的外泌体用磷酸盐缓冲液稀释至待用的浓度。

（4）pda-sersplatform用于检测panc-1细胞分泌外泌体的浓度

取2微升的外泌体浓度，滴加在pda-chip表面，于37℃下反应1小时，用磷酸盐-吐温缓冲液冲洗3次，再滴加200微升的sers-pdatag，反应1小时，之后用磷酸盐-吐温缓冲液冲洗3次。将已经捕捉过外泌体并标记过表面增强拉曼光谱标记材料的载玻片，置于显微拉曼光谱仪下，用785nm激光激发，检测200-4000范围内的拉曼散射信号，并选取其中标记分子特定的拉曼光谱信号，如对硝基苯硫酚的1074cm^-1的信号，读取强度值。

实施例2

（1）聚多巴胺修饰的载玻片芯片（pda-chip）的制备

在制备前，先用食人鱼水（浓硫酸：过氧化氢溶液=7:3）浸泡载玻片，浸泡过夜，洗涤干净，烘干并且冷却至室温。下将载玻片放入洁净的培养皿中，并置于恒温摇床上，加入30ml10mg/ml盐酸多巴胺溶液，调节恒温摇床转速，在37℃下震荡反应1小时，再加入30ml10mm的ph值为8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（tris-hcl）缓冲液与300ul的15ug/ml的gpc1抗体溶液，37℃下继续震荡反应1小时，溶液由澄清透明变至灰黑色，则生成了聚多巴胺修饰的载玻片芯片，之后用磷酸盐缓冲液冲洗，再浸泡在0.5%牛血清白蛋白溶液中1小时，之后用去离子水及磷酸盐缓冲液清洗，备用。

（2）聚多巴胺修饰的表面增强拉曼光谱标记材料（sers-pdatag）的制备

将16ml的表面增强拉曼光谱标记材料加入到20ml的洁净的玻璃瓶中，调节磁力搅拌器转速，室温下加入4ml的1%的牛血清白蛋白溶液。搅拌均匀后静置1小时。将反应液离心分离，去除上清液，用10ml的浓度为10mm的ph为8.4的tris-hcl缓冲液分散沉淀，2ml的15ug/ml的gpc1抗体溶液和2ml的5mg/ml的盐酸多巴胺溶液，反应2小时，溶液变成灰黑色。将反应液离心分离，去除上清液，用10ml的浓度为10mm的ph=7.4的磷酸盐缓冲液分散沉淀，制备出聚多巴胺修饰的表面增强拉曼标记材料。

（3）细胞培养和外泌体提取

把人胰腺癌细胞（panc-1）在培养箱里面培养，培养箱的温度是37℃，5%二氧化碳以及细胞培养湿度在100%。配制的培养液含有高糖dmem和10%胎牛血清。为了提取外泌体，将含有细胞的培养液用超速离心机离心分离，取上清，再用孔径为0.22微米的滤膜过滤上清液，再用超速离心机离心过滤液，并用磷酸盐缓冲液充分分散洗涤及超速离心2次，最后将分离出的外泌体用磷酸盐缓冲液稀释至待用的浓度。

（4）pda-sersplatform用于检测胰腺癌患者血液中外泌体的浓度

取4微升的用pbs缓冲液稀释100倍的血清，滴加在pda-chip表面，于37℃下反应1小时，用磷酸盐-吐温缓冲液冲洗3次，再滴加400微升的sers-pdatag，反应1小时，之后用磷酸盐-吐温缓冲液冲洗3次。将已经捕捉过外泌体并标记过表面增强拉曼光谱标记材料的载玻片，置于显微拉曼光谱仪下，用785nm激光激发，检测200-4000范围内的拉曼散射信号，并开启拉曼光谱仪的成像扫描模式，设定扫描范围为整个载玻片，并选取其中标记分子特定的拉曼光谱信号，如对硝基苯硫酚的1072cm^-1的信号，作为拉曼光谱成像峰，绘制拉曼光谱成像图。