一种用于凝血因子VIII抑制物检测的缓冲液以及检测方法与流程

本发明涉及临床凝血检验制剂领域，具体而言，涉及一种用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液以及检测方法。
背景技术：
：血友病a是一种遗传性的、凝血因子viii缺乏的出血性疾病，目前的治疗手段主要是因子viii替代治疗，但是长期输注因子viii会诱导体内产生抑制物，研究数据显示血友病a患者输注因子viii治疗后，约15％-30％的患者会产生抑制物，抑制物的产生是血友病治疗过程中会出现的最严重的并发症，如何降低血友病抑制物的产生是目前血友病治疗领域面临的重大难题。目前由于输注凝血因子是血友病患者唯一有效的治疗方式，通过监测抑制物水平指导用药在血友病治疗中很重要。世界血友病联盟(worldfederationofhemophilia，wfh)在2012年发布的《血友病管理指南》中明确提出血友病患者进行替代治疗、手术及疗效评价前都应进行抑制物检测。但是由于开展凝血因子viii抑制物检测项目使用的试剂种类多样、操作程序复杂、操作规范和质量控制难以把握，目前国内开展抑制物检测的项目很少。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，其具有较好的缓冲能力，提高检测结果的稳定性。本发明的另一目的在于提供上述缓冲液的应用。本发明的另一目的在于提供一种检测凝血因子viii抑制物的试剂盒。本发明的另一目的在于提供一种检测凝血因子viii的方法。本发明的另一目的在于提供检测凝血因子viii抑制物的方法。本发明是这样实现的：一种用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，按每l计，其含有：2.62-2.82g咪唑、4.53-4.83gnacl、8.1-8.7gbsa、0.017-0.023ml吐温-20、6.3-6.7gnan3以及14.78-14.98mmolhcl。上述的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液在检测凝血因子viii或凝血因子viii抑制物中的应用。一种检测凝血因子viii抑制物的试剂盒，其含有上述的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液。一种检测凝血因子viii的方法，其包括：用上述的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液稀释血浆。一种检测凝血因子viii抑制物的方法，其包括：用上述的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液对待测血浆进行倍比稀释，得到多份待测血浆稀释液。本发明具有以下有益效果：本发明提供的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，按每l计，其含有：2.62-2.82g咪唑、4.53-4.83gnacl、8.1-8.7gbsa、0.017-0.023ml吐温-20、6.3-6.7gnan3以及14.78-14.98mmolhcl。该缓冲液可用于在凝血因子viii或凝血因子viii抑制物检测过程对血液样本稀释，其就有较好的缓冲能力，可以提高检测结果的稳定性。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本发明实施例提供的凝血因子viii活性与atpp时间之间的标准曲线图；图2为本发明实施例提供的残余凝血因子viii活性与凝血因子viii抑制物水平之间的关系。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液以及检测方法进行具体说明。一方面，本发明实施例提供的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，按每l计，其含有：2.62-2.82g咪唑、4.53-4.83gnacl、8.1-8.7gbsa、0.017-0.023ml吐温-20、6.3-6.7gnan3以及14.78-14.98mmolhcl。进一步地，在本发明的一些实施方式中，按每l计，所述缓冲液含有：2.67-2.77g咪唑、4.58-4.78gnacl、8.2-8.6gbsa、0.019-0.021ml吐温-20、6.4-6.6gnan3以及14.83-14.93mmolhcl。进一步地，在本发明的一些实施方式中，按每l计，所述缓冲液含有：2.72g咪唑、4.68gnacl、8.4gbsa、0.02ml吐温-20、6.5gnan3以及14.88mmolhcl。进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液的ph为7.1-7.4。进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液的ph为7.3。本发明实施例提供的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，通过对配方的重新设计，使其具有较好的缓冲能力，可用于在凝血因子viii或凝血因子viii抑制物检测过程中对血液样本稀释，提高检测结果的稳定性，且其成本远远低于现有的缓冲液，具有广阔的应用前景。另一方面，本发明实施例提供了上述用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液在检测凝血因子viii或凝血因子viii抑制物中的应用。将本发明实施例提供的缓冲液用于检测凝血因子viii或凝血因子viii抑制物，可以提高检测结果的稳定性，有助于对凝血因子抑制物检测实验的标准规范和质量控制。另一方面，本发明实施例还提供了一种检测凝血因子viii抑制物的试剂盒，其含有上述的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液。另一方面，本发明实施例还提供了一种检测凝血因子viii的方法，其包括：用上述的用于凝血因子viii或凝血因子viii抑制物检测的缓冲液稀释血浆。进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液与所述血浆的体积比为(0.8-1.2):(4.7-5.2)。进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液与所述血浆的体积比为1:5。再一方面，本发明实施例还提供了一种检测凝血因子viii抑制物的方法，其包括：用上述的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液对待测血浆进行倍比稀释，得到多份待测血浆稀释液。进一步地，在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括：检测每份所述待测血浆稀释液的残余(相对剩余)凝血因子viii活性。进一步地，在本发明的一些实施方式中，选择残余凝血因子viii活性在30％-60％的待测血浆稀释液的稀释倍数用于计算凝血因子viii抑制物。进一步地，在本发明的一些实施方式中，选择残余(相对剩余)凝血因子viii活性在50％的待测血浆稀释液的稀释倍数用于计算凝血因子viii抑制物。本发明提供的检测凝血因子viii抑制物的方法可以为血友病患者及临床医生提供更全面准确的临床治疗效果评价指标，帮助患者调整治疗方法，有效的降低血友病抑制物的发生。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，其按每l计，该缓冲液含有：2.72g咪唑、4.68gnacl、8.4gbsa、0.02ml吐温-20、6.5gnan3以及14.88mmolhcl。本实施例提供了上述缓冲液的制备方法，如下：1.称取2.72g咪唑、4.68gnacl、8.4gbsa、0.02ml吐温-20、以及6.5gnan3置于容量瓶中，加入500ml蒸馏水，搅拌溶解；2.加入148.8ml0.1m盐酸，混匀后调整ph为7.3；3.用蒸馏水定容至1l，调整ph为7.3。本实施例提供的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液，其具有较好的缓冲能力，可用于在凝血因子viii或凝血因子viii抑制物检测过程中对血液样本稀释，提高检测结果的稳定性。实施例2本实施例提供的检测凝血因子viii的方法，其包括如下步骤：1样本采集20例健康正常人肘部静脉采血(样本依次编号为1,2,3…,20)。在采血开始前扎上止血带，使用109mmlol/l枸橼酸钠抗凝(血液：枸橼酸钠＝9:1)真空采血管采集血样3ml，注意在血液抽至抗凝剂管后，需要轻轻上下颠倒五次混匀。该步骤为可选步骤。2分离血浆新鲜采集的血样在1小时内分离血浆，将采血管放在离心机中，1600g的离心力下离心15分钟，使用200μl的微量移液器将血浆转移至1.5ml的离心管中，血浆在室温下可存放3小时，-20℃可存放2周。该步骤为可选步骤。3.采用凝固法检测血浆中凝血因子viii活性3.1用实施例1提供的缓冲液按1:5比例稀释血浆样本，恢复至室温15-25℃，37℃水浴箱温浴；3.2温浴0.025m氯化钙溶液，放置于37℃水浴箱中温浴3分钟；3.3在比色杯中依次加入乏凝血因子viii血浆100ul、稀释血浆样本100μl和aptt试剂100μl，混匀，置于37℃水浴箱中温浴3分钟，轻轻振摇；3.4加入氯化钙(cacl2)溶液100μl，同时启动秒表或者血凝分析仪上的计时器，开始记录凝血时间(即aptt时间)；3.5从参考曲线上读取凝血因子viii的活性，用％表示。其中，参考曲线是使用凝血因子viii校准品(6个浓度梯度，分别是89％、44.5％、11.125％、5.563％、1.113％、0.001％)作出的aptt时间与凝血因子viii活性关系的曲线。检测时可根据受检样的aptt时间计算出凝血因子viii活性。参考曲线是点到点的双log拟合曲线(相邻的两个点之间是一条线段(1个线段代表1个方程)，log(y)＝a×log(x)+b，y代表aptt时间(秒)，x代表凝血因子viii的活性(％))，如图1所示，横坐标是凝血因子viii的活性(％)，纵坐标是aptt时间(秒)。3.6结果20例正常健康人的凝血因子viii活性检测结果，见表1。表120例健康正常人viii因子检测结果样本编号123456凝血因子viii活性/％128.68114.89101.4194.74104.24123.29样本编号789101112凝血因子viii活性/％90.99125.06100.04116.5189.78130.54样本编号131415161718凝血因子viii活性/％151.3107.1684.36132.4379.69138.3样本编号1920凝血因子viii活性/％92.22110.17实施例3本实施例提供的检测凝血因子viii抑制物的方法，具体操作如下：1检测残余凝血因子viii活性1.1使用实施例1提供的咪唑缓冲液作为血浆稀释液，在塑料试管中将一例因长期使用重组凝血因子viii药物治疗并已产生凝血因子viii抗体的血友病患者血浆(经检测，该患者血浆的凝血因子viii活性为0.001％)进行倍比稀释(1倍、5倍、10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍)，每个倍数的血浆体积为0.2ml。1.2将0.2ml乏凝血因子viii血浆吸入另一根塑料试管，用作标准血浆对照。1.3将0.2ml正常混合血浆加入标准管和稀释后的待测血浆中。此时所有待测血浆的凝血因子viii活性水平大约为50％(注：正常混合血浆的凝血因子viii为100％，患者血浆及各稀释血浆为0％，等量混合后的凝血因子viii活性约为50％)。孵育结束后进行检测时，标准血浆的凝血因子viii活性视为100％。1.4盖上所有试管，混合均匀并放置于37℃水浴箱中孵育2小时。1.5按实施例2中的步骤3.1-3.5对所有孵育后的待测血浆和标准血浆进行凝血因子viii活性检测，检测结果作为残余凝血因子viii活性，记为m，标准血浆的凝血因子viii活性检测值记为w。1.6以标准血浆的凝血因子viii活性作为100％，计算每份待测血浆的残余(相对剩余)凝血因子viii活性，按如下公式计算：残余(相对剩余)凝血因子viii活性＝(m÷w)×100％；其中，m代表待测血浆的残余凝血因子viii活性，w代表标准血浆的实际检测的凝血因子viii活性。结果见表2。2计算凝血因子viii抑制物根据计算出的每份待测血浆的残余(相对剩余)凝血因子viii活性水平，选择残余(相对剩余)凝血因子viii活性接近50％的稀释度(本实施例中对应的稀释倍数为160倍)，并乘以稀释倍数进行校正，得到待测血浆的凝血因子viii抑制物水平，凝血因子viii抑制物水平计算公式：抑制物水平(y)，残余(相对剩余)凝血因子viii活性(x％)，y＝(2-lgx)÷0.30103。根据抑制物单位的定义，可以残余(相对剩余)凝血因子viii活性％-抑制物单位在双对数曲线上绘制标准曲线(见图2，图中：1个bethesda单位定义为：37℃孵育2小时，中和外源性添加的一个单位凝血因子viii的50％的抑制物的量，残余fviii代表残余(相对剩余)凝血因子viii)，图2参考的是世界血友病联盟(wfh)2010年发行的血友病实验室诊断手册。结果见表2。表2孵育2小时后残余凝血因子viii活性以及凝血因子viii抑制物水平根据表2可知，本实施例中的血友病患者血浆中的凝血因子viii抑制物水平为173.83bu/ml。需要说明的是，在其他的实施例中，可选择相对剩余凝血因子viii活性在30-60％范围内的待测血浆稀释倍数用于抑制物的计算，只需计算每份稀释待测血浆的抑制物检测结果，取平均值即可。实施例4对实施例1提供的检测用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液缓冲能力验证采用实施例2提供的检测凝血因子viii的方法，以不同的缓冲液(实施例1提供的缓冲液、乏viii因子血浆、两种不同的从市场上购买的凝血用血浆稀释缓冲液)，在不同的时间点检测同一份血液样本的凝血因子viii活性。具体为：先检测正常混合血浆的凝血因viii活性(孵育前正常混合血浆)，然后将四种缓冲液分别与200μl的正常混合血浆等比混合，混合后检测凝血因子viii水平(共检测2次，分别为孵育前检测第1次，第2次)，然后37℃水浴箱孵育2小时，之后检测剩余凝血因子viii活性(37℃孵育2小时后)。孵育前后凝血因子viii因子活性降低幅度小的缓冲液的缓冲能力较好。结果如下表3所示。表3表中：缓冲液a、c为市场上广泛使用的凝血用血浆稀释缓冲液，缓冲液b为改进的咪唑缓冲液(实施例1提供的缓冲液)，缓冲液d为乏凝血因子viii血浆(血浆制品，成本较高，不适合用作血浆稀释液使用)。表3中的两个检测指标是相关的，凝血因子viii活性可以由aptt时间根据参考曲线算出。凝血因子viii是种功能性的生物活性蛋白质，凝血功能活性会随着时间的延长而逐渐降低，血浆稀释液的一些指标(比如酸碱度、蛋白含量、离子强度等)的变化都会导致凝血因子viii活性的下降，比如乏凝血因子viii血浆含有除凝血因子viii的各种血液成分，因此孵育2小时后凝血因子viii水平下降很少。凝血因子viii抑制物检测的是病人血浆和正常血浆混合37℃孵育2小时后，引起正常血浆凝血因子viii活性降低的程度，降低程度越大，则凝血因子viii抑制物水平越高，为降低这种因为非实验因素(缓冲液导致凝血因子viii活性下降)造成的凝血因子viii活性下降对实验结果的影响，缓冲液维持凝血因子viii活性稳定的功能很重要。孵育前后凝血因子viii因子活性降低幅度较小的缓冲液更适合进行凝血因子viii抑制物检测。从表1可以看出，采用乏凝血因子viii血浆和实施例1提供的缓冲液稀释血浆，在孵育前后凝血因子viii活性降低幅度最低，分别是0.96％和1.78％，其降低幅度远低于其他的血浆稀释缓冲液。由此说明，实施例1提供的用于凝血因子viii抑制物检测的缓冲液缓冲能力较好，适用于在凝血因子viii或凝血因子viii抑制物检测过程使用，提高检测结果的稳定性同时降低成本(实施1提供的缓冲液价格约为0.15万元/升，乏凝血因子viii血浆价格约为30万元/升，乏凝血因子viii血浆制品，成本较高，不适合用作血浆稀释液使用)。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12