一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法及其应用和探针制备与流程

本发明涉及微量检测领域，具体涉及一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法及其制备和应用。

背景技术：

生物硫醇类巯基化合物，通常包含半胱氨酸(cys)，同型半胱氨酸(hcy)、谷胱甘肽(gsh)。由于这些分子在生物体中发挥重要的生理作用，目前已经引起越来越多科研工作者的关注。大量研究证明，生物体中巯基化合物的失衡与许多疾病密切相关。例如，人体中半胱氨酸的浓度过高会引起神经毒害，而半胱氨酸缺乏将会导致身体水肿、生长减慢、白细胞减少、头发脱落以及其他的身体机能紊乱疾病。同型半胱氨酸浓度升高也与许多疾病，如心血管疾病、骨质疏松症、老年痴呆症等密切相关。此外，如果人体中谷胱甘肽水平异常，将会抑制机体免疫系统功能、加速衰老，并与糖尿病、结核病、艾滋病等一些疾病相关。由于，通过检测如血浆、活细胞或尿等生物样品中这些化合物的水平，可以为临床上相关疾病的诊断提供诊断依据。因此，发展生物硫醇有效的检测方法具有非常重要的现实意义。

目前，已经发展了许多方法用于生物硫醇的检测，包括高效液相色谱-质谱法、区带毛细管电泳法、电化学法、以及电感耦合等离子体-质谱法(简称icp-ms)等。但是这些检测技术往往存在一些不可避免的缺点，例如仪器昂贵且笨重、操作程序复杂、测量时间长，并且对操作者的技能要求高，需要专门技术人员人操作等。为了克服上述涉及的主要问题，基于荧光探针检测生物硫醇的技术受到越来越多的关注，也得到了广泛的发展。然而，尽管这些检测技术对生物硫醇具有较高的选择性和灵敏度，但是这些方法往往涉及复杂并且昂贵的分子信标探针的修饰以及荧光团和荧光淬灭基团的标记，所以该类传感器往往耗时且需要繁琐的前处理过程。因此，亟需开发一种简单快速、灵敏度高、选择性好的荧光传感检测技术应用于生物硫醇的分析检测。

技术实现要素：

针对上述现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法，利用nrpcnrs-ag⁺的可逆络合，无须荧光标记，便能够在生物硫醇中实现荧光恢复并即时定量分析。

提供一种基于稻叶状氮掺杂碳纳米带的无标记生物硫醇荧光检测方法，检测步骤包括：①将容器内依次加入磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline，简称pbs)、稻叶状氮掺杂碳纳米带(简称nrpcnrs)荧光探针溶液和银离子溶液；②分组并加入含不同浓度生物硫醇的标准溶液和含未知浓度生物硫醇的待测样品，③稀释混匀后温育；④测定各组溶液荧光强度的变化；⑤以标准溶液组加入的生物硫醇浓度为横轴，标准溶液荧光恢复程度[(fl-fl0)]/fl0为纵轴，绘制标准曲线；⑥通过待测样品的荧光恢复程度与所述标准曲线对比，判定样品的生物硫醇浓度。

优选的，在步骤①中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针与银离子的质量比为(2-3):1。

优选的，在步骤③中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针浓度为10-25μg/ml，银离子浓度为70-90μm。

优选的，在步骤④中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带的氮掺杂含量为(35-37)wt％。优选的，荧光激发波长为355nm、激发和发射狭缝宽均为3nm。生物硫醇包括半胱氨酸和谷胱甘肽中的至少一种，更优选的，所述待测样品为生物样品，含有血清和细胞中的至少一种。

优选的，在步骤⑤和⑥中，绘制所述标准曲线及计算待测样品中生物硫醇含量的方法，采用标准加入法。

一种稻状叶氮掺杂碳纳米带在生物硫醇检测中的应用，通过上述检测方法，结合nrpcnrs-ag⁺对待测样品进行无标记荧光检测。

优选的，荧光探针外形为稻叶状，粒径为100-120nm，n元素掺杂量(35-37)wt％，激发波长为355nm。

进一步，所述稻状叶氮掺杂碳纳米带的荧光探针通过水热合成法制备，制备步骤包括：

将1.1g尿酸(uricacid)，25ml无水乙醇和25ml去离子水混合，在超声条件下混匀为悬浮液；将制备的25ml悬浮液转移到聚四氟乙烯高温反应釜中，并在180℃下保持4.5h；自然冷却至室温，用二氯甲烷萃取所得产物，并将萃取所得水相溶液冷藏5-10天，静置除去长度大于1μm的大尺寸nrpcnrs；然后，再将收集到的溶液于8000rpm离心15min，取上层亮黄色nrpcnrs水溶液，并将所得亮黄色溶液在4℃下储存备用。

本发明所带来的综合效果：

1、本发明采用简单快速的水热法合成水溶性好、分散均匀、具有荧光特性、荧光稳定的稻叶状氮掺杂碳纳米带，并将所述nrpcnrs作为荧光探针构建高灵敏、高选择性检测生物硫醇的荧光纳米传感器。

2、由于ag+离子与nrpcnrs上的n原子相互作用可以诱导nrpcnr发生荧光猝灭，形成非荧光配位络合物，而一旦在nrpcnrs-ag⁺反应体系中加入生物硫醇，由于ag⁺离子更容易与生物硫醇分子内的s原子形成稳定的ag-s键，从而使结合在nrpcnrs上的ag⁺释放出来，nrpcnrs的荧光强度就会恢复，并且nrpcnrs荧光强度的恢复程度与添加到反应体系中生物硫醇的量呈一定的相关性。

3、本发明的基于nrpcnrs的无标记生物硫醇检测新方法能够有效地实现人血清中生物硫醇高灵敏、高选择性检测，并且方法简单、快速、线性检测范围宽，为高效检测生物样品中的生物硫醇提供了有效途径，具有潜在的应用价值。

图说明

图1为本发明实施例的溶液荧光光谱及荧光亮度示意图；

其中，a.nrpcnrs(20μg/ml),b.nrpcnrs(20μg/ml)+ag⁺(80μm),c.nrpcnrs(20μg/ml)+ag⁺(80μm)+cys(100μm),d.nrpcnrs(20μg/ml)+cys(100μm)；内插图从左到右为不同溶液的荧光照片:1.nrpcnrs，2.nrpcnrs+ag⁺，3.nrpcnrs+ag⁺+cys，4.nrpcnrs+cys。

图2为本发明实施例检测方法中nrpcnrs的紫外光谱图以及nrpcnrs在355nm激发下的发射光谱图；内插图是nrpcnrs在1.自然光和2.紫外灯365nm照射下的图片。

图3为本发明实施例检测方法中溶液的透射电镜(tem)图；其中a.nrpcnrs，b.nrpcnrs-ag⁺以及c.nrpcnrs-ag⁺-cys。

图4为本发明实施例检测方法在最大发射波长420nm处得到nrpcnrs的荧光强度谱图；其中，检测条件变量为a.ag⁺浓度，b.pbs缓冲液ph值。

图5为本发明实施例检测方法采用nrpcnrs检测cys和gsh的谱图：a.nrpcnrs-ag⁺溶液，在cys浓度从0至200μm下的荧光光谱；b.nrpcnrs荧光探针的相对荧光强度[(fl-fl0)/fl0]，随cys浓度变化定量检测cys浓度的标准曲线图；c.nrpcnrs-ag⁺溶液，在gsh浓度从0至200μm下的荧光光谱；d.nrpcnrs荧光探针的[(fl-fl0)/fl0]，随gsh浓度变化定量检测gsh浓度的标准曲线图。

图6为本发明实施例检测方法是nrpcnrs-ag⁺检测不同生物样品的[(fl-fl0)/fl0]强度对比图，考察本发明检测方法中nrpcnrs对cys的选择性。

具体实施方式

下面结合具体实施例及图对本发明做进一步解释说明，但应理解，本发明的范围不限于此。在本实施方式中，分光光度计选用hitachi日立的荧光光谱仪，型号为f-7000。定量检测溶液生物硫醇含量采用现有技术中的标准加入法进行数据处理。具体地，参照国家质检总局发布的国标gb18582中所述标准加入法以及美国国家环境保护局《methodofstandardadditionsandeffectsofdilution》中所述标准加入法进行实施。

实施例

(1)水热合成法制备nrpcnrs荧光纳米探针

将1.1g尿酸，25ml无水乙醇和25ml去离子水混合，在超声条件下混匀为悬浮液；将制备的25ml悬浮液转移到聚四氟乙烯高温反应釜中，并在180℃下保持4.5h；自然冷却至室温，用二氯甲烷萃取所得产物，并将萃取所得水相溶液冷藏5-10天，静置除去长度大于1μm的大尺寸nrpcnrs；然后，再将收集到的溶液于8000rpm离心15min，取上层亮黄色nrpcnrs水溶液，并将所得亮黄色溶液在4℃下储存备用。

(2)本实施例基于上述合成的稻叶状氮掺杂碳纳米带作为无标记荧光探针构建高灵敏、高选择性检测生物硫醇的荧光纳米传感器，用于生物硫醇的检测，检测步骤包括：

①首先向1.5ml离心管中依次加入50μl浓度为50mm，ph为7.4的pbs缓冲溶液，5μl浓度为2mg/ml的nrpcnrs荧光探针溶液，40μl浓度为1mm的ag+离子溶液；②分组并加入含不同浓度生物硫醇的标准溶液和含未知浓度生物硫醇的待测样品，③再用去离子水稀释反应溶液体积至500μl，并在涡旋混合器上充分混匀后，将反应混合物在室温下温育20min；④测定各组溶液荧光强度的变化；⑤以标准溶液组加入的生物硫醇浓度为横轴，标准溶液荧光恢复程度[(fl-fl0)]/fl0为纵轴，绘制标准曲线；⑥通过测试待测样品的荧光恢复程度与所述标准曲线对比，判定样品的生物硫醇浓度。

在步骤①中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针与银离子的质量比为2.3:1。

在步骤③中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带荧光探针浓度为20μg/ml，银离子浓度为80μm。

在步骤④中，所述稻叶状氮掺杂碳纳米带的氮掺杂含量为35-37wt％。荧光激发波长为355nm、激发和发射狭缝宽均为3nm。生物硫醇包括半胱氨酸和谷胱甘肽，所述待测样品为生物样品，含有血清。

在步骤⑤和⑥中，绘制所述标准曲线及计算待测样品中生物硫醇含量的方法，采用标准加入法。

所述的nrpcnrs荧光探针的制备方法，采用水热合成法制备，荧光探针外形为稻叶状，粒径为150-180nm，n元素掺杂量(35-37)wt％，激发波长为355nm。

检测机理：由于ag⁺与nrpcnrs上的n原子相互作用可以诱导nrpcnr发生荧光猝灭，形成非荧光配位络合物，而一旦在nrpcnrs-ag⁺反应体系中加入生物硫醇，由于ag⁺离子更容易与生物硫醇分子内的s原子形成稳定的ag-s键，从而使结合在nrpcnrs上的ag⁺释放出来，nrpcnrs的荧光强度就会恢复，并且nrpcnrs荧光强度的恢复程度与添加到反应体系中生物硫醇的量呈一定的相关性。

(3)应用稻状叶氮掺杂碳纳米带，通过本实施例方法检测生物硫醇，结合nrpcnrs-ag⁺对待测样品进行无标记荧光检测，样品检测及探针表征结果如图1-6所示：

结果表明，本发明设计能够有效地实现生物硫醇高灵敏、高选择性检测。

1)如图1所示，本发明采用水热合成法制备的nrpcnrs具有良好的荧光性能(图1a)，当将适当量的ag+离子加入到nrpcnrs溶液中时，nrpcnrs的荧光被ag⁺离子猝灭(图1b)，而当再继续向其溶液中加入生物硫醇(cys)时，nrpcnrs90％的荧光得到恢复(图1c)，同时也证实了cys不会对nrpcnrs的荧光产生影响(图1d)。说明能够将nrpcnrs作为荧光探针建立生物硫醇的纳米荧光传感检测新方法。

nrpcnrs作为荧光探针进行检测前，首先对其进行了紫外表征和tem表征，表征结果如图2和图3所示。

2)从图2能够看出，如图2中所示，nrpcnrs的紫外吸收光谱分别在和处显示出两个特征峰(曲线a)，并以355nm作为最佳激发波长，可以激发nrpcnrs发出荧光光谱(420nm)(曲线b)，同时，图2中的内插图也进一步表明了nrpcnrs的荧光特性。上述结果表明，所制备的nrpcnrs能够用作为荧光纳米探针，用于生物硫醇的定量分析。

3)图3是不同溶液tem图。如图3a所示，nrpcnrs荧光探针外形类似稻叶状，粒径为150-180nm；由于ag⁺与nrpcns内的氮原子之间可以形成ag-n键，使nrpcnrs发生聚集(图3b)，从而导致nrpcnrs的荧光猝灭。而当在nrpcnrs-ag⁺的反应体系中加入cys后，nrpcnrs没有发生明显的聚集现象(图3c)，这一结果表明，ag⁺离子更容易与生物硫醇分子内的s原子形成稳定的ag-s键，从而使结合在nrpcnrs上的ag+释放出来，nrpcnrs的荧光强度恢复。

4)如图4所示，为了能够更好的实现生物硫醇的有效检测，本发明研究了ag⁺的浓度和pbs缓冲溶液的ph对检测结果的影响。优化结果表明，检测体系最佳ag⁺的浓度为80μm，pbs缓冲溶液的最佳酸碱度为ph＝7.4。

5)cys和gsh的检测。在优化的条件下(50mm,ph7.4pbs,20μg/mlnrpcnrs,80μmag⁺)，采用本发明实施例方法测定一系列不同浓度的cys和gsh，结果如图5所示，图5a显示了cys在0-200μm浓度范围内nrpcnrs荧光强度的变化。在80μmag⁺的存在下，随着cys浓度的增加，nrpcnrs在420nm处的荧光强度也增加(图5b)，并且在0.05-10μm浓度范围内呈现良好的线性关系。图5c和5d为gsh检测结果图。结果显示，随着gsh浓度的增加，nrpcnrs在420nm处的荧光强度也增加(图5d)，并且在0.5-30μm浓度范围内呈现良好的线性关系，以上结果充分说明了本发明设计的荧光传感器对生物硫醇有良好的响应。

6)方法选择性考察。本发明考察了检测系统的选择性，对复杂的生物体系中可能存在的非硫醇氨基酸干扰物质包括pro,val,tyr,ser,his,try,arg,glu,thr,phe,lys,ala和gly进行了考察。如图6所示，在含有不同的非硫醇氨基酸复杂生物体系环境中，检测系统对cys和gsh具有很高的选择性。说明本发明构建的荧光传感器在检测复杂生物系统中生物硫醇具有较好的选择性。

7)实际样品分析。本发明以标准加入法测定正常人血清中cys为例，验证本发明设计的荧光传感器在实际样品分析检测中的实用性。结果如附表1所示，cys的回收率在96.2％-104.8％之间，并且相对标准偏差小于5.0％，说明发明实施例方法具有较好的可靠性。同时，测定正常人血清中cys的含量也在正常范围内。上述结果说明，本发明设计的基于nrpcnrs的无标记生物硫醇检测新方法能够有效地实现人血清中生物硫醇高灵敏、高选择性检测，并且方法简单、快速、线性检测范围宽，为高效检测生物样品中的生物硫醇提供了有效途径，具有潜在的应用价值。

表1nrcnrs作为荧光探针检测待测样品中的cys

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外，应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。