一种检测畜禽肉制品中添加剂的方法与流程

本发明公开涉及添加剂检测的技术领域，尤其涉及一种检测畜禽肉制品中添加剂的方法。

背景技术：

市场销售的熟肉制品在加工工程中由于追求色泽、延长保质期等，添加防腐剂、甜味剂等食品添加剂，虽然我国已对食品添加剂的添加限量提出要求，但滥用食品添加剂的现象仍然十分严重，长期食用含有大量食品添加剂的食品会对人体的健康带来很大的潜在危害。

由于肉制品中的蛋白质和脂肪的分解，会导致肉制品品质劣化。为延长保质期，防止肉制品腐败，在肉制品加工过程中常常要加入防腐剂。口感是评价熟肉制品中最主要的指标，熟肉制品在加工过程中为了追求口感往往使用甜味剂。目前，根据我国国家标准gb2760-2007现行允许使用的食品添加剂规定，在肉制品中常用的防腐剂有山梨酸及其钾盐。对于其他类的防腐剂如苯甲酸等则有严格的限制，国家标准不得检出。高含量的甜味剂依然在我国食品中广泛使用，而按照国家标准gb2760-2007中关于肉及肉制品中食品添加剂的相关标准的规定，肉制品中只允许加入天然的甜味剂，如果在肉制品样品中检测出有人工合成甜味剂即为非法添加。

开展添加剂分析研究和开发相关的检测方法，是加强添加剂监控中非常重要的一步。随着食品安全问题日益被重视，食品检验机构面临大量的检测工作，而目前检测方法仍以一个或几个添加剂的检测为主，因此样品需要重复处理，分别检测，耗时费力。并且都是针对目标化合物的检测，无法实现多种添加剂的筛查，仍然会出现假阳性样品的检出。

因此，如何研发一种可实现多中添加剂同时检测，特别是样品中多种添加剂的筛查、确证是许多添加剂分析工作者亟待解决的问题。

技术实现要素：

鉴于此，本发明公开提供了一种检测畜禽肉制品中添加剂的方法，以至少解决以往的检测方法仍以一个或几个添加剂的检测为主，导致被检测样品需要重复处理，分别检测，耗时费力，检测效率低等问题。

本发明提供的技术方案，具体为，一种检测畜禽肉制品中添加剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)样品前处理：

称取样品放置于离心管中，并加入体积浓度为50％的乙醇水溶液，进行振荡提取、离心后，收集上清液于另一离心管中，再加入体积浓度为50％的乙醇水溶液重复提取一次，得提取液；

将提取液经中性氧化铝柱净化，浓缩、定容后，备用；

2)定性分析：

运用uplc-ms/ms-qtrap法对经过样品前处理的待检测畜禽肉制品样品进行筛查，采用液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的增强子离子扫描功能，建立mrm-ida-epi筛查方法，获得待检测畜禽肉制品样品中各目标添加剂母离子的ms²谱图，用已知数据库中各添加剂的标准ms²谱图与获得待检测畜禽肉制品样品中各目标添加剂母离子的ms²谱图分别进行对比后，获得相似度值，并且匹配两者的特征碎片离子，进而判断待检测畜禽肉制品样品中是否含有目标添加剂；

3)定量分析：

分别称取各添加剂标准品，用水分别配制10μg/ml的标准储备液，备用；

按照步骤1)中的样品前处理方法对空白样品进行处理后，用空白样品基质溶液稀释标准储备液，制成混合标准储备溶液；

将混合标准储备溶液定容后，得到空白样品基质溶液，配制浓度为0.05μg/ml～5.0μg/ml的系列匹配标准工作溶液；

采用液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪对系列匹配标准工作溶液和经过样品前处理的待检测畜禽肉制品样品分别进行测定，获得以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标的绘制标准曲线，以此标准曲线来计算待检测畜禽肉制品样品中目标添加剂的含量。

优选，所述添加剂为糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、乙萘酚、水杨酸、阿力甜、纽甜、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯中的一种或多种。

进一步优选，所述步骤1)样品前处理具体为：

称取样品5.00g放置于100ml离心管中，并加入20ml体积浓度为50％的乙醇水溶液，震荡提取20min，以8000r/min离心5min，收集上清液于另一离心管中，再加入20ml体积浓度为50％的乙醇水溶液重复提取一次，得提取液；

将提取液过中性氧化铝填充的玻璃柱后，收集20ml溶液在40℃下旋转蒸发至近干，加入1.0ml体积溶度为20％的乙醇水溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜，备用。

进一步优选，所述步骤2)中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；

扫描模式：负离子扫描；

采集模式：多反应监测；

信息关联扫描：强度阈值100cps；

增强子离子扫描：质量数采集范围m/z50～1000da；

电喷雾电压：-4500v；

雾化气压力：50psi；

气帘气压力：30psi；

辅助气压力：50psi；

离子源温度：500℃；

入口电压：-10v；

碰撞室出口电压：-10v；

碰撞气能量：20、35、50v；

扩展碰撞能量：15v。

进一步优选，所述步骤3)中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的色谱条件为：

色谱柱：watersbehc18反相色谱柱；

柱温：40℃；

进样体积：10μl；

流速：0.2ml/min；

流动相：流动相a：0.02mol/l乙酸铵水溶液，b：甲醇，梯度洗脱程序：0min，90％a；1min，90％a；5min，10％a；7min，10％a；7.1min，90％a；12min，90％a；

所述步骤3)中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源；

扫描模式：负离子扫描；

采集模式：多反应监测；

电喷雾电压：-4500v；

雾化气压力：50psi；

气帘气压力：30psi；

辅助气压力：50psi；

离子源温度：500℃；

入口电压：-10v；

碰撞室出口电压：-10v。

进一步优选，所述待检测畜禽肉制品样品为酱牛肉或香肠。

本发明提供的检测畜禽肉制品中添加剂的方法，针对添加剂检测现状，采用体积浓度为50％乙醇水溶液提取，中性氧化铝柱净化的前处理方法，应用超高效液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪，建立了畜禽肉制品中15种添加剂同时筛查、确证的检测方法，具有操作简单、通量高效、定性准确、灵敏度高、环境友好等特点，适合用于肉制品中多种添加剂的筛查、确证，可极大的提高检测效率，避免假阳性样品的检出。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明公开实施例提供的一种待检测畜禽肉制品中可疑峰的ms²谱图；

图2为本发明公开实施例提供的添加剂-罗丹明b的标准ms²谱图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的方法的例子。

本实施方案通过以下技术方案来实现在畜禽肉制品中同时检测防腐剂、甜味剂共15种添加剂含量的方法，具体包括以下步骤：

样品前处理：

1、样品提取：

准确称取样品5.00g(精确至0.01g)放置于100ml离心管中，并加入20ml体积浓度为50％的乙醇水溶液，震荡提取20min，以8000r/min离心5min，收集上清液于另一离心管中，再加入20ml体积浓度为50％的乙醇水溶液重复提取一次，得提取液；

2、样品净化：

将提取液过中性氧化铝填充的玻璃柱后，收集20ml溶液在40℃下旋转蒸发至近干，加入1.0ml体积溶度为20％的乙醇水溶液溶解残渣，过0.22μm滤膜，备用。

定性分析：

uplc-ms/ms-qtrap法定性测定：采用mrm-ida-epi筛查确证方法，可实现定性定量一次性完成，可应用于复杂基质样品的分析。

先采用液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪经过样品前处理的待检测畜禽肉制品样品进行探测扫描，系统自动判断探测扫描采集的信号强度是否超过ida条件设置中的各项设置值，即判断是否出现色谱峰。当满足预设置值时，系统快速(<1ms)自动切换为线性离子阱模式，进行增强子离子扫描(epi)，并获得探测扫描所得母离子的高质量ms²谱图，用已知数据库中各添加剂的标准ms²谱图与获得待检测畜禽肉制品样品中各目标添加剂母离子的ms²谱图分别进行对比后，获得相似度值，并且匹配两者的特征碎片离子，进而判断待检测畜禽肉制品样品中是否含有目标添加剂。

定量分析：

对基质匹配标准工作溶液和待检测样品进行测定，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，以此标准曲线来计算供试样品中目标添加剂的含量。

其中，定量分析中液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪采用的色谱条件为：acquitywatersbehc18柱(2.1×100mm，1.7μm)，流动相a：0.02％乙酸铵水溶液；b：甲醇，采用梯度洗脱，梯度洗脱条件见表1，流速0.2ml/min，柱温40℃，进样体积10μl。

表1.液相色谱梯度洗脱程序

其中，液相色谱-串联四极杆线性离子阱质谱仪采用的质谱条件为：电离模式：电喷雾负离子esi(-)；检测方式：多反应监测扫描(mrm)；电喷雾电压(is)：-4500v；雾化气压力(gs1)：50psi；气帘气压力(cur)：30psi；辅助气压力(gs2)：50psi；离子源温度(tem)：500℃；入口电压(ep)：-10v；碰撞室出口电压(cxp)：-10v。

15种添加剂的保留时间及质谱采集参数见表2。

表2.待测添加剂的质谱参数

*定量离子。

本实施方案提供的检测畜禽肉制品中添加剂的方法与现有技术相比，具有以下优良效果：

(1)本实施方案建立了一种分析畜禽肉制品中15种添加剂的uplc-ms/ms-qtrap筛查、确证方法，实现了多种添加剂的同时检测。

(2)本实施方案采用体积浓度为50％的乙醇水溶液提取，中性氧化铝柱净化的样品前处理方法，实现了15种添加剂同时提取、净化，具有简便、高效、快速、环境友好等优点。

(3)本实施方案采用的提取溶液为体积浓度为50％乙醇水溶液，只需加入乙醇一种常用溶液即可，且乙醇的毒性较小，利于环保。采用填充的中性氧化铝玻璃柱净化方式，成本低，净化效果好，该前处理方法操作简便，成本低，溶剂环保。

(4)本实施方案采用选择性好，抗干扰能力强的uplc-msms-qtrap方法检测，稳定性好，灵敏度高，准确度和精密度均符合多残留分析方法的要求，同时具有筛查、确证功能，可避免假阳性样品的检出。选择mrm-ida-epi功能，在ida中设置相关的判定标准，连接液相，输入液相的采集条件，进行数据采集，一旦mrm采集的信号强度超过判定标准值，就会触发epi进行增强子离子扫描采集ms²图，对采集的图谱打开其可疑峰(通过保留时间、峰形等判断)的ms²图，进行已知谱库搜索等操作，同谱库的质谱数据进行对比，得到相应的匹配数据，用以进行判断残留的检出，进而实现快速筛查和确证的目的。

(5)本实施方案的检出限和定量限低，方法灵敏度高，回收率稳定，重现行好，符合多残留分析的要求。

具体实施例

下面以具体的实施例对本发明进行更进一步的解释说明，但并不用于限制本发明的保护范围。

下面采用上述方法对香肠、酱牛肉两种畜禽肉制品中15种添加剂含量的测定及可疑峰筛查。

1.仪器和试剂

主要仪器：acquity^tm超高效液相色谱仪(美国waters公司)；absciexqtrap5500四极杆-离子阱质谱仪(美国ab公司)。

主要试剂：糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、乙萘酚、水杨酸，纯度均≥98.0％，购自德国dr.ehrenstorfer；阿力甜、纽甜，纯度均≥98.0％，购自上海安普公司；对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，纯度均≥98.0％，购自迪马公司。

2.标准溶液配制：

准备标准储备液：分别称取各标准品适量，用水配制为约10μg/ml的标准储备液，置于0℃～4℃冰箱中保存备用。

准备基质匹配标准工作溶液：为了消除基质效应对定量测定的影响，用空白样品溶液稀释混合标准储备溶液。对空白样品按下述相同前处理方式处理，用空白样品基质溶液稀释混合标准储备溶液，定容得到空白样品基质溶液，配制浓度为0.05μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的系列匹配标准工作溶液。

3.色谱质谱分析条件：

色谱分析条件：

watersbehc18反相色谱柱；流动相a：0.02mol/l乙酸铵水溶液，b：甲醇；采用梯度洗脱，流速0.2ml/min，梯度洗脱程序：0min，90％a；1min，90％a；5min，10％a；7min，10％a；7.1min，90％a；12min，90％a；柱温40℃；进样体积10μl。

质谱分析条件：

离子源：电喷雾离子源；扫描模式：负离子扫描；采集模式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压(is)：-4500v；雾化气压力(gs1)：50psi；气帘气压力(cur)：30psi；辅助气压力(gs2)：50psi；离子源温度(tem)：500℃；入口电压(ep)：-10v；碰撞室出口电压(cxp)：-10v。其中，15种添加剂的保留时间及质谱采集参数见表2。

4.样品前处理方法：

样品提取：准确称取样品5.00g(精确至0.01g)，置于100ml离心管中，加入提取液体积浓度为50％的乙醇水溶液20ml，振荡提取20min后，以8000r/min离心5min，收集上清液于另一离心管中，再加入20ml液体积浓度为50％的乙醇水溶液重复提取一次，得提取液。

样品净化：将提取液过中性氧化铝填充的玻璃柱，收集20ml溶液在40℃下旋转蒸发至近干，加入1.0ml乙醇-水(体积比2:8)溶液溶解残渣，样液过0.22μm滤膜，备用。

5.定量分析及方法的有效性评价：

线性、检出限和定量限：对系列浓度的基质匹配标准溶液进行测定，以浓度为横坐标，定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。然后对供试样品进行测定，得到各种添加剂的定量离子的峰面积，代入标准曲线，计算得15种添加剂的含量。向空白样品中添加不同质量的标准溶液，以3倍信噪比和10倍信噪比分别计算出方法的检出限和定量限。15种添加剂的检出限在0.002～0.06mg/kg之间，定量限在0.006～0.18mg/kg之间，各化合物的线性回归方程、检出限、定量限见表3。

表3.添加剂的线性回归方程、相关系数r、检出限、定量限

准确度和精密度：在0.2、0.4、2.0mg/kg三个浓度水平做加标回收实验，每个浓度水平做6个平行样品，分别进行样品前处理和仪器分析，并按照加标量和测定值计算回收率。畜禽肉制品中15种添加剂的平均回收率和相对标准差(rsd)见表4。由表4可以看出，15种添加剂在香肠、酱牛肉两种畜禽肉制品中的平均回收率在75.2％～94.8％之间，相对标准偏差在4.8％～17.3％之间，符合多残留分析的要求。

表4.畜禽肉制品样品中不同添加水平下的回收率和相对标准偏差(n＝6)

6.可疑峰定性筛查分析举例

采用analyst软件进行高通量的未知物快速筛查。检测实际样品，在mrm扫描模式下发现疑似目标物，通过比对实际样品检测结果和数据库中三种能量下的碎片、丰度比、保留时间等信息进行化合物确证。

质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：负离子扫描；采集模式：多反应监测(mrm)；信息关联扫描(ida)：强度阈值100cps；增强子离子扫描(epi)，质量数采集范围m/z50～1000da；电喷雾电压(is)：-4500v；雾化气压力(gs1)：50psi；气帘气压力(cur)：30psi；辅助气压力(gs2)：50psi；离子源温度(tem)：500℃；入口电压(ep)：-10v；碰撞室出口电压(cxp)：-10v；碰撞气能量(ce)：20、35、50v；扩展碰撞能量(ces)：15v。

选择ms²谱图并且使图形最大化，右击鼠标，点击searchlibrary,软件会自动给出筛查的结果。fit值(匹配值)是用标准物质谱图与可疑样品谱图进行对比后获得的相似度值，满分为100，fit值越大可信度越高说明化合物的可能性越大；revfit值(反相匹配值)是用可疑样品谱图与标准物质谱图进行对比后获得的相似度值；purity值(纯度值)是综合前两种结果得到的数值。图1为样品中可疑峰的ms²谱图，图2为罗丹明b标准品的ms²谱图，从表5可明显看出，库中罗丹明b(rhodamineb)得分高，排列最靠前，并且特征碎片离子都与样品中匹配，由此可判断此样品中含有罗丹明b，进一步提高了对结果确证的信心，避免了假阳性结果的产生。

表5.

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。