基于纳米金‑适配体结构的抗生素检测装置和方法与流程

本发明属于食品安全和水污染检测领域，具体涉及用于水中和食品中抗生素检测的现场快速实时在线检测领域，提出了基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置和方法。

背景技术：

近年来，环境污染问题受到人们的广泛关注，特别是抗生素残留更成为关注的焦点问题。抗生素是一种治疗感染性疾病的特效药物，广泛地用在人类医疗和动物疾病治疗中，具有抗菌性强，使用量大的特点。由于抗生素的大量不合理使用，导致抗生素进入水体，对水环境造成污染。抗生素进入体内，在体内蓄积，会使人产生对抗生素的抗性，引起各种组织器官病变，甚至癌变。因此，如何快速、准确地检测抗生素已成为重中之重。

磺胺类抗生素抗菌作用强，不仅应用在人类医疗中，还用于禽畜养殖中，它不能完全被吸收，在禽畜体内长期积累，通过排泄进入土壤和水体中，对环境造成污染。在人体内，磺胺类抗生素使用过量会造成过敏反应、恶心、呕吐等副作用以及一些血液性的疾病，欧美一些国家检测水中抗生素标准中规定，最大残留限量为100ng/ml，而我国至今还没有国家标准，因此，对磺胺二甲嘧啶的定量检测具有重要意义。

目前，检测抗生素的方法主要包括传统大型仪器检测：毛细血管电泳法（r.hoff,etal.sep.sci.32(2009)854-866）、液相色谱法（jorgej.soto-chinchilla,etal.journalofchromatographya,1095(2005)60–67）、高效液相色谱-串联质谱（hplc-mc)（c.yuetal.talanta90(2012)77–84）等。这些方法具有检测准确，快速的特点，但是要求仪器昂贵，样品前处理比较复杂，对实验人员的操作技术要求较高，分析费时而不易推广。一些快检方法包括微生物分析法、酶联免疫法，胶体金免疫层析试纸条法等层出不穷，微生物法方法简单、费用低，但是重现性差，灵敏度低，耗时长，且易受多种因素干扰而影响结果的准确性，在实际应用中受到很大的限制。酶联免疫法可以快速筛选，但是影响因素多，易出现假阳性结果。胶体金免疫层析试纸条具有成本低，快速，高效，高通量检测等特点。但是由于胶体金颗粒信号放大作用有限，所以胶体金免疫层析试纸条灵敏度不高，并且胶体金免疫层析试纸条很难实现定量检测。因此实现特异好、灵敏度高、快速定量的抗生素检测技术，尤为重要。

核酸适配体(aptamer)是指从人工合成的dna/rna文库中筛选得到的一小段单链寡核苷酸。具有高亲和力、高特异性地和靶标分子结合的特点，它是化学和生物传感器的理想识别分子。2002年，李应福等人利用可以特异性识别atp的适体并与荧光能量共振转移原理结合实现了atp的定量检测(y.li,etal.,j.am.chem.soc.2003,125,4771-4778);2005年李应福课题组又对适体荧光检查方法进行了综述，文章中提出了单荧光团方法、双荧光团方法、双工-复合结构检测方法、原位标记方法、染料嵌入方法等。（y.li,etal.,methods,2005,37,16–25）2012年韩国changillban等人首次利用selex方法筛选出了磺胺二甲嘧啶的适配体，并利用该条适体链结合荧光方法实现了磺胺二甲嘧啶的检测。(k.-m.songetal.,biosensorsandbioelectronics,2012,33,113–119)。

纳米金颗粒是直径在1-100nm的纳米材料，通常分散在溶液中，具有粒径均匀、化学性质稳定、具有尺寸可协调、易于修饰、密度高等优点，并且由于纳米金尺寸较小，因此具有极高的电子密度和良好的介电特性。纳米金颗粒与适体可以通过静电作用结合，而形成一种特殊的检测结构，近些年，用此结构实现抗生素的检测也得到了广泛的关注。2014年，zhounandi等人用纳米金结合适体链方法实现了用光谱法对牛奶中卡那霉素的检测（n.zhou,etal.,anal.methods,2014,6,1569）。2016年，khalilabnous等人用纳米金颗粒和双链dna结构实现了用荧光方法检测牛奶和血清中的链霉素(k.,abnous,etal.,foodchemistry,2016,190,115–121)。2013年陈爱亮课题组，用适配体和纳米金颗粒结构实现了牛奶中磺胺二甲嘧啶的定量检测(a.chenetal.,biosensorsandbioelectronics,2013,42,419–425)。

上述方法虽然都能实现对抗生素浓度的检测，但是最后的检测均用到了大型仪器，例如紫外-可见光分光光度计、荧光光谱仪等，其检测过程复杂漫长，无法实现现场在线快速的检测。

技术实现要素：

本发明克服现有技术存在的不足，所要解决的技术问题为：提供一种基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置和方法，以实现抗生素的快速实时检测。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置，包括：智能设备，多通量检测装置和光学硬件装置，所述多通量检测装置包括导管支架和设置在导管支架上呈一字型排列的多个玻璃导管，所述玻璃导管分别用于放置反应溶液和待测溶液或反应溶液和含有不同浓度的磺胺类抗生素的标准溶液，所述光学硬件装置内设置有用于放置所述多通量检测装置的容纳空间，所述智能设备通过所述光学硬件装置对所述多通量检测装置内的液体进行拍照，所述光学硬件装置用于给所述智能设备拍照提供均匀光照；所述智能设备上设置有拍照程序和浓度计算程序；

所述拍照程序用于对所述多通量检测装置进行拍照得到图片；

所述浓度计算程序用于执行以下程序：

对图片进行分析，得到各个标准溶液和待测溶液对应的成像区域的rgb值；

计算得到各标准溶液和待测溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值；

根据各标准溶液的浓度，以及各标准溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值，建立波长浓度曲线；

将待测溶液的对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值与所述波长浓度曲线进行对比，确定各待测溶液中磺胺类抗生素的浓度，并输出到显示单元显示。

所述光学硬件装置包括壳体，所述壳体底部设置有面光源，上部设置有用于放入所述多通量检测装置的条形开口，所述条形开口上设置有用于封闭所述开口的活动密封盖，所述壳体上与所述多通量检测装置垂直的侧面设置有镜头连接口，所述智能设备通过所述镜头连接口对所述壳体内的多通量检测装置内的液体进行拍照。

所述玻璃导管为微量玻璃导管，所述多通量检测装置包括8~12个玻璃导管，其中7~10个用于放置反应溶液和标准溶液，3~5个用于放置反应溶液和待测溶液。

本发明还提出了一种基于所述纳米金-适配体结构的抗生素检测装置的检测方法，包括以下步骤：

s1、首先将要检测的该种类抗生素对应的适体链溶液和纳米金颗粒溶液混合，得到反应溶液，将等体积的反应溶液分别放入所述多通量检测装置内的各个玻璃导管内；

s2、再在各个所述玻璃导管内分别加入等体积的待测溶液以及含有不同浓度的要检测的该种类抗生素的标准溶液；

s3、然后在各个玻璃导管内加入等体积相同浓度的nacl溶液后，将所述多通量检测装置放入光学硬件装置内；

s4、最后利用智能设备通过所述光学硬件装置对多通量检测装置内的液体进行拍照，通过智能设备内的浓度计算程序，对图片进行分析，得到各个标准溶液和待测溶液对应的成像区域的rgb值，以及该rgb值在cie1931色品图中对应的波长值，并根据各标准溶液的浓度，和各标准溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值，建立波长浓度曲线，最后将待测溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值与所述波长浓度曲线进行对比，得到各待测溶液中的磺胺类抗生素浓度，并输出到显示单元显示。

所述要检测的抗生素为磺胺二甲氧嘧啶，所使用的适体链为5’-gagggcaacgagtgtttata-3’。

所述步骤s1中，所述适体链溶液的浓度为0.5μm，适体链溶液和纳米金溶液的体积比为1:1~3:1；所述步骤s3中，加入的nacl溶液的浓度为0.04m。

所述检测方法适用于浓度小于1ppm的抗生素溶液。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明所提供的一种基于纳米金-适配体结构的抗生素检测方法，是将待测溶液加入纳米金-适配体混合溶液后再加入盐溶液，利用适体链可以和纳米金颗粒静电结合，导致纳米金表面附着适配体链，此时纳米金颗粒的表面电荷不会暴露，若直接加入nacl盐溶液，纳米金颗粒不会发生聚集，溶液颜色仍为红色；当加入含抗生素的溶液以后，由于抗生素与适体链的结合力大于纳米金与适体链的结合力，则抗生素与适体链特异性结合，使得纳米金表面的负电荷暴露出来，导致加入盐溶液以后，纳米金发生颗粒聚集，溶液由红色逐渐变成蓝紫色，由于溶液的颜色与磺胺类抗生素的浓度密切相关，因此，本发明根据纳米金溶液颜色的变化来判断所检测的溶液中抗生素的含量，并对纳米金溶液的颜色进行拍照转化为图片的rgb，通过将将图片的rgb值对应的补色波长与标准溶液图片的补色波长-浓度曲线进行对比，可以自动识别出待测溶液中抗生素的浓度；

此外，本发明的检测装置还包括多通量检测装置和光学硬件装置，光学硬件装置可以给智能设备拍照提供均匀光照，并且极大程度减小环境光的影响，提高了测量精度，另一方面，多通量测装置检测装置包括多个玻璃导管，其中一部分用来放入标准溶液，另一部分放入待测溶液，使得该装置可以一次拍照即可以分析得到波长-浓度曲线，进而得到多份待测溶液的浓度，极大地简化了测量步骤，提高了测量效率，而且测量过程简单易行，灵敏度好、特异性好、准确度高，同时该方法检测耗时短，检测成本低，且可以实现实时在线现场检测。

附图说明

图1是本发明的检测原理图；

图2为本发明的实验4中，通过分光光度计得到的溶液的吸收光谱的最大吸收峰位置与浓度的关系曲线；

图3为本发明提出的一种基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置的剖视图；

图4为本发明提出的一种基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置的外形示意图；；

图5为通过本发明的检测装置得到的标准溶液反应成像后的图片rgb值对应的波长与浓度的关系曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如图1所示，本发明的实施例是以磺胺二甲氧嘧啶（sdm）这种抗生素为例来进行抗生素的检测的，本发明提出的基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置和方法的检测原理，是基于纳米金在盐溶液中聚集发生颜色变化以及抗生素可特异性地与适体链结合，并且该结合力远大于纳米金颗粒与适体链的静电结合力。具体原理为：适体链可以和纳米金颗粒静电结合，导致纳米金表面附着适配体链，此时纳米金颗粒的表面电荷不会暴露，当没有sdm存在于溶液中时，加入盐以后纳米金颗粒不会发生聚集，溶液颜色仍为红色；当加入sdm以后，由于sdm与适体链的结合力大于纳米金与适体链的结合力，此时sdm与适体链特异性结合，纳米金表面的负电荷暴露出来，导致加入盐溶液以后，纳米金发生颗粒聚集，溶液由红色逐渐变成蓝紫色，在sdm浓度越大的情况下，溶液的颜色越靠近蓝紫色，因此，纳米金溶液的颜色与sdm的浓度密切相关。

本实施例中，选用的适体链为：5’-gagggcaacgagtgtttata-3’。

为了进行磺胺二甲氧嘧啶抗生素的准确检测，本发明的发明人进行了如下准备实验。

实验1、盐浓度的选择

取定量实验所用的aunp溶液，向溶液中分别加入0m，0.005m，0.01m，0.02m，0.03m，0.04m，0.05m的nacl溶液后，立即放在紫外-可见光光度计下扫描光谱。

结果表明：随着加入盐浓度的逐渐增加，aunp在514nm处的吸收峰逐渐减小，并且逐渐发生红移，直到0.04m达到稳定，因此实验中选择0.04m作为实验中选用的盐浓度。

实验2、适体链溶液浓度优化

取定量实验所用的aunp溶液，向溶液中分别加入0μm，0.05μm，0.1μm，0.2μm，0.5μm，1μm的适体链溶液，充分混匀后加入nacl溶液，后立即放在紫外-可见光光度计下扫描光谱。

结果表明：随着加入适体链溶液浓度的逐渐增加，aunp在514nm处的吸收峰逐渐增大，直到0.5μm达到稳定，因此实验中选择0.5μm作为实验中选用的适体链溶液浓度。

实验3、各个试剂加入的顺序优化

在实验中，各个试剂的加入顺序会影响实验的成功与否，选择了五种反应顺序，分别为aunp+适体链+sdm+盐溶液、aunp+适体链+盐+sdm、aunp+盐+适体链+sdm、适体+sdm+aunp+盐、适体+sdm+盐+纳米金。

结果表明：盐对aunp颗粒的聚集具有很强的作用，因此必须最后加盐，为了方便实际检测，优选的试剂加入顺序为：aunp+aptamer+sdm+salt。

实例4

实验4、不同浓度sdm检测

按上述优化好的顺序，进行不同浓度抗生素检测实验，通过分光光度计测定溶液的紫外-可见光吸收光谱。

结果表明：如图2所示，随着加入溶液中磺胺类抗生素浓度的逐渐增加，吸收光谱的最大吸收峰位置逐渐发生红移，到5ppm时达到稳定，证明该方法可以实现sdm的定量检测。

虽然上述只对磺胺二甲氧嘧啶（sdm）这种抗生素的检测原理和准备实验进行了说明，但是，对于其他抗生素，也可以通过其对应的适配体溶液和纳米金颗粒，来实现浓度的检测，例如，对于卡那霉素，其适体链为：5’-agatgggggttgaggctaagccga-3’，对于atp，其适体链为cctgggggagtattgcggaggaagg、对于新霉素b，其适体链为uugaguaagucugcaacuagaugcuucacg。

本发明提供的一种基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置，包括：智能设备，多通量检测装置1和光学硬件装置2，如图3和图4所示，所述多通量检测装置1包括导管支架11和设置在导管支架11上呈一字型排列的多个玻璃导管12，所述玻璃导管12分别用于放置反应溶液和待测溶液或反应溶液和含有不同浓度的磺胺类抗生素的标准溶液，所述光学硬件装置2内设置有用于放置所述多通量检测装置1的容纳空间，所述智能设备通过所述光学硬件装置2对所述多通量检测装置内的液体进行拍照，所述光学硬件装置用于给所述智能设备拍照提供均匀光照；所述智能设备上设置有拍照程序和浓度计算程序；所述拍照程序用于对所述多通量检测装置进行拍照得到图片；所述浓度计算程序用于执行以下程序：对图片进行分析，得到各个标准溶液和待测溶液对应的成像区域的rgb值；计算得到各标准溶液和待测溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值；根据各标准溶液的浓度，以及各标准溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值，建立波长-浓度曲线；将待测溶液的对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值与所述波长浓度曲线进行对比，确定各待测溶液中磺胺类抗生素的浓度，并输出到显示单元显示。

如图5所示，为通过智能设备拍照得到的标准溶液反应成像后的图片rgb值对应的波长与浓度的关系曲线图，从图中可以看出，在小于1ppm的浓度下，磺胺类抗生素浓度与波长有较好的线性关系，因此，通过标准溶液对应的反应溶液的图片rgb对应的波长-浓度曲线来对比得到待测溶液的浓度，不仅具有检测快捷的优点，而且具有较高的测量精度。

进一步地，如图3所示，所述光学硬件装置包括壳体21，所述壳体21底部设置有面光源22，上部设置有用于放入所述多通量检测装置1的条形开口23，所述条形开口23上设置有用于封闭所述开口的活动密封盖24，所述壳体21上与所述多通量检测装置垂直的侧面设置有镜头连接口25，所述壳体21内部设置有用于放置所述多通量检测装置2的托架26，所述智能设备通过所述镜头连接口25对所述多通量检测装置内的液体进行拍照。所述光学硬件装置可以是由3d打印机打印。此外，所述壳体21可以为上下分体式设计，以便于放入所述面光源。

进一步地，所述玻璃导管为微量玻璃导管，所述多通量检测装置包括8~12个玻璃导管，其中7~10个用于放置反应溶液和标准溶液，3~5个用于放置反应溶液和待测溶液。其中，所述导管支架也可以是由3d打印机打印。

应用本发明的基于纳米金-适配体结构的抗生素检测装置进行抗生素浓度检测的检测方法包括以下步骤：

s1、首先将适体链溶液和纳米金颗粒溶液混合，得到反应溶液，将等体积的反应溶液分别放入所述多通量检测装置内的各个玻璃导管内；其中，所述适体链溶液的浓度为0.5μm，所述适体链溶液和纳米金溶液的体积比为1:1~3:1。

s2、再在各个所述玻璃导管内分别加入等体积的待测溶液以及含有不同浓度的磺胺类抗生素的标准溶液；其中，7~10个玻璃导管用于放置反应溶液和标准溶液，3~5玻璃导管用于放置反应溶液和待测溶液。

s3、然后在各个玻璃导管内加入等体积相同浓度的nacl溶液后，将所述多通量检测装置放入光学硬件装置内；其中，加入的nacl溶液的浓度为0.04ppm，nacl溶液与反应溶液的体积比为：1:10~1:30。

s4、最后利用智能设备通过所述光学硬件装置对多通量检测装置内的液体进行拍照，通过智能设备内的浓度计算程序，对图片进行分析，得到各个标准溶液和待测溶液对应的成像区域的rgb值，以及该rgb值在cie1931色品图中对应的波长值，并根据各标准溶液的浓度，和各标准溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值，建立波长浓度曲线，最后将待测溶液对应的成像区域的rgb值在cie1931色品图中对应的波长值与所述波长浓度曲线进行对比，得到各待测溶液中的磺胺类抗生素浓度，并输出到显示单元显示。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。