一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用的制作方法

文档序号:13932764阅读:1045来源:国知局
一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用的制作方法

本发明属于医用生物纳米材料技术领域,具体涉及一种ctdna检测用纳米颗粒耦合探针材料及其制备方法和应用。



背景技术:

肿瘤产生的第一步是基因突变,癌症归根结底是一种基因病。随着癌症研究的不断深入,人们在癌症患者的外周血中检测到与肿瘤细胞一致的突变基因,即循环肿瘤dna(circulatingtumordna,ctdna)。ctdna是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的基因碎片,是癌症散落在血液中的“信息密码”。癌症的分期直接与血液中的ctdna浓度相关,中晚期患者ctdna浓度显著高于早期或者超早期患者。ctdna浓度随肿瘤发生发展而升高,因肿瘤得到控制而降低,是一类高敏感性、高特异性的肿瘤血液标记物。ctdna浓度的变化要远早于影像学等手段检测到肿瘤组织的变化。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比,对ctdna的精准分析能实时监测病人体内肿瘤负荷的动态信息,可更加敏感地发现疾病的变化,更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果,优势显著。最为重要的是,对ctdna的监测只需要抽取患者少量外周血,对患者没有副作用,可实现多次实时高频监测。因此,ctdna的检测及其生物学指标的研究将有可能为临床肿瘤的早期诊断、预后判断及跟踪随访提供一系列方便、快捷、特异、无创的检测手段。ctdna检测是一种新型无创的“液体活检”方式,有望弥补现有临床诊断方法的不足,提供从肿瘤细胞水平到分子水平的分析平台,为个体化治疗提供参考。基于ctdna检测的无创的“液体活检”技术有望取代侵入性的“组织活检”用于肿瘤治疗进展的监测,该领域的基础研究具有非常重要的科学意义和临床价值。

ctdna检测是肿瘤早期筛查的绝佳方式,但是在肿瘤发生的早期、超早期甚至细胞阶段,血液中的ctdna浓度极低(10~180ng.ml-1),如何检测出早期癌症患者血液中极低含量的ctdna是首要技术难点。这对检测方法的灵敏度提出了很高的要求。另外,病人的血清成分异常复杂,ctdna只占血液系统中总核酸中的0.01%-1%,因此要实现ctdna的高灵敏度检测,另一技术难点就是如何避免严重的背景基因干扰。近年来,越来越多的学者致力于ctdna检测的研究。已经报道的检测方法主要是基于两个思路,一是通过聚合酶链式反应(pcr)大幅度扩增ctdna,使之达到可以检出的浓度。包括数字pcr和beaming技术。数字pcr可用于评估和检测血浆中的ctdna的特异性突变,可用于绝对定量,灵敏度可达单个核酸分子,检测限低至0.001%。beaming技术结合数字pcr与流式技术来确定突变情况,灵敏度达到0.005%。另一个现有的检测思路是直接进行全基因组测序或者pcr扩增后再进行测序,包括标记扩增深度测序(tam-seq),癌症个体化深度测序(capp-seq),全基因组测序,全外显子测序等。tam-seq是先利用特异性引物进行循环的目标区域扩增,再利用不同特性的接头标签进行二次扩增,然后进行双向重复测序。capp-seq利用定制化的突变位点库作为“筛选器”,对样本进行靶向捕获后再进行超深度测序,检测灵敏度高,特异性强。

目前国际上对癌症早期ctdna检测的研究正处于起步阶段,基于pcr扩增的检测方法存在的问题是测试结果很大程度上依赖于基因扩增,假阳性几率高,预处理繁琐,依赖于活检提供的基因突变信息,检测设备和试剂完全依赖进口。基于基因测序的检测方法尽管报错率低,但是研发和测试的成本都非常高,检测周期长达一周以上,很难广泛应用于临床检测。总体而言,已有的检测方法因为灵敏度、检测限、检测价格和检测周期等限制还未能在临床医学中大范围推广。大胆探索、努力开发方便、快捷、特异、灵敏的ctdna检测方法一直是研究人员追求的目标。近年来,纳米诊疗医学的建立和发展为癌症等重大医学疾病的早期诊断和原位治疗提供了一个全新的多功能诊治平台,有望大幅度提高癌症早期诊治的效率。纳米材料具有合成可控,形貌结构、表面特征易调控等特点,基于纳米材料的生物传感器借助纳米材料独特的物理、化学等性质能够极大提高生物分子的检测灵敏度,具有选择性高、分析速度快、操作简易和仪器价格低廉等特点,是纳米生物医学研究的一个重要分支,逐步成为生物医学研究领域的一个热点。

综上所述,发展基于纳米生物技术的ctdna纳米检测新策略,研究一种方便、快捷、特异、无创的ctdna纳米检测方法,推进液体活检在肿瘤诊疗领域中的应用,具有重要意义和价值。



技术实现要素:

针对现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种可高灵敏度、特异性识别ctdna的纳米颗粒耦合探针材料体系,以及使用该体系的检测方法。

在此,一方面,本发明提供一种纳米颗粒耦合探针材料体系,所述纳米颗粒耦合探针材料体系由第一探针和第二探针组成,所述第一探针的表达式为mnp@x-dna1,其中mnp为磁性纳米颗粒内核,x为包覆在所述磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层,dna1为修饰在所述亲水性壳层上的能够与目标循环肿瘤dna的第一部分互补的第一互补核酸链,所述第二探针的表达式为rep-dna2,其中rep为能用icp-ms检测的报告元素形成的报告元素内核,dna2为修饰在所述报告元素内核上的能够与目标循环肿瘤dna的第二部分互补的第二互补核酸链。其中,dna1为目标ctdna的一部分的互补链(例如ctdna互补链的一半碱基),dna2为目标ctdna另一部分的互补链(例如ctdna互补链另一半碱基)。后述检测过程中,目标ctdna能够将dna1和dna2连接起来从而将两种纳米颗粒桥连起来。

较佳地,所述mnp由顺磁性纳米颗粒形成,优选由fe3o4和/或非晶态铁形成。

较佳地,所述rep由能用icp-ms灵敏地检测出的重金属元素形成,优选由au、ag、pt中的至少一种形成,icp-ms检测下限低至0.01ppb。

较佳地,所述第一探针通过将磁性纳米颗粒表面包覆亲水性壳层后进行氨基修饰,并与dna1发生缩合反应得到。在一个示例中,可以通过制备粒径30-50nm的磁性纳米颗粒,表面包覆亲水性壳层(例如sio2)进行亲水改性,得到mnp@x(例如mnp@sio2),对mnp@x进行氨基修饰,并利用氨基与捕捉dna1上修饰的羧基发生缩合反应,将捕捉dna1成功修饰在mnp@x表面,制备mnp@x-dna1。

较佳地,所述x为sio2和/或亲水性有机物。x为sio2的情况下,第一探针可以表示为mnp@sio2-dna1。

较佳地,所述第二探针是通过将dna2(含有多个碱基a的dna2)和rep纳米颗粒(例如金纳米颗粒)稳定分散在水溶液中得到。在一个示例中,根据腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(a)对金纳米粒子表现出强的亲和力,能够有效地稳定金纳米颗粒,利用金纳米粒子与腺嘌呤碱基的特殊亲和作用将连接有多个腺嘌呤的引物dna2修饰于金纳米粒子表面制备探针rep-dna2。

另一方面,本发明还提供一种使用上述纳米颗粒耦合探针材料体系的使用方法,包括:用游离dna提取试剂盒提取出待测血清中的dna,分散在无氧水中,加热使双链dna解链为单链dna;加入所述第一探针和第二探针;通过磁性分离得到磁性纳米颗粒表面有报告元素的纳米颗粒和/或磁性纳米颗粒表面没有报告元素的纳米颗粒,具体地,当目标循环肿瘤dna存在时,所述第一探针和所述第二探针通过目标循环肿瘤dna耦合,磁性分离得到磁性纳米颗粒表面有报告元素的纳米颗粒;当目标循环肿瘤dna不存在时,磁性分离得到磁性纳米颗粒表面没有报告元素的纳米颗粒;对报告元素进行定量,并根据目标循环肿瘤dna与报告元素浓度的线性关系,对目标循环肿瘤dna进行定量。本发明的检测目标ctdna包括所有碱基序列已知的癌基因,包括突变的kras,nras,braf,egfr,pik3ca等。

本发明的使用方法中,将突变的ctdna基因的互补碱基序列分为两段引物dna1,dna2制备,然后在mnp@x磁性纳米颗粒表面修饰捕捉dna1,制备磁性探针mnp@x-dna1,rep颗粒(例如au纳米颗粒)表面修饰捕捉dna2,制备探针rep-dna2。当目标ctdna存在时,ctdna与两段引物链(dna1、dna2)互补配对,ctdna把mnp@x纳米颗粒和rep纳米颗粒连接在一起,通过磁性分离,mnp@x表面有rep纳米颗粒;当无目标ctdna存在时,磁性分离得到的mnp@x表面无rep纳米颗粒。结合洛伦兹透射电镜技术,肉眼观察即可直接判断是否存在目标ctdna。通过icp-ms检测体系中的报告元素(rep元素)的含量,根据标准溶液中rep含量与ctdna含量的线性关系,实现对ctdna的准确定量。与现有的ctdna检测技术相比较,本发明具有特殊的优势:双纳米探针(mnp@x-dna1与rep-dna2)的制备简单、可控、易重复;利用优异磁响应特性的磁性纳米颗粒对ctdna进行快速、高效磁性分离与富集,避免繁琐的pcr过程和复杂的基因测序,大大缩短了检测周期。双纳米粒子表面修饰的dna引物与目标ctdna专一性互补配对,可以保证检测的高度特异性;无需采用pcr扩增ctdna,假阳性概率有望大幅降低;mnp@x与rep纳米耦合体系将纳米材料独特的物理和化学性能应用于针对ctdna检测的液体活检技术,有望为癌症的早期诊断提供了一条快速、可靠的新途径,推进液体活检在肿瘤诊疗领域中的应用意义重大。

较佳地,在加入第一探针和第二探针前加入磁性掩蔽剂。由此,可以通过磁性分离去除野生型基因(野生型ctdna;例如野生型kras基因)。对于实际癌症病人血液样本,除了突变型ctdna(目标ctdna),还存在大量野生型ctdna,为了掩蔽野生型ctdna对检测的干扰,需要制备掩蔽dna修饰的磁性纳米颗粒,检测之前投入掩蔽dna修饰的磁性纳米颗粒,掩蔽dna与野生型ctdna互补配对,然后磁性分离去除磁性掩蔽剂与野生型ctdna。也就是说,本发明中,可以在加入磁性掩蔽剂并通过磁性分离去除磁性掩蔽剂与野生型ctdna后在检测体系中加入磁性探针mnp@x-dna1和探针rep-dna2进行突变型ctdna的检测。

较佳地,所述磁性掩蔽剂的表达式为mnp@x-dna3,其中mnp为磁性纳米颗粒内核,x为包覆在所述磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层,dna3为修饰在所述亲水性壳层上的能够与野生型循环肿瘤dna互补的核酸链。

较佳地,所述磁性掩蔽剂通过将磁性纳米颗粒表面包覆亲水性壳层后进行氨基修饰,并与掩蔽dna3发生缩合反应得到。在一个示例中,在野生型kras基因的互补序列末端修饰羧基制备掩蔽dna3,通过mnp@x(例如afe@sio2)表面氨基与dna3的羧基发生edc和nhs介导的酰胺化反应将dna3嫁接到mnp@x表面,制备磁性掩蔽剂mnp@x-dna3。

根据本发明的使用方法,双纳米粒子表面修饰的dna引物与目标ctdna专一性互补配对,可以保证检测的高度特异性;无需采用pcr扩增ctdna,假阳性概率有望大幅降低;血清样本分析中,加入磁性掩蔽剂,通过磁分离去除野生型游离核酸,避免背景核酸对ctdna检测的干扰,有望实现零背景下的高灵敏度检测,有望克服现有的ctdna检测技术面临的浓度低,背景干扰严重的两大难题,发展基于纳米生物技术的ctdna纳米检测新策略。

附图说明

图1为本发明实施例1所制得的afe纳米颗粒分散于水中的透射电镜(tem)照片;

图2为本发明实施例1所制得的afe纳米颗粒的xrd图谱;

图3为本发明实施例1所制得的afe纳米颗粒的能谱(eds)图;

图4为本发明实施例1所制得的afe纳米颗粒包覆sio2壳层的透射电镜(tem)照片;

图5为本发明实施例1所制得的afe纳米颗粒分散在水中以后,在外加磁场下磁性分离效果图(左图为实物照片,右图为被磁铁吸引的铁元素的质量百分含量);

图6为本发明实施例1所制得的au颗粒分散于水中的透射电镜(tem)照片;

图7为本发明实施例1所制得的au颗粒与au-dna2的紫外可见吸收光谱图;

图8为用afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系检测一系列浓度梯度的ctdna标准溶液时,磁性分离产物的tem照片;

图9为用afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系检测一系列浓度梯度的ctdna标准溶液时,au浓度与ctdna浓度的线性关系;

图10为用afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系分离出突变kras基因(135t)的esi-tof-ms图;

图11为针对kras基因设计制备的afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对于其他ctdna(nras,braf,egfr,pik3ca)的检出率评价;

图12为针对kras基因设计制备的afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对于不同癌症细胞系中突变kras基因的检测性能评价;

图13为afe@sio2-dna1,au-dna2探针体系对于不同长度突变kras基因片段的检出率评价;

图14为afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系在人血样本中捕捉到的ctdna片段的esi-tof-ms谱图;

图15为afe-dna1与au-dna2探针体系对于荷瘤小鼠ctdna的检测性能评价(a为未经处理荷瘤小鼠肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线;b为化疗后荷瘤小鼠肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线,c为荷瘤小鼠早期手术治疗后肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线,d为荷瘤小鼠晚期手术治疗后肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线)。

具体实施方式

以下结合附图和下述实施方式进一步说明本发明,应理解,下述实施方式仅用于说明本发明,而非限制本发明。

本发明涉及一种能够高灵敏度、特异性识别循环肿瘤dna(ctdna)的双纳米粒子耦合探针材料体系。耦合探针体系由磁性纳米探针和报告探针组成,其在使用中能够通过ctdna耦合而成。将疏水性磁性纳米颗粒表面包覆亲水性壳层x(sio2和/或其他亲水性有机物)进行亲水改性,进行氨基修饰,并通过氨基与羧基的酰胺化反应将目标ctdna互补的碱基片段dna1引物链修饰到磁性纳米颗粒(magnetitenanoparticle,缩写为mnp)表面,记为探针mnp@x-dna1,mnp包括fe3o4、非晶态铁等顺磁性的纳米颗粒;将目标ctdna互补的碱基片段dna2修饰于报告元素的纳米颗粒表面制备reporter-dna2(简写为rep-dna2),报告元素指能用icp-ms检测的元素,例如具有极低检测下限的重金属元素,包括au,ag和pt等。mnp@x-dna1和rep-dna2组成的纳米颗粒耦合探针材料体系用于ctdna的定量检测具有极高的灵敏度高和极低的检测下限,对发展基于纳米生物技术的ctdna纳米检测新策略,推进基于ctdna检测的液体活检技术在癌症早期诊断中的应用具有重要的意义。

以下,具体说明本发明的纳米颗粒耦合探针材料、纳米颗粒耦合探针材料体系的制备方法和使用该体系的检测方法。本发明的检测目标ctdna是与肿瘤的发生密切相关,并且突变序列(碱基序列)已知的癌基因,例如表皮生长因子受体(egfr)通路下游关键基因kras、braf、pik3ca、nras等突变状态。

本发明中,将突变的ctdna基因的互补碱基序列分为两段引物dna1,dna2制备,在磁性纳米颗粒表面修饰捕捉dna1,制备磁性探针(第一探针),rep颗粒表面修饰捕捉dna2,制备报告探针rep-dna2(第二探针)。

(磁性纳米探针)

本发明的磁性纳米探针是功能性dna1修饰的磁性纳米探针,表达式为mnp@x-dna1,其中mnp为磁性纳米颗粒,优选顺磁性纳米颗粒,更优选非晶态铁纳米颗粒,x为亲水性壳层,优选sio2和/或亲水性有机物,亲水性有机物包括聚乙烯吡咯烷酮(pvp)等,dna1为目标ctdna的部分互补核酸链。具体而言,dna1为目标ctdna互补链的一半碱基,后述报告探针中的dna2为目标ctdna互补链的另一半碱基。后述检测过程中,目标ctdna存在的情况下,目标ctdna将dna1和dna2互补配对,将两种纳米颗粒桥连起来。

关于制备磁性纳米探针,首先,制备磁性纳米颗粒,本发明的磁性纳米颗粒可采用市售或自制。

作为一个示例,mnp为非晶态铁的情况下,磁性纳米颗粒的制备例如可以包括:按照(1~1.5):(16~18):(0.5~1)的摩尔比将铁源柠檬酸铁铵,有机物聚乙烯吡咯烷酮(pvp,平均分子量55000),表面活性剂f127(平均分子量9000)溶解在适量无氧水中,氩气氛围下升温至80-100℃,机械搅拌除去反应体系中的氧气;按照柠檬酸铁铵:还原剂摩尔比(1~1.5):(20~30)的比例将还原剂(nabh4)溶解于水中,缓慢滴加入到反应体系中产生大量气泡;3~4小时后加入乙醇去除气泡,磁性分离,收集的非晶铁纳米颗粒(afe纳米颗粒)。本发明的磁性纳米颗粒粒径范围为30-50nm。

接着,对磁性纳米颗粒进行亲水改性。具体地,可以在磁性纳米颗粒表面包覆sio2和/或者其他亲水性有机物等。在磁性纳米颗粒表面包覆sio2的情况下,可以利用碱性条件下正硅酸乙酯(teos)的水解反应(方法),在磁性纳米颗粒表面包覆sio2壳层,改善纳米颗粒的稳定性,在水中的分散性和生物相容性。

作为一个示例,使用sio2进行非晶铁纳米颗粒的亲水改性例如可以包括:适量afe加入到在乙醇、水和氨水的混合溶液(ph值为7.8-8)中,超声分散一段时间后,滴加入适量正硅酸乙酯(teos),室温机械搅拌,磁性分离,得到固体产物即sio2包覆的非晶铁纳米颗粒(afe@sio2)。其中afe与正硅酸乙酯的摩尔比可以为1~1.8。本发明中,亲水性壳层厚度为5~10nm。本发明的mnp@x具备高效的磁响应性和良好的生物相容性。具体而言,高效的磁响应性能来源于内核(例如非晶铁),良好的生物相容性来源于纳米颗粒表面亲水性壳层(例如sio2)的包覆。

接着在经过亲水改性的磁性纳米颗(核壳结构mnp@x)表面修饰dna1。本发明中,在mnp@x表面进行氨基修饰,利用氨基与捕捉dna1上修饰的羧基发生缩合反应,将捕捉dna1成功修饰在mnp@x表面。在磁性纳米颗粒表面包覆sio2的情况下,可以将sio2壳层的硅羟基与3-氨基丙基三乙氧基硅烷(aptes)进行硅烷化反应,在afe@sio2表面修饰氨基,通过氨基与羧基的酰胺化反应将目标ctdna互补的碱基片段dna1引物链修饰到mnp@x表面。

作为一个示例,mnp@x表面修饰dna1例如可以包括:将适量(例如50mg)mnp@x(例如afe@sio2)分散在(例如100ml的)乙醇中,机械搅拌下加热至78~85℃,加入(例如100μl的)aptes,回流搅拌一段时间后,离心,固体产物用水洗;按照(3~5):(10~15):(20~25)的摩尔比将dna1、edc、nhs加入到(例如ph=7.4的)pbs水溶液中,室温搅拌使dna1上的羧基全部活化,加入适量mnp@x-nh2的pbs溶液,搅拌,磁性分离得到磁性纳米探针mnp@x-dna1。

(报告探针)

本发明的报告探针是功能性dna2修饰的报告探针,表达式为rep-dna2,其中rep为报告元素,dna2为目标循环肿瘤dna的部分互补核酸链。本发明中,报告元素指能用icp-ms检测,且具有极低检测下限的重金属元素,包括au,ag和pt等。

本发明中,通过将目标ctdna互补的碱基片段dna2修饰于报告元素的纳米颗粒表面制备报告探针。具体地,制备报告探针可以包括:将5~10nm的rep纳米颗粒(例如au纳米颗粒)与dna2按(1~1.5):(40~80)的比例混合,加入适量柠檬酸盐缓冲剂,用移液枪轻轻吹打,使得rep纳米颗粒与dna2混合均匀,加入去离子水,离心分离,得到rep-dna2。作为一个示例,采用au作为报告元素的情况下,根据腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(a)对金纳米粒子表现出强的亲和力,能够有效地稳定金纳米颗粒,利用金纳米粒子与腺嘌呤碱基的特殊亲和作用将连接有多个腺嘌呤的引物dna2修饰于金纳米粒子表面制备探针au-dna2。

(ctdna检测)

本发明中,可以利用磁性纳米探针和报告探针形成纳米颗粒耦合探针材料体系,用于ctdna检测。

首先,用游离dna提取试剂盒提取出待测血清中的dna,分散在无氧水中,加热使双链dna解链为单链dna。

接着,在检测体系中加入磁性纳米探针和报告探针进行突变型ctdna的检测。

本发明中,可以在加入磁性纳米探针和报告探针前加入磁性掩蔽剂。对于实际癌症病人血液样本,除了突变型ctdna,还存在大量野生型ctdna,为了掩蔽野生型ctdna对检测的干扰,需要制备掩蔽dna修饰的磁性纳米颗粒,可以在检测之前投入掩蔽dna修饰的磁性纳米颗粒,掩蔽dna与野生型ctdna互补配对,然后通过磁性分离去除磁性掩蔽剂与野生型ctdna,由此,可以完全掩蔽野生型基因对突变基因检测的干扰。

本发明的磁性掩蔽剂的表达式为mnp@x-dna3,其中mnp为磁性纳米颗粒,x为亲水性壳层,优选sio2和/或亲水性有机物,dna3为野生型目标ctdna的互补核酸链。

关于所述磁性掩蔽剂的制备,可通过将野生型基因的互补核酸链dna3修饰在磁性纳米颗粒表面,制备磁性掩蔽剂mnp@x-dna3。在一个示例中,例如在野生型ctdna的互补序列末端修饰羧基制备掩蔽dna3,通过mnp@x表面氨基与dna3的羧基发生edc和nhs介导的酰胺化反应将dna3嫁接到mnp@x表面,制备磁性掩蔽剂mnp@x-dna3。

接着,待突变型ctdna与加入检测体系中的磁性纳米探针和报告探针杂交后,进行磁性分离。本发明中,当目标ctdna存在时,磁性纳米探针和报告探针通过ctdna耦合,磁分离得到磁性纳米颗粒表面有报告元素的纳米颗粒,当目标ctdna不存在时,磁分离得到磁性纳米颗粒表面没有报告元素的纳米颗粒。结合洛伦兹透射电镜技术,肉眼观察即可直接判断是否存在目标ctdna。

接着,对报告元素进行定量,报告元素的浓度可用icp绝对定量。本发明中,由于掩蔽dna与野生型基因互补配对后磁性掩蔽剂与野生型ctdna在磁性分离中被去除,可以完全掩蔽野生型基因对突变基因检测的干扰,报告元素浓度与ctdna的浓度符合线性关系,通过icp-ms检测体系中的au元素含量,根据标准溶液中au含量与ctdna含量的线性关系,能够实现对ctdna的准确定量。

本发明的优点:

本发明的双纳米探针(mnp@x-dna1与rep-dna2)的制备简单、可控、易重复;利用优异磁响应特性的磁性纳米颗粒对ctdna进行快速、高效磁性分离与富集,避免繁琐的pcr过程和复杂的基因测序,大大缩短了检测周期;

双纳米粒子表面修饰的dna引物与目标ctdna专一性互补配对,可以保证检测的高度特异性;

无需采用pcr扩增ctdna,假阳性概率有望大幅降低;

血清样本分析中,加入磁性掩蔽剂,通过磁分离去除野生型游离核酸,能够避免背景核酸对ctdna检测的干扰,有望实现零背景下的高灵敏度检测,有望克服现有的ctdna检测技术面临的浓度低,背景干扰严重的两大难题,发展基于纳米生物技术的ctdna纳米检测新策略;

mnp@x与rep纳米耦合体系将纳米材料独特的物理和化学性能应用于针对ctdna检测的液体活检技术,有望为癌症的早期诊断提供了一条快速、可靠的新途径,推进液体活检在肿瘤诊疗领域中的应用意义重大。本发明提出的ctdna新型纳米检测方法对于临床或临床转化医学中基于ctdna检测的液体活检技术在肿瘤早期检测与肿瘤负荷评估中的应用而言意义重大。

下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解,以下实施例只用于对本发明进行进一步说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例,即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择,而并非要限定于下文示例的具体数值。

实施例1

一.afe@sio2-dna1,au-dna2探针的制备。

1.制备非晶铁(afe)纳米颗粒:分别称取0.36mmol(175mg)柠檬酸铁铵,9mmolpvp(averagemw=55000)和f127(1.0g)溶解在40ml无氧水中,氩气氛围下升温至70℃,机械搅拌(转速600rpm)60min,除去反应体系中的氧气。7.5mmol(283g)nabh4溶解在6ml的水中,缓慢(0.1ml/min)滴加入到反应体系中产生大量气泡。4小时后,加入5ml乙醇去除气泡,磁性分离,收集的非晶铁纳米颗粒用乙醇进行超声洗涤三遍,分散在乙醇中保存。

图1为本实施例所制得的非晶铁(afe)纳米颗粒分散在水中的tem图谱,由图1可见:所制得的纳米颗粒为球形,分散性好,粒径范围在30-50nm。

图2为本实施例所制得的非晶铁(afe)纳米颗粒的xrd图谱,由图2可见,所制得的纳米颗粒为非晶态。

图3为本发明实施例1所制得的afe纳米颗粒的能谱(eds)图,由图3可见,所制得的纳米颗粒主要成分为单质铁。

2.制备sio2包覆的非晶铁纳米颗粒(afe@sio2):50mgafe加入到在乙醇(14ml)、水(6ml)和氨水(0.2ml)的混合溶液中。超声分散30min后,滴加入0.2ml(0.1ml/min)正硅酸乙酯(teos),室温机械搅拌8h后,磁性分离,固体产物依次用乙醇洗三遍,水洗三遍,冷冻干燥后待用。

图4为本实施例所制得的afe@sio2分散在水中的tem图谱,由图3可见sio2壳层成功包裹,壳层厚度约10nm,核壳结构清晰可见,纳米颗粒分散性好,粒径范围在50-80nm。

图5为本发明实施例1所制得的afe@sio2纳米颗粒分散在水中以后,在外加磁场下磁性分离效果图,由图5可见2.5分钟磁分离效率达78%,15分钟后100%磁分离,证明afe@sio2纳米颗粒具有优异的磁响应性能。

3.afe@sio2表面修饰dna1:首先将纳米颗粒的sio2壳层氨基化。将50mgafe@sio2分散在100ml乙醇中,机械搅拌下加热至80℃,加入100μlaptes。回流搅拌4小时后,离心,固体产物用水洗三遍。dna1(35μmol),edc(0.1mmol)andnhs(0.2mmol)加入到ph=7.4的pbs水溶液中。室温搅拌15分钟后,dna1上的羧基已经全部活化,加入4mlafe@sio2-nh2(20mg)的pbs溶液,搅拌12h后,磁性分离得到固体afe@sio2-dna1用水洗三次,最后分散在ph=7.4的水中待用。

4.au-dna2探针的制备:au纳米颗粒(~5nm)与dna2按一定比例(摩尔比aunps/dna2=1:50)混合,加入20μl柠檬酸盐缓冲剂,用移液枪轻轻吹打,使得au纳米颗粒与dna2混合均匀。加入去离子水,调节au-dna2的最终浓度为10mm。离心分离,固体产物用水洗涤3次,得到产物au-dna2探针分散在高纯水中待用。

图6为本发明实施例1所制得的au颗粒分散在水中的tem图谱,由图6可见:所制得的纳米颗粒为球形,分散性好,粒径范围在5-10nm。

图7为本发明实施例1所制得的au颗粒与au-dna2的紫外可见吸收光谱图,修饰dna2后紫外可见吸收光谱的变化证明dna2成功修饰于au颗粒表面。

二、标准溶液中突变kras基因的检测实验:

1.绘制标准曲线:配制一系列浓度梯度(0.1pg/ml-10ng/ml)的突变kras基因的pbs溶液,各取1ml加入到1.5ml的无菌离心管中,分别加入5μl的afe@sio2-dna1(0.2mg/ml)和5μlau-dna2(0.2mg/ml)的pbs溶液,置于摇床中37℃下反应30分钟。后进行磁性分离,分离出的磁性纳米颗粒用去离子水洗三遍,最后重新分散在2ml高纯水中。用洛伦兹透射电镜观察,若非晶铁纳米颗粒表面有金纳米颗粒,说明存在目标ctdna。进一步对ctdna进行定量分析研究。用icp-ms分别测试每组磁分离出的afe@sio2-ctdna-au的水溶液中的au含量。制定au元素含量随kras基因浓度变化的标准曲线。

图8为用afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系检测一系列浓度梯度(0.3ng/ml(上排左图),0.12ng/ml(上排右图),0.06ng/ml(下排左图),0ng/ml(下排右图))的ctdna标准溶液时,磁性分离产物的tem照片。

图9为用afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系检测一系列浓度梯度的ctdna标准溶液时,au浓度与ctdna浓度的线性关系。图9说明标准溶液突变kras基因的检测实验中,报告元素au浓度与kras基因的浓度符合线性关系:y=209.07x,(r2=0.997,y:au浓度,x:kras基因的浓度)。

2.突变kras的提取与分子量检测实验:将磁性分离得到的afe@sio2-ctdna-au耦合体系加热至95℃使双链dna解链为单链dna,耦合体系解离,磁分离除去afe@sio2-dna1,加入1mlnacl(50mm)溶液,待au-dna2团聚沉降之后离心分离除去。最后溶液中仅剩检测目标突变kras基因。采用esi-tof-ms,测定其分子量。使用飞行质谱仪配套的系统核酸样本预处理试剂盒片段化核酸点靶,将微量液体布点于飞行质谱仪的靶上,运行质谱检测,收集数据分析。

图10为afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系分离出突变kras基因(135t)的esi-tof-ms图。135t基因片段的理论分子量为5930.9,检测出的分子量为5930.0,测试值与理论值一致。

3.afe@sio2-dna1与au-dna2探针检测体系的选择性评估实验:采用上述同样的检测方法,测试其他4种基因(nras,braf,egfr,pik3ca)的存在对检测结果的影响,评估该纳米检测方法的选择性。选取u87等六种典型的肿瘤细胞系,用动物细胞dna提取试剂盒提取各种肿瘤细胞系基因组dna,并对dna进行纯化。采用上述同样的检测方法检测六种不同肿瘤细胞系基因组dna的突变kras基因。

图11为针对kras基因设计制备的afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对于其他ctdna(nras,braf,egfr,pik3ca)的检出率评价。nras,braf,egfr,pik3ca等基因的存在对kras基因的检测不存在干扰,说明针对kras基因设计制备的afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对kras基因有很好的选择性。

图12为针对kras基因设计制备的afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对于不同癌症细胞系中突变kras基因的检测性能评价。afe@sio2-dna1与au-dna2探针检测体系对于存在突变kras基因的a2780,lovo,a549细胞系均检测出了阳性结果。

4.afe@sio2-dna1与au-dna2探针检测体系对于不同长度突变kras基因片段检测性能评估实验:合成一系列不同长度的突变kras基因134a的单链dna片段(19bp,30bp,60bp,70bp,80bp,100bp,150bp)。用针对134a设计的afe@sio2-dna1与au-dna2探针检测体系评估不同长度的kras片段的检出性能,同时与经典的ddpcr测试手段进行比较。

图13中的检测结果显示,双纳米探针耦合检测体系对于碱基长度在19-150bp的基因都能100%检出。而ddpcr测试方法对于60bp的基因片段只有30%的检出率,少于30bp的短片段ddpcr方法几乎不能测出阳性结果。这说明双纳米探针耦合检测体系可以避免短片段ctdna的漏检。

三、血清样本中kras基因的检测实验

1、制备磁性掩蔽剂:在野生型kras基因的互补序列末端修饰羧基制备掩蔽dna3,通过afe@sio2表面氨基与dna3的羧基发生edc和nhs介导的酰胺化反应,将dna3嫁接到afe@sio2表面,制备磁性掩蔽剂afe@sio2-dna3。

2、肺腺癌患者血清样本kras基因检测:随机选取不同分期(i,ii,iii,iv)肺腺癌患者的血清样本共23例进行研究。将患者的新鲜血液装在抗凝血的无菌离心管中,离心,取上层血清。用游离dna提取试剂盒提取出血清样本中的全部dna,分散在无氧水中,加热使双链dna解链为单链dna。加入野生型kras基因对应的磁性掩蔽剂与之杂交,磁性分离去除野生型kras基因。向剩余溶液中加入afe@sio2-dna1和au-dna2,待突变kras基因与之杂交之后进行磁性分离,得到的afe@sio2-ctdna-au耦合体系重新分散在水中,用icp-ms准确测定au元素的含量,根据au元素含量随kras基因浓度变化的标准曲线定量推算kras基因的浓度。根据检测结果得到ctdna的浓度与癌症分期的关系。特别关注无症状i期肺癌血清kras基因的检出率。

表1为afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对于23例病人血液中突变kras基因的检测结果。表1显示,双纳米探针耦合体系对于i期血样的阳性检出率为72.7%,ii,iii,iv期血样的阳性检出率为100%。与ddpcr检测结果比较,血液样本四,ddpcr未检测出阳性结果,而双纳米探针耦合体系检测出了阳性结果。进一步用esi-tof-ms检测分离出kras片段的分子量,图14证明了突变kras基因134a的存在,排除了假阳性的可能。

表1:afe@sio2-dna1与au-dna2探针体系对于23例病人血液中突变kras基因的检测性能评价

a肿瘤组织dna突变状态通过数字pcr和纳米颗粒耦合方法检测;

b报告元素的浓度通过icp-ms检测;

c通过报告元素的浓度与突变kras基因浓度的线性关系(y=209.07x,x:突变kras基因的浓度,y:报告元素的浓度),由icp-ms检测出的报告元素的浓度计算出突变kras基因的浓度。

综上所述,双纳米探针耦合检测体系避免了繁琐的生物扩增过程,合理设计的磁性掩蔽剂消除了野生型游离核酸的干扰,实现了零背景下的快速、特异、高灵敏度检测。

3、荷瘤小鼠血清中的kras基因水平实时跟踪监测:取人肺腺癌细胞(a549)种于裸鼠皮下(balb/c裸雌鼠,平均体重20g),待肿瘤最长直径生长至约5-6mm时开始试验,每隔一定时间取裸鼠眼缘静脉血检测。将荷瘤小鼠的静脉血置于抗凝血的离心管中,离心,取血清。用游离dna提取试剂盒提取出血清样本中的全部dna,加热使双链dna解链为单链dna。加入野生型kras基因对应的磁性掩蔽剂与之杂交,磁性分离去除野生型kras基因。向剩余溶液中加入afe@sio2-dna1和au-dna2,待突变kras基因与之杂交之后进行磁性分离,得到的afe@sio2-ctdna-au耦合体系重新分散在水中。用icp-ms准确测定au元素的含量,根据au元素含量随kras基因浓度变化的标准曲线定量推算kras基因的浓度。根据检测结果得出肿瘤释放到循环血液中的kras基因浓度随着肿瘤发展呈现的变化规律。荷瘤小鼠瘤内注射顺铂溶液,实时监测化疗之后一定时间点血液中kras基因浓度的变化。对小鼠进行肿瘤摘除手术,实时监测手术之后一定时间点血液中kras基因浓度的变化。

图15为afe-dna1与au-dna2探针体系对于荷瘤小鼠ctdna的检测性能评价。(a为未经处理荷瘤小鼠肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线;b为化疗后荷瘤小鼠肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线,c为荷瘤小鼠早期手术治疗后肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线,d为荷瘤小鼠晚期手术治疗后肿瘤体积与ctdna浓度的变化曲线)图15显示,ctdna浓度与肿瘤体积的增长趋势一致。注射顺铂药物化疗以后,ctdna浓度呈现下降趋势,但是七天后ctdna浓度又开始回升。实验第七天,实施肿瘤切除手术,术后ctdna浓度显著下降,49天后仍无增加。实验第21天实施肿瘤切除手术,术后ctdna浓度也显著下降,但是一周后ctdna浓度又开始升高。这说明双纳米探针耦合体系可以用于对肿瘤负荷的实时监测,为后续临床研究提供实验依据。

综上所述,可见,本发明提供了一种便捷、经济、超灵敏的ctdna纳米检测新方法,可以实现癌症病人血液样本中ctdna的高灵敏度特异性识别。这对发展基于纳米生物技术的ctdna纳米检测新策略,推进基于ctdna检测的液体活检技术在癌症早期诊断中的应用具有重要的意义。

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