本发明涉及一种检测方法，尤其是一种饲料中黄曲霉毒素等16种真菌毒素的测定，液相色谱-串联质谱法，属于饲料及饲料原料检测领域。
背景技术：
真菌毒素是真菌在适宜条件下产生的有毒次级代谢产物，能够引发人类、动物各种急、慢性疾病。主要威胁人类健康的真菌毒素种类有单端孢霉烯族类毒素、伏马类毒素、赭曲霉类毒素、黄曲霉类毒素等。目前，大部分的国家和地区都制定了严格的真菌毒素限量标准，我国也高度重视霉菌毒素污染问题，在2015年新修订的《食品安全法》中，首次将生物毒素明确列入重点关注的污染物质中。我国也已经制定了呕吐毒素(don)、玉米赤霉烯酮(zen)、黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素(ota)四种真菌毒素限量标准，新的毒素限量也在逐步制定完善中。由于异常气候和病虫害等原因，近年来粮食真菌毒素污染多发易发，危害严重损失巨大。据报道，我国每年有3100万吨饲料及饲料原料在生产、储存、运输过程中被真菌污染，约占饲料及饲料原料年总产量的6.2％。为了保证我国饲料及饲料原料质量安全，避免不必要的经济损失，及时快速监测调查真菌毒素污染种类、水平及其风险尤为重要。
由于真菌毒素种类多样，且存在协同污染，为确保全面、快速的了解粮食中真菌毒素的污染情况，迫切需要一种简单、快速、灵敏、同时准确测定饲料及饲料原料中多种真菌毒素的方法。目前真菌毒素的检测方法主要有薄层色谱法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法。薄层色谱法程序复杂、可重复性和再现性差、基于抗原抗体相互作用的酶联免疫吸附法虽有较高的选择性，但无法准确定量，且易受基质干扰，产生假阳性。高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法主要使用固相萃取小柱、mcosep净化柱或者免疫亲和柱对样品进行净化，虽然能够去除提取液中的色素、脂类、蛋白等杂质，降低基质对毒素离子化效率的影响，但是净化过程繁杂耗时，净化成本高，对操作人员要求高，且由于真菌毒素的化学性质不同、极性范围广，会造成某些真菌毒素的损失，影响定量结果的准确性。
随着液相色谱-质谱的升级改进，仪器灵敏度大幅提高，可通过样品直接稀释进样方式进行检测，有效避免了净化过程中目标物的损失，减少对净化材料的依赖，降低检测成本，提高样品前处理效率，实现多组分快速同时检测。但是液相色谱-质谱法的离子化过程易受基质干扰会产生基质效应，影响毒素的精确定量。全碳标记的稳定同位素内标与目标毒素分子量不同，但结构、化学性质完全相同，色谱保留时间也与目标毒素相同，同时又不存在于自然界。因此使用全碳标记的稳定同位素内标定量能够有效的补偿每个真菌毒素的基质效应，保证液质分析结果的准确性和稳定性。本方法的研究有助于提高饲料及饲料原料样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。本方法对后续标准制定，以及饲料及饲料原料污染黄曲霉毒素的相关科研、标准制定起到较好的指导、参考、促进作用。
因此，研究开发一种饲料中黄曲霉毒素等16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法，对于发展绿色畜牧业、保证人类的身体健康，促进养殖业健康可持续发展，具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种16种真菌毒素的检测方法，该方法能简便、快速、准确地同时定性定量检测饲料及饲料原料中16种真菌毒素，提高饲料及饲料原料样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。
本发明的技术方案为：一种16种真菌毒素的检测方法，其步骤：(1)提取：准确称取精确到0.01g的样品5g于50ml离心管中，加入20ml乙腈-水-乙酸混合液的提取液，混合液三种液体体积比70:29:1，涡旋或振荡提取30min，然后以6000r/min离心10min，吸取0.5ml上清液于1.5ml离心管中，加入0.5ml水并涡旋混匀，在4℃下以12000r/min离心10min，上清液过0.2μm的聚四氟乙烯滤膜，收集得样品滤液a；(2)加入稳定同位素：分别准确吸取180ul滤液a和16种真菌毒素混合标准溶液于不同的400ul内插管中，加入20ul14种真菌毒素稳定同位素混合工作液涡旋混匀后，得到含有14种真菌毒素稳定同位素内标的16种真菌毒素混合标准溶液和含有14种真菌毒素稳定同位素内标的样品待测液；
16种真菌毒素混合标准溶液见表一；
14种真菌毒素稳定同位素混合工作液见表二；
表一16种真菌毒素混合标准溶液
表二14种真菌毒素稳定同位素混合工作液浓度
(3)将上步中得到的含有14种真菌毒素稳定同位素内标的16种真菌毒素混合标准溶液和含有14种真菌毒素稳定同位素内标的样品待测液依次注入液相色谱-串联质谱系统，进行检测，即得到最终结果。
所述16种真菌毒素的检测方法采用液相色谱-串联质谱法能同时测定饲料及饲料原料中黄曲霉毒素b1/b2/g1/g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a、伏马毒素b1/b2、t-2/ht-2、杂色曲霉毒素16种真菌毒素。
所述16种真菌毒素的检测方法采用液相色谱-串联质谱法能同时定性定量测定饲料及饲料原料中黄曲霉毒素b1/b2/g1/g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪腐镰刀菌烯醇、脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素a、伏马毒素b1/b2、t-2/ht-2、杂色曲霉毒素16种真菌毒素；
定性方法：用液相色谱-质谱条件测定样品，如果检测的色谱峰保留时间与标准品一致，允许偏差小于±2.5％；定性离子与定量离子的相对丰度与浓度相当的标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表三规定，则可判断样品中存在被测物；
表三定性确证相对离子丰度的最大允许偏差
定量测定：用液相色谱-质谱条件测定样品，将配制含有同位素内标的标准系列工作溶液按浓度从低到高依次注入液相色谱-串联质谱联用仪，待仪器条件稳定后,以目标物质和内标的浓度比为横坐标设为x轴)，目标物质和内标的峰面积比为纵坐标设为y轴，对各个数值点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式(1)计算：
y＝ax+b…………………………(1)
式中:
y——目标物质/内标的峰面积比；
a——回归曲线的斜率；
x——目标物质/内标的浓度比；
b——回归曲线的截距。
含有14种真菌毒素稳定同位素内标的16种真菌毒素混合标准溶液和含有14种真菌毒素稳定同位素内标的样品待测液的响应值均应在仪器线性响应范围内。
所述16种真菌毒素的检测方法用液相色谱-串联质谱测定，采用内标法定量；16种真菌毒素的质谱条件，见表四
表四16种真菌毒素的质谱条件
注：表中带*为定量离子，对于不同质谱仪器，仪器参数存在差异，测定前将质谱参数优化到最佳。
本发明的优点在于：本发明方法采用液相色谱-串联质谱仪进行检测，仪器灵敏度大幅提高，可通过样品直接稀释进样方式进行检测，有效避免了净化过程中目标物的损失，减少对净化材料的依赖，降低检测成本，提高样品前处理效率，实现多组分快速同时检测。全碳标记的稳定同位素内标与目标毒素分子量不同，但结构、化学性质完全相同，色谱保留时间也与目标毒素相同，同时又不存在于自然界。因此使用全碳标记的稳定同位素内标定量能够有效的补偿每个真菌毒素的基质效应，保证液质分析结果的准确性和稳定性。本方法有助于提高饲料及饲料原料样品检测、监测效率，降低成本，保护环境，保障从业人员健康安全。本方法对后续标准制定，以及饲料及饲料原料污染黄曲霉毒素的相关科研、标准制定起到较好的指导、参考、促进作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受以下实施例所限定。
实施例1
一种饲料中黄曲霉毒素等16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法，考察乙腈/水/乙酸(80:19:1体积比)对16种毒素的提取效率。
实施例2
一种饲料中黄曲霉毒素等16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法，考察乙腈/水/乙酸(70:29:1体积比)对16种毒素的提取效率。
实施例3
一种饲料中黄曲霉毒素等16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法，基质效应指被分析物以外的组分对分析物的离子化效率的影响,主要来源于样品中的内源性组分和样品处理后引入的杂质。在电喷雾离子化模式下，化合物的质谱响应容易受到基质的干扰，影响定量检测。本实验采用毒素在空白基质液中的峰面积与毒素净溶液中峰面积的百分比来评估基质效应。16种毒素在小麦、玉米和稻谷提取液中的基质效应及校正基质效应前后的回收率结果表明黄曲霉毒素等在玉米和稻谷基质中有较强的基质效应，伏马毒素在稻谷基质中有较强的基质效应，影响结果的准确性，需要校正基质效应来保证定量的准确性。
实施例4
一种饲料中黄曲霉毒素等16种真菌毒素的测定液相色谱-串联质谱法，在所有样品和标液中加入稳定同位素，以毒素峰面积与对应毒素内标的峰面积比进行定量，从而弥补真菌毒素的基质效应影响，由于don-3g、15-acdon市面上无相应的稳定同位素出售，因此分别使用与其结构类似，出峰相邻的13c-don，13c-3-acdon作为内标。考虑到直接提取16种真菌毒素的提取率很高，提取回收率基本在80～120％内，同时稳定同位素内标价格昂贵，因此选择在上机进样前加入稳定同位素。相比于样品提取前加入同位素内标，本方法大大减少了稳定同位素的使用量(从160μl降低到了20μl)，节约了检测成本，又能够有效的补偿基质效应的影响，保证检测结果的准确。
实验例1
考察乙腈/水/乙酸(80:19:1体积比)和乙腈/水/乙酸(70:29:1体积比)对16种毒素的提取效率。fb1、fb2在使用乙腈/水/乙酸(80:19:1体积比)提取时，提取效率较低，回收率在60-80％之间，而使用乙腈:水:乙酸(70:29:1)提取液时可以达到80％以上，且其他毒素的回收率也在80％～120％之间，因此选择乙腈:水:乙酸(70:29:1)作为样品提取液。
实验例2
考察稳定同位素和基质效应，基质效应指被分析物以外的组分对分析物的离子化效率的影响,主要来源于样品中的内源性组分和样品处理后引入的杂质。在电喷雾离子化模式下，化合物的质谱响应容易受到基质的干扰，影响定量检测。全碳标记的稳定同位素内标与目标物有相同的结构、化学性质和色谱、质谱行为，因此基质效应也相同，在进样之前加入稳定同位素能够补偿进样体积、esi源的离子化效率、离子传输导致的目标化合物响应的波动，保证了质谱分析结果的准确性和稳定性。本实验采用毒素在空白基质液中的峰面积与毒素净溶液中峰面积的百分比来评估基质效应。16种毒素在小麦、玉米和稻谷提取液中的基质效应及校正基质效应前后的回收率表明黄曲霉毒素等在玉米和稻谷基质中有较强的基质效应，伏马毒素在稻谷基质中有较强的基质效应，影响结果的准确性，需要校正基质效应来保证定量的准确性。因此，在所有样品和标液中加入稳定同位素，以毒素峰面积与对应毒素内标的峰面积比进行定量，从而弥补真菌毒素的基质效应影响，由于don-3g、15-acdon市面上无相应的稳定同位素出售，因此分别使用与其结构类似，出峰相邻的13c-don，13c-3-acdon作为内标。考虑到直接提取16种真菌毒素的提取率很高，提取回收率基本在80～120％内，同时稳定同位素内标价格昂贵，因此选择在上机进样前加入稳定同位素。相比于样品提取前加入同位素内标，本方法大大减少了稳定同位素的使用量(从160μl降低到了20μl)，节约了检测成本，又能够有效的补偿基质效应的影响，保证检测结果的准确。
本方法为定性定量检测，属于饲料检测领域，能简便、快速、准确地同时定性定量检测饲料及饲料原料中16种真菌毒素，对饲料及饲料原料中多种真菌毒素的检测有积极的影响，具有宽广的市场前景。