一种肺癌筛查试剂盒的制作方法

本发明涉及一种肺癌筛查试剂盒。

背景技术：

在恶性肿瘤的发病率及死亡率中，肺癌分别占13.0％和19.4％，居恶性肿瘤第一位。且受中国人口老龄化形势的加剧、吸烟人群的年轻化等因素的影响，肺癌患者的人群基数仍在上升。由于肺癌的异质性，同一治疗手段对肺癌的治疗效果往往是南辕北辙，由此，肺癌领域的临床研究和临床处理，重要的一环是对肺癌进行分类和分期以尽量减少其异质性，提高治疗效率。

目前，根据各型肺癌的分化程度和形态特征，可将肺癌分为小细胞肺癌、腺癌、鳞癌等。其中，鳞癌、腺癌均为高发类型，分别占原发性肺癌的50％、25％，是肺癌防治和研究的重点。鳞癌以中央型肺癌多见，并有向管腔内生长的倾向，常早期造成支气管狭窄，引起肺不张，或阻塞性肺炎。癌组织易变性、坏死，形成空洞或癌性肺脓肿。腺癌多生长在肺边缘小支气管的黏液腺，在周围型肺癌中最为常见。腺癌倾向于管外生长，但也可沿肺泡壁蔓延，常在肺边缘部形成直径2～4cm的肿块。腺癌含有非常多的血管，故局部浸润和血行转移较鳞癌早。易转移至肝、脑和骨，更容易累及胸膜而造成胸水。

与其它恶性肿瘤一样，早发现、早治疗是降低肺癌包括鳞癌和腺癌死亡率的关键。但肺癌在早期并没有什么特殊症状，经常在疾病发展到晚期才表现出肺癌症状，错过了最佳手术时机，即使手术，多数患者仍会死于肺癌复发的侵袭或转移。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。

肺癌发生发展的分子生物学机制至今仍不清楚，探寻有效的肺癌分子生物学检测标志物，不仅对阐明肺癌细胞侵袭和转移的分子机制提供依据，也为肺癌的病理诊断、治疗方案的选择具有重要的理论意义和临床应用价值。

骨硬化蛋白(sclerostin、sost)，是一种c-末端具有ctck结构域的分泌性蛋白，由sost基因进行编码，一般认为是由骨细胞特异性表达，研究表明，sost可结合lrp5/6受体并抑制wnt信号通路，进而发挥抑制成骨细胞分化和骨形成的作用。目前，未见sost在肺癌中表达情况的报道。

技术实现要素：

发明人对肺癌进行了详细研究，发现了sost蛋白可以作为其分子标志物，并且，sost蛋白在肺组织中的表达水平与肺鳞癌、腺癌相关。因此，通过检测肺组织中的sost蛋白表达水平，不仅可以预测待检者患肺癌的风险，而且可以预测其肺癌分型。

据此，本发明提供了一种肺癌筛查试剂盒，以及检测sost蛋白的表达水平的试剂在制备肺癌筛查试剂中的用途。

本发明公开了一种肺癌筛查试剂盒，它包括任选的用于检测sost蛋白表达水平的试剂。

其中，所述试剂是用于检测肺组织中sost蛋白表达水平的试剂。

其中，所述检测sost蛋白表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。

其中，所述检测sost蛋白表达水平的试剂为westernblot或elisa检测方法用试剂。

其中，所述肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。

本发明还提供了检测sost蛋白表达水平的试剂在制备肺癌筛查用试剂中的用途。

其中，所述试剂是用于检测肺组织中sost蛋白表达水平的试剂。

其中，所述检测sost蛋白表达水平的试剂为免疫组化检测方法用试剂。

其中，所述检测sost蛋白表达水平的试剂为westernblot或elisa检测方法用试剂。

其中，所述肺癌为肺腺癌和/或肺鳞癌。

本发明试剂盒通过检测肺异常者的肺部异常部位与正常部位的sost表达水平，可以判断肺异常者的sost表达水平差异，进而判断待检者患肺癌的风险：若sost的表达水平高，则患肺腺癌的风险低、患肺鳞癌的风险高；若sost的表达水平低，两种肺癌类型的患病风险相反，可用于临床肺癌的辅助诊断，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1sost在肺癌组织样本中表达。

图2sost的表达水平，其中，**代表p＜0.01；*代表p＜0.05。

具体实施方式

实施例1检测sost在肺癌的表达水平

一、实验材料

肺癌组织微阵列(hlugs060cd01和hlug-ade050cd-01)购买自上海芯超生物。微阵列含肺癌组织病理切片，其中：

hlugs060cd01组织芯片为肺鳞癌病程芯片：包含正常人肺5例、癌旁/肺鳞癌原发灶(临床1期、2期、3期、4期)各22例、肺鳞癌转移灶3例、肺鳞癌的阴性/阳性淋巴结各4例。

hlug-ade050cd-01组织芯片为肺腺癌病程芯片：包含正常人肺5例、癌旁/肺腺癌原发灶(临床1期、2期、3期、4期)各14例、肺腺癌转移灶4例、阴性淋巴结7例/阳性淋巴结6例。

抗sost多克隆抗体获自proteintechgroup，inc(中国武汉)。

所有其他试剂盒或试剂购买自碧云天生物技术有限公司(中国上海)。

二、sost表达水平的检测

使用免疫组化方法进行检测，具体如下：

1.石蜡切片脱蜡至水：(石蜡切片染色前应置60℃1小时)。

(1)二甲苯i、ii,各10分钟。

(2)梯度酒精：100％，2分钟→95％，2分钟→80％，2分钟→70％2分钟。

(3)蒸馏水洗：5分钟，2次(置于摇床)。

2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3％h2o2，室温10分钟(避光)。

3.蒸馏水洗：5分钟，2次(置于摇床)。

4.抗原修复：高压热修复法：枸橼酸钠缓冲液(10mm，ph6.0)，淹没切片，盖上锅盖，高压锅内煮沸，上汽3分钟后缓慢冷却。

附：抗原修复液(10mmph6.0枸橼酸钠缓冲液)的配制

(1)储备液的配制：

a液：枸橼酸三钠-2h2o29.41g+蒸馏水1000ml

b液：枸橼酸21g+蒸馏水1000ml

(2)工作液的配制：a液82ml+b液18ml+蒸馏水900ml

抗原修复的方法：

5.pbs：5分钟，2次(置于摇床)。

6.正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织

周围的水分(保持组织呈湿润状态),滴加正常兔血清处理，37℃，15分钟。

附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)

按1:20比例,用pbs配制,每张切片需要量按50μl+5μl(10％抛洒量)计算。

7.滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加anti-sost(用pbs按1:200稀释抗体)，4℃冰箱过夜。

8.pbs：5分钟，2次(置于摇床)。

9.滴加生物素化的二抗(用pbs按1:5000稀释二抗)，37℃，40分钟。

10.pbs：5分钟，2次(置于摇床)。

11.滴加三抗(sab复合物)，37℃，40分钟。

12.pbs：5分钟，2次(置于摇床)。

13.dab显色，镜下观察，适时终止(自来水冲终止)。

附：dab的配制

储备液(dab25mg/ml)的配制：dab250mg+pbs10ml，待完全溶解后分装成1ml,100μl,50μl，20μl等，—20℃，冻存。

(2)工作液：dab储备液20μl+pbs1000μl+3％h2o25μl

14.自来水(细水)充分冲洗。

15.苏木素复染，室温，30秒，自来水冲洗。

16.自来水冲洗返蓝，15分钟。

17.梯度酒精脱水：

80％，2分钟→95％，2分钟→100％，2次，5分钟。

18.二甲苯透明：

i，ii(二甲苯)各5分钟

19.封片：加拿大树胶(或中性树胶)封片。

20.显微镜拍照，拍照后对sost免疫组化染色进行半定量分析，其中，

荧光强度为：阴性：0；弱阳性：1；阳性：2；强阳性：3；

阳性百分比为：0％：0；0-25％：1；25％-50％：2；50％-75％：3；75％-100％：4。

半定量评分＝荧光强度x阳性百分比，

半定量得分为0-12。

使用graphpad5.0对各组半定量评分进行统计学分析，p＜0.05为有统计学意义。

二、实验结果

肺癌组织与正常组织对照中sost的表达检测结果见图1-2。

由图1-2可见，正常肺组织中，sost的免疫组化平均得分为8.00±0.58，肺鳞癌组织中，sost的平均得分为11.67±0.33，与正常肺组织相比，表达水平差异具有统计学意义(p<0.01)，sost在肺鳞癌组织中显著升高；肺腺癌组织中，sost的平均得分为3.00±1.73，与正常肺组织相比，表达水平差异具有统计学意义(p<0.05)，sost在肺腺癌组织中显著降低。

可见，与正常肺组织相比，肺腺癌组织的sost表达水平显著降低、肺鳞癌组织的sost表达水平显著升高，说明肺癌与sost表达水平相关。由于正常肺组织的sost水平可反映正常人肺组织的sost水平，因此，对肺部异常者，可分别取异常部位、正常部位组织，比较sost表达水平，进而评价其患肺腺癌、鳞癌的可能性，作为临床肺癌的辅助诊断手段。

综上，本发明试剂盒通过检测sost的表达水平，可以判断肺异常者的肺部异常部位与正常部位的sost表达水平差异，进而筛查待检者患肺癌的风险：若sost的表达水平低，则患肺腺癌的风险高、患肺鳞癌的风险高，反之，结论相反，可用于临床肺癌的辅助诊断，为患者采取相关的治疗措施或者决策提供有效的依据，临床应用前景良好。