使用被供能分散型萃取的解析分析用快速样品制备的制作方法

相关申请

本申请与同时提交的申请序列号为15644938的“用于分析样品制备的仪器”和同时提交的申请序列号为15644950的“解析分析用快速的被供能的分散型固相萃取(spe)”相关。

背景技术：

本发明涉及分析化学，特别涉及分子分析用样品制备。

为了进行任何产品的分子分析(鉴别样品中的一种或多种化合物的任务)，产品的样品必须为这样的形式，即可以通过色谱法、光谱法、质谱法和/或核磁共振仪器容易地分析该样品。

因为这些分析仪器需要基本上纯的分离的分析物，所以必须进行通常被称为“样品制备”的一些中间步骤，以将目标化合物从其中可找到目标化合物的样品基质中分离出来，并准备用于仪器分析。

鉴别样品中的一种或多种化合物的任务呈现出与样品制备相关的非常大量的组的可能性和挑战。“天然出现的”化合物(由植物或动物产生的化合物)的数量是不可测量地大，并且现代的有机和无机合成的能力已经产生象征性地或字面上地相似数量的合成化合物。

人们对于对目标化合物的鉴别或定量测量是非常有兴趣的，这是因为其与工业加工以及对废水、土壤和空气中的污染物的环境测试相关。

即使一小组可识别的代表性样品也会包括食品中的杀虫剂、食品中的其它合成化学品(抗生素、激素、类固醇)、土壤中的合成成分(苯、甲苯、精制烃)、以及在聚碳酸酯瓶和其它塑料食品包装中的日常用品中不期望的成分(例如双酚a(“bpa”))。

一般来说，萃取是样品制备的主要形式；即，通过将样品与所需化合物将从样品萃取至其中的溶剂混合来从样品中提取一种或多种目标化合物，从而其可以通过分析技术来测量。

几代以来(并持续到现在)，以萃取形式的样品制备通过于19世纪发明的熟知的soxhlet法进行。在soxhlet技术中，单独部分的溶剂重复循环通过样品基质直到萃取完成。在soxhlet法具有优势的范围内，只要沸腾的烧瓶被加热并且冷凝器是冷的，即可使得萃取自动继续。

这种萃取方法会花费数小时来完全萃取目标化合物。对于该方法，其它关于易燃溶剂、危险废物和易碎玻璃器皿的安全性的担忧是明显的缺点。

另一种通常已知的萃取方法使用超声处理；即用超声(>20khz)波照射液体样品导致振荡。尽管超声处理具有加速萃取过程的优点，但缺点在于它是劳动密集型的手动方法并且使用大量的溶剂。

近年来，已经使用了分析级微波辅助萃取(mae)。mae使用微波能量来加热与样品接触的溶剂，从而将分析物从样品基质分离至溶剂中。mae的主要优点是快速加热样品溶剂混合物的能力。当使用封闭的加压容器时，可以在加速从样品基质中萃取目标化合物的高温下进行萃取。mae加速萃取过程，但也有其缺点。在微波加热过程中，通常需要极性溶剂以通过偶极子的反转和存在于溶质和溶剂中的带电离子的位移来提供偶极子旋转和离子传导，限制了非极性溶剂的使用。mae使用不提供过滤萃取物手段并且在可释放压力之前必须冷却萃取物的昂贵的高压容器。

在20世纪90年代，开发了用于萃取分析物的自动化设备。这些设备将溶剂萃取并入高温高压下的加压单元中，且被称为“加压流体萃取”(“pfe”)或“加速溶剂萃取”(“ase”)。pfe除了溶剂处于其中溶剂表现出高萃取性的高温下以外，显示与soxhlet萃取相似。该程序首先由dionex(richterde等人，analchem1996,68,1033)开发。一套这样的pfe自动萃取系统(dionexase)是商购可得的。

pfe最初用于土壤、沉积物和动物组织中的环境污染物(epamethod3545，除草剂、杀虫剂、烃类)，但已扩展到在食品、药品和其它生物样品中使用。

pfe提供有效的萃取，但仍然没有克服与制备分析用样品必需的许多步骤相关的主要瓶颈。pfe利用多个组件单元和许多步骤。用样品和其它填充材料紧实地填充单元以消除单元中的任何空隙区域，加强分离，且避免沟流。准备一个分析用单元通常会花费15分钟。在添加溶剂之前，将单元在压力下预加压至高达1500psi并加热至高达200℃。萃取是基于色谱原理来促使热溶剂通过柱。循环时间可长达20分钟，且高压的要求导致成本和维护方面的二次缺点。

较新的pse或ase技术试图解决这些困难中的一些，但是仍然需要紧实地填充这些单元，增加了复杂性和各萃取所需的总体时间。

样品制备虽然已经发展了多年，但仍然存在分子分析的主要瓶颈。因此，尽管soxhlet、超声处理、mae和pfe技术都有其优点，但各方法仍然相对耗时。结果，当需要或期望多个样品以提供必要或期望的信息时，进行任何指定的基于萃取的分子制备步骤所需的时间减少可以在任何指定时间内制备的样品的数量，从而减少在任何指定时间间隔内可得的信息量。在测量在连续过程中是有帮助的或必要的范围内，这表示样品之间或者在可识别异常或麻烦的结果之前的更长的间隙。

总而言之，现有的样品制备技术慢、复杂、低效、需要大量的分离步骤、使用过量的溶剂，难以自动化并且在高液压下操作。

因此，基于萃取的样品制备依然被认为是分析技术的主要瓶颈。

技术实现要素：

在一个方面，本发明是一种用于制备分子分析用分析物的萃取方法，其包括在将萃取溶剂和含有分析物的样品基质放入样品杯中，并搅拌、加热和加压，然后冷却溶剂萃取物之后，收集从样品杯排出的冷却的萃取溶剂萃取物用于分析。

在另一方面，本发明是一种用于制备分子分析用分析物的萃取方法，其包括以下步骤：将萃取溶剂和含有分析物的样品基质放入样品杯中；然后将样品杯中的萃取溶剂和样品基质搅拌、加热和加压，以将分析物从加热的样品基质萃取并进入已加热的萃取溶剂中；然后将已加压加热的萃取溶剂萃取物从样品杯中排出至大气压下，直到排出的萃取溶剂萃取物接近或达到环境温度；收集已冷却的萃取溶剂萃取物用于分析。

在又一方面，本发明是一种基于萃取的样品制备方法，其包括将萃取溶剂和含有分析物的样品基质放入样品杯中的步骤。该方法包括以下步骤：在耐压性反应室中将样品杯、样品基质和萃取溶剂加热，直到产生与升高的温度一起将分析物基本上从样品基质中驱入萃取溶剂中的高于大气压的压力的温度；同时搅拌样品杯中的样品基质和萃取溶剂；和将溶剂萃取物从样品杯放出至大气压下的冷却盘管中，其中冷却盘管具有足以将溶剂萃取物基本上冷却至环境温度或接近环境温度的长度。

在又一方面，本发明是一种用于制备解析分析用样品的萃取方法，其包括以下步骤：将含有一种或多种分析物的样品基质放入样品杯中；将样品杯位于耐压性反应室中；将萃取溶剂分配至样品杯中；将萃取溶剂和样品基质在反应室中的样品杯中分散；将反应室中的样品杯中的样品基质和萃取溶剂加热至分配的萃取溶剂产生高于大气压的压力的温度；将萃取溶剂萃取物从样品杯放出至冷却盘管中，该冷却盘管具有足以将溶剂萃取物的温度在该盘管中降低至环境温度或接近环境温度的长度；和从盘管收集过滤后的溶剂萃取物。

在又一方面，本发明是一种基于萃取的样品制备方法，其包括以下步骤：将萃取溶剂和含有分析物的样品基质放入由耐压性反应室包围的导热性样品杯中，该导热性样品杯具有一个开放的过滤端；将萃取溶剂添加至样品杯的内部和反应室中的样品杯外部的二者中；和加热反应室中的样品杯外部的溶剂以转而加热样品杯、样品基质和萃取溶剂直到产生与升高的温度一起将分析物基本上从样品基质驱入萃取溶剂中的高于大气压的压力的温度；将溶剂萃取物从样品杯放出至大气压下的冷却管中，该冷却管具有足以将溶剂萃取物基本上冷却至环境温度或接近环境温度的长度。

在又一方面，本发明是一种在样品杯中的萃取溶剂和含有分析物的样品基质的已加热加压搅拌的混合物。

基于以下详细描述并结合附图，本发明上述的和其它的目的和优点以及实现本发明的方式将变得更清楚。

附图说明

图1是用于实施本发明的方法的一些组成部分的示意图。

图2是基于实施例1的bnacmr萃取的示例性全扫描色谱图。

图3是根据本发明的实施例1萃取与ase萃取比较的覆盖图。

图4是使用本发明的实施例2聚乙烯crm萃取的样品全扫描色谱图。

具体实施方式

本文使用大量术语来描述该方法。

术语“溶剂”以其熟知的化学意义，例如，“能够溶解另一种物质(溶质)以分子或离子大小的水平形成均匀分散的混合物(溶液)的物质”来使用。形容词“有机”以其熟知的意义使用以除了碳与氧、硫和金属，以及在某些情况下的卤素的某些小分子组合以外“涵盖所有碳的化合物”。参见lewis，hawley’scondensedchemicaldictionary，15thedition，2007，johnwiley&sons。

“样品基质”为待测试分析物的存在的材料和任选的量的材料。

“分析物”为目标的分子化合物。如本文中所用，“分析物”可以包括在单个样品内具有多种分析物的样品。

“溶剂萃取物”为萃取后分析物在溶剂中的溶液。

“样品杯”为样品基质和溶剂的容器。

“收集容器”为在冷却后收集溶剂萃取物的容器。

在第一方面，本发明是用于制备分子分析用样品的萃取方法。在该方法中，将萃取溶剂和样品基质放入样品杯中，并将样品杯位于耐压性加热室中。典型的(但不限于)样品基质包括食品、食品包装和土壤。

如本领域技术人员所认识到的(例如，usepamethod3545)，应当使用如下溶剂系统来萃取样品：该溶剂系统以目标浓度给出目标分析物从样品基质中最佳的、可再生的回收。萃取溶剂的选择取决于目标分析物，并且没有单一的溶剂普遍适用于所有分析物。

用于分子分析的典型的(但不限于)固液萃取溶剂包括水、弱酸、弱碱、丙酮、己烷、2-丙醇、环己烷、二氯甲烷、乙腈、甲醇、及其混合物。

如本文中进一步阐述的，并且不受理论束缚，似乎加热反应室以转而加热样品杯的步骤建立足够的预平衡热梯度以辅助混合和搅拌溶剂和样品。在一些实施方式中，将反应室预加压(已经发现约25psi是足够的)以加强萃取并且可能加强预平衡热梯度及其潜在的益处。

在本发明的方法中，样品基质也可以描述为被松散地填充在样品杯中。虽然术语“松散”同样是相对的，但是在此处以其通常意义用作没有粘结或约束并且免于或解除紧固或附着的任何物(urdang，therandomhousecollegedictionary，randomhouseinc.(1972))。由于样品基质是松散的，因而从顶部、底部或两者添加溶剂有助于将样品基质分散在溶剂中。

也可以使用对样品基质、分析物或溶剂惰性的气体的搅动流使萃取溶剂和样品基质在反应室中的杯中混合。在萃取技术领域熟练的人员将认识到，可以基于已知参数相应地选择气体，并且在某些情况下，压缩空气将是合适的，而在另一些情况下，氮或氢可能是最好的(关注基于氢的易燃特性)，或在某些情况下，稀有气体(如氦、氩)中的一种可能是最好的。

可以使用其它混合技术(例如，磁搅拌器或其它机械装置)，但往往需要更复杂的仪器。

然后将样品基质和溶剂在反应室中的样品杯中加热至蒸发的溶剂产生高于大气压的压力的温度。90℃至180℃的温度是代表性的(美国环境保护局建议对于土壤温度为120℃)，在该温度下，典型的有机萃取溶剂产生50～250磅/平方英寸(psi)的相应压力。在迄今为止的实验中，达到该温度的时间为约90秒，在该时间点萃取基本上完成(理解的是，萃取为平衡过程)。然后使用通过来自溶剂的蒸气产生的压力以将溶剂萃取物从样品杯排出至冷却盘管中，该冷却盘管具有当溶剂萃取物在盘管中时足以将萃取物的温度降低至接近环境温度(例如25℃)的长度。然后将溶剂萃取物从盘管通常收集入收集容器中。在示例性实验中，长度为约10英尺的金属管道倾向于提供约30秒的停留时间，这足以将溶剂萃取物冷却至环境温度或接近环境温度。因此，盘管通常用于节省空间的目的，但盘管的形状是可选的而不是强制性的。

样品基质和萃取溶剂可以以本领域中通常的量添加。例如，以提供约5至10克(g)之间的目标样品基质的方式收集固体基质。萃取溶剂的量将成正比；通常约30～100毫升(ml)。

图1是用于实施本发明的方法步骤的仪器的基本组成部分的示意图。

图1示出了在示意图的环境中的该方法的许多特征。图1示出了由耐压性反应室12包围的导热性的耐压性样品杯10。

在本发明的上下文中，典型的样品杯是导热性材料的圆筒形式。因为样品杯10在反应室12的内部，所以它经受很小的压差或不经受压差，由此可以使其质量最小化以促进热传递。在本实施方式中，已经发现约3.5英寸(8.9cm)长、直径约1.25英寸(3.2cm)、壁厚约0.1英寸(2.54mm)的铝圆筒是合适的。术语“导热性(heatconductive)”或“热传导性(thermallyconductive)”在本文中以熟知的意义用于表示热相对较快地通过其的材料。当然，其反义词是术语“绝热”，其同样熟知为描述热更慢地通过其的材料。在此基础上，鉴于这种传导性是大多数金属和合金的区别特性之一，许多金属和合金特别地用于容器。可选择地，认为许多聚合材料是绝热的，并且在本发明的上下文中通常很少有帮助。许多金属和合金的热导率被公开并广泛传播，并且合适的金属或合金可由本领域技术人员选择而无需过度的实验。

适当的样品杯为在一端具有开放的口部且在相对端或附近具有部分开放的底板(floor)的圆筒。当然，(杯、杯口部或开放端的)形状或位置的小变化在本发明的预期范围之内。部分开放的底板可以支承过滤器或过滤介质，并使得溶剂萃取物从样品杯排出。溶剂可以从样品杯的顶部、通过样品杯的底部或通过以上两者分配至样品杯中。

将萃取溶剂和含有分析物的样品基质(示意性地由横线11示出)的组合保持在使用一个开放的过滤端13的样品杯10中。过滤介质标明为14。

图1还示出任选地可将另外的萃取溶剂添加至反应室12的样品杯10外部(如虚线15所示的)以给样品杯10包上夹套。压力头部密封件46将样品杯10密封在反应室12中。

加热器16将反应室12中的样品杯10外部的溶剂15加热，从而转而加热样品杯10、样品基质11和萃取溶剂直到产生与升高的温度一起将分析物基本上从样品基质驱入萃取溶剂中的高于大气压的压力的温度。

然后通过在开放端(例如，使用阀21)将反应室打开至大气压来放出溶剂萃取物，使得溶剂萃取物可以行进至冷却管17，冷却管17具有足以将溶剂萃取物冷却至环境温度或接近环境温度的长度，从而可以收集冷却的溶剂萃取物以准备用于分析，例如收集在收集容器20中。

在进行分子分析用样品的制备时，将样品基质放入样品杯10中，然后将样品杯放入热传导性反应室12中。来自供给部22的溶剂通过阀33、相关的通路24、47和25、以及分配器头26输送至样品杯10(并且因此被输送至样品基质)。可以由注射泵27、旋转阀30和阀33输送液体基质样品。此外，可以使用阀33、管线28、阀21和管线31将溶剂添加至反应室12的底部。

图1还示出了气体搅拌通过使用由阀21控制的管线31和55将惰性气体从气体供给部37输送至位于样品杯的底部或接近样品杯的底部的位置来进行。如果需要二次搅拌，其可以用诸如超声波发生器43等通常是压电换能器的装置进行。

当将阀21打开至大气压时，排出步骤进行，使得反应室12中已加压的溶剂蒸气将液体溶剂萃取物推出通过通路31、然后通过阀21、然后通过冷却盘管17。冷却盘管通过收集管57与收集容器20连接。

再关于图1并完成可能性的描述，溶剂可以从溶剂供给部22经由管线24流至旋转阀30。管线47连接旋转阀30与辅助阀33。管线28将辅助阀33连接至气阀21，该气阀21可以转而使用管线31将溶剂输送至反应室12的底部。

管线48将旋转阀30连接至注射泵27，使得来自供给部22的液体可以从供给部22计量入注射泵27，然后从注射泵27并通过管线25和分配器头26进入样品杯。虚线15表示当溶剂用于给样品杯10包上夹套时样品杯10和反应室12之间的溶剂的位置。

气体供给部37可以通过管线50和49向顶部空间供给额外的压力，管线50和49连同到达其它几个项的气流由阀32控制。管线51将阀32连接至排气口35。

作为气体压力监测的一部分，管线52将阀32连接至压力计23，压力计23经由连通线53与处理器38电线连接。使用连通线54还将处理器38连接至热电偶44，从而可以使用各种样品萃取用的温度和蒸气压的监控组合来产生有用的标准化的信息。

为了向反应室12的底部和样品杯10提供搅拌气体，气体供给部37也经由适当的管线或管道55连接至阀21。

压力头部密封件46将样品杯密封在反应室中。管线56将溶剂从阀21排出至盘管17，并且收集管57排空盘管17至收集容器20。

该方法的性质使得其可以以一些其它方面展现。在第二方面，步骤包括将萃取溶剂和含有分析物的样品基质放入样品杯中。然后，使样品基质和萃取溶剂在样品杯中搅拌、加热和加压，以将分析物从已加热的样品基质萃取并进入已加热的萃取溶剂中。然后将已加压加热的萃取溶剂萃取物从样品杯排出至大气压下并通过冷却盘管，直到排出的萃取溶剂萃取物接近或达到环境温度。然后收集冷却后的萃取溶剂萃取物用于分析。

在图1中，可以使用阀32和管线49从气体供给部37对样品杯10中的溶剂上方的顶部空间加压。

显然，对于本领域技术人员宽范围的选择是可获得的，并且由于本发明使用与其它方法相同的溶剂和固定相，因此可以进行适当的选择而无需过度的实验。

如果需要第二搅拌步骤，则可以在加热加压步骤之前或同时进行，并且通常使用超声波振动。可选择地(或另外)，可以通过供给对溶剂和分析物惰性的气体来进行搅拌。

如在之前的实施方式中，排出释放溶剂的步骤包括排出盘管中的已加热的释放溶剂，盘管具有当释放溶剂在盘管中时足以将排出的释放溶剂冷却至接近或达到环境温度的长度。此时，含有分析物的释放溶剂处于准备用于在常规设备中的分子分析的温度。

基本上，本发明的方法适用于制备在预期温度和压力下稳定的任何分析物。

在各实施方式中，溶剂可以选自由以下组成的组：水、弱酸、弱碱、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚(“mtbe”)、二氯甲烷、己烷、丙酮、2-丙醇、环己烷、乙腈、甲醇、及其混合物，但不限于该特定的组。

各实施方式可以在加压的加热步骤期间使用超声波二次搅拌步骤。

在各实施方式中，将溶剂萃取物放出至大气压被用于将溶剂萃取物从样品杯驱入冷却盘管。

在各实施方式中，代表性的加热温度为90至180℃，代表性的所得压力为约50至250psi之间。

在另一方面，本发明可以表示为样品杯中的萃取溶剂和含有分析物的样品基质的已加热加压搅拌的混合物。

实验

实施例1-表1：环境应用；从土壤中萃取bna

表1绘制了对比soxhlet(epa3540c)、本发明(实施例1)和加速溶剂萃取(ase；epa3545)的从土壤萃取碱性物、中性物和酸性物(“bna”)的数据。显示的ase的体积和时间取自使用dionex应用笔记317中所述的参数的运行。使用气相色谱法、接着质谱法(gcms；epa8270)进行分析。

相比其它方法，本发明的方法使用明显更少的溶剂并且花费明显更少的时间。特别地，具有超过10个组件和步骤的ase萃取单元的准备通常是耗时乏味的，而本发明仅使用三个简单的部分。平均而言，ase萃取单元的准备花费约15分钟，而本发明在几秒钟内准备就绪。

表2环境应用：从土壤中萃取bna；crm回收数据(％)

表2总结了从waterscorporation(milford，ma01757u.s.a.；era目录号727)获得的有证标准物质(crm)土壤(milford，ma01757u.s.a.；era产品编号727)中bna的百分比数据。如本领域技术人员所理解的，目标是获得存在于crm样品中的已知材料的100％回收率。对于每种方法，所有的回收率都在质量控制性能验收限度内，但本发明(实施例1)回收了所有39种分析物，而ase仅回收了38种却未能鉴别2-甲基萘。因此，本发明在回收的分析物和分析物的回收百分比方面具有最好的总体性能。

图2是基于实施例1的bnacmr萃取的示例性全扫描色谱图。

图3是根据本发明的实施例1萃取与ase萃取比较的覆盖图。每个较高的峰表示在回收方面显著优于ase的实施例1萃取。另外，在保留时间10.36(2-甲基萘)处没有ase峰，这表明ase没有鉴别出该分析物。

实施例2-表3：从聚乙烯中萃取邻苯二甲酸酯

表3是soxhlet、本发明(实施例2)和ase之间的从聚乙烯中萃取邻苯二甲酸酯的比较图表。ase的体积和时间来自使用dionex出版物(knowles，d；dorich，b；carlson，r；murphy，b；francis，e；peterson，j，richter，b.“extractionofphthalatesfromsolidliquidmatrices”，dionexcorporation，2011)中所述的参数的运行，和所有方法均基于cpsc-ch-c1001-09.1(consumerproductssafetycommission,testmethod:cpsc-ch-c1001-09.3standardoperatingprocedurefordeterminationofphthalates；http://www.cpsc.gov/about/cpsia/cpsc-ch-c1001-09.3.pdf)。

再次，相比其它方法，本发明的方法(实施例2)使用明显更少的溶剂并且花费明显更少的时间。

实施例2-表4crm回收数据(％)

表4比较了在crm样品(spexcertiprepcrm-pe001；metuchen，nj08840，usa)中从聚乙烯中萃取邻苯二甲酸酯的以百分比计的回收数据。在该实验中，在加热之前，在鼓泡和超声处理二者经30秒的情况下进行搅拌。再次，本发明(实施例2)的回收数据显著优于ase，并且在使用搅拌的情况下显示出改进。实施例2的搅拌下的结果与被认为是萃取的“黄金标准”的soxhlet数据相匹配。对于所有方法，crm中的所有分析物均被回收。

图4是使用本发明的实施例2聚乙烯crm萃取的样品全扫描色谱图。

在附图和说明书中，已经阐述了本发明的优选实施方式，并且虽然已采用了特定术语，但它们仅以通用和描述性的意义而不是出于限制的目的使用，本发明的范围由权利要求限定。